浙江大学学报（农业与生命科学版）

浙江大学学报（农业与生命科学版）, 2023, 49(6): 873-880 doi: 10.3785/j.issn.1008-9209.2022.11.071

动物科学与动物医学

不同原核表达载体对非洲猪瘟病毒CD2v蛋白可溶性表达及免疫反应性比较

冯梦珂,,1,2, 王星博1,2, 林璐璐1,2, 崔明仙1,2, 颜焰1,2, 周继勇,,1,2

1.浙江大学动物医学中心，浙江 杭州 310058

2.农业农村部动物病毒学重点实验室，浙江 杭州 310058

Comparisons on soluble expression and immunoreactivity of African swine fever virus CD2v protein expressed by different prokaryotic expression vectors

FENG Mengke,,1,2, WANG Xingbo1,2, LIN Lulu1,2, CUI Mingxian1,2, YAN Yan1,2, ZHOU Jiyong,,1,2

1.Center for Veterinary Sciences, Zhejiang University, Hangzhou 310058, Zhejiang, China

2.Key Laboratory of Animal Virology of Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Hangzhou 310058, Zhejiang, China

通讯作者: 周继勇（https://orcid.org/0000-0001-8948-8249），E-mail：jyzhou@zju.edu.cn

收稿日期: 2022-11-07   接受日期: 2023-01-10  

基金资助: 国家自然科学基金区域创新发展联合基金项目.  U21A20256
浙江省重点研发计划项目.  2020C02013

Received: 2022-11-07   Accepted: 2023-01-10  

作者简介 About authors

冯梦珂（https://orcid.org/0000-0002-5338-8403），E-mail：mengkefeng@zju.edu.cn , E-mail：mengkefeng@zju.edu.cn

摘要

本研究旨在系统性地探究不同原核表达载体对非洲猪瘟病毒CD2v蛋白的可溶性表达差别，并利用临床非洲猪瘟病毒抗体阳性血清比较包涵体和可溶性CD2v蛋白的免疫反应性。利用5种原核表达载体pCold-TF、pET28a、pMAL-C6T、pGEX-4T-1、pET32a分别表达去除信号肽和跨膜区的非洲猪瘟病毒CD2v蛋白，利用镍-氨三乙酸（nickel-nitrilotriacetic acid, Ni-NTA）亲和层析法分别纯化源自pET28a和pCold-TF表达载体的包涵体和可溶性CD2v蛋白，并用间接酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA）方法比较纯化蛋白的免疫反应性。结果显示，pCold-TF载体以表达可溶性蛋白为主，pMAL-C6T载体同时表达包涵体和可溶性蛋白，而其他载体主要表达包涵体蛋白。临床非洲猪瘟病毒抗体阳性血清检测数据显示，可溶性蛋白的免疫反应性显著优于包涵体蛋白（P＜0.05）。pCold-TF载体的触发因子（trigger factor, TF）标签可促进CD2v蛋白的可溶性表达，其表达蛋白的免疫反应性优于包涵体蛋白。本研究结果为CD2v蛋白的免疫原性研究奠定了基础，亦为其他重要抗原的可溶性表达提供了思路。

关键词： 非洲猪瘟病毒 ; CD2v蛋白 ; 原核表达 ; 可溶性表达 ; 免疫反应性

Abstract

The aim of this study was to systematically investigate the differences in the soluble expression level of the African swine fever virus (ASFV) CD2v protein by different prokaryotic expression vectors, and the immunoreactivities of the inclusion body and soluble CD2v proteins were compared using clinical anti-ASFV antibody-positive sera. Five prokaryotic expression vectors, namely, pCold-TF, pET28a, pMAL-C6T, pGEX-4T-1 and pET32a, were utilized to express the CD2v protein without the signal peptide and transmembrane region, respectively. The inclusion body CD2v protein expressed by the pET28a vector and the soluble CD2v protein expressed by the pCold-TF vector were purified by nickel-nitrilotriacetic acid (Ni-NTA) affinity chromatography, and the immunoreactivity of the purified proteins was detected by indirect enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). The results showed that the CD2v protein expressed by the pCold-TF vector was soluble mainly, while the CD2v protein expressed by the pMAL-C6T vector was insoluble (inclusion body) and soluble, and the CD2v protein expressed by the other vectors was mainly as inclusion body. The indirect ELISA results for clinical anti-ASFV antibody-positive sera showed that the immunoreactivity of soluble protein was significantly better than that of the inclusion body protein (P＜0.05). The trigger factor (TF) tag of pCold-TF promoted the soluble expression of the CD2v protein, and the immunoreactivity of the expressed protein was greater than that of the inclusion body protein. This study lays the foundation for further immunogenicity research on the CD2v protein and provides a candidate strategy for the soluble expression of other important antigens.

Keywords： African swine fever virus ; CD2v protein ; prokaryotic expression ; soluble expression ; immunoreactivity

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本文引用格式

冯梦珂, 王星博, 林璐璐, 崔明仙, 颜焰, 周继勇. 不同原核表达载体对非洲猪瘟病毒CD2v蛋白可溶性表达及免疫反应性比较. 浙江大学学报（农业与生命科学版）[J]. 2023, 49(6): 873-880 doi:10.3785/j.issn.1008-9209.2022.11.071

FENG Mengke, WANG Xingbo, LIN Lulu, CUI Mingxian, YAN Yan, ZHOU Jiyong. Comparisons on soluble expression and immunoreactivity of African swine fever virus CD2v protein expressed by different prokaryotic expression vectors. Journal of Zhejiang University （Agriculture & Life Sciences）[J]. 2023, 49(6): 873-880 doi:10.3785/j.issn.1008-9209.2022.11.071

非洲猪瘟（African swine fever, ASF）是由非洲猪瘟病毒（African swine fever virus, ASFV）引起的一种猪急性、出血性、烈性传染病，死亡率极高[1]。自20世纪20年代首次在肯尼亚被发现以来，ASF先后在非洲和亚欧大陆迅速传播，2018年8月我国辽宁省沈阳市报道首例ASF疫情，随后ASF在全国范围内大规模暴发流行[2]。由于缺乏有效的治疗手段和安全的疫苗，ASF对动物健康、食品安全、国民经济乃至生态环境都构成了持续的威胁[3]。

ASFV基因组由一个170～190 kb的双链DNA分子组成，病毒粒子呈现对称的二十面体结构，成熟病毒粒子包含多达68种结构蛋白和100多种非结构蛋白，其中结构蛋白对病毒感染研究及疫苗、诊断试剂研制的意义重大[4]。病毒粒子自外而内包括外囊膜、衣壳、内膜、核衣壳和基因组5个部分[5]，外囊膜由EP402R基因编码的CD2v蛋白组成。CD2v是一种与T淋巴细胞表面黏附受体CD2相似的蛋白，由信号肽（1～16个氨基酸）、胞外区（17～207个氨基酸）、跨膜区（208～228个氨基酸）和胞内区（229～375个氨基酸）4部分组成[6]，CD2v参与ASFV宿主免疫应答、免疫逃逸和病毒复制等生理生化过程，是病毒诊断和疫苗研发的重要靶点蛋白[7]。用杆状病毒表达的CD2v蛋白免疫可保护猪免于致死性感染[8]，而且用CD2v蛋白免疫还可诱导猪产生特异性T细胞免疫反应[9]。

真核细胞和原核细胞均可用于外源基因的表达。真核表达系统表达的重组蛋白在结构和功能上更接近天然蛋白[10]。已有研究利用昆虫杆状病毒及CHO等真核表达系统对CD2v蛋白进行表达[11-13]，其纯化蛋白能与临床ASFV抗体阳性血清反应。大肠埃希菌原核表达系统具有操作简单方便、表达周期短且成本低、蛋白表达水平高等优点，缺点在于所表达蛋白大多为包涵体，无法形成正确的三维结构，往往无生物学活性[14-16]。多个研究小组尝试利用原核表达系统来表达CD2v蛋白，但表达蛋白主要以包涵体形式存在[17-20]，对包涵体进行溶解及镍柱亲和层析后，CD2v纯化蛋白与ASFV抗体阳性血清的免疫反应性较差[19]；而纯化的CD2v可溶性蛋白能够被ASFV抗体阳性血清识别，具有良好的反应原性[18]；蛋白质印迹法分析结果表明，表达的可溶性CD2v胞外区蛋白与ASFV抗体阳性血清具有良好的免疫反应性[17]。

综上所述，原核表达系统主要以包涵体形式表达CD2v蛋白，包涵体蛋白的免疫反应性较差且纯化、复性难度较大，不利于蛋白的功能研究及应用。因此，把CD2v蛋白与适宜的标签蛋白进行融合表达，筛选促进蛋白可溶性表达的载体，对CD2v蛋白的可溶性表达具有重要意义[21]。本研究基于5种不同的原核表达载体，筛选能促进CD2v蛋白可溶性表达的最佳表达载体，通过临床ASFV抗体阳性血清检测并比较可溶性CD2v蛋白和包涵体CD2v蛋白的免疫反应性，为原核表达可溶性CD2v蛋白及探究其免疫原性奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

高保真酶（货号P510-01）购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司；异丙基硫代-β-D-半乳糖苷[isopropylthio-β-D-galactoside（IPTG），货号15529019]、DNA标志物（货号01112376）购自赛默飞世尔科技（中国）有限公司；聚合酶链反应（polymerase chain reaction, PCR）产物清洁回收试剂盒（货号2101050）、DNA凝胶回收试剂盒（货号2003050）购自杭州新景生物试剂开发有限公司；DH5α和BL21（DE3）大肠埃希菌感受态细胞由本实验室制备；原核表达载体pET-28a、pET32a、pGEX-4T-1、pMAL-C6T和pCold-TF由本实验室保存；二辛可酸（bicinchoninic acid, BCA）蛋白浓度测定试剂盒（货号C503021-0500）购自生工生物工程（上海）股份有限公司；镍-氨三乙酸（nickel-nitrilotriacetic acid, Ni-NTA）琼脂糖（货号30210）购自德国QIAGEN公司；辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase, HRP）标记的羊抗鼠IgG（货号074-1806）、HRP标记的羊抗猪IgG（货号14-14-06）购自美国KPL公司；质粒小提试剂盒（货号DP103-02）购自天根生化科技（北京）有限公司；其他生化试剂均为国产分析纯。临床ASFV抗体阳性血清（病毒被灭活）和标准阴性血清由本实验室保存。

1.2 方法

1.2.1 原核表达质粒的构建与鉴定

根据GenBank数据库中公布的非洲猪瘟病毒HLJ-2018株（登录号MK333180.1）的序列信息，由杭州尚亚科技有限公司合成去除信号肽和跨膜区的非洲猪瘟病毒CD2v蛋白（CD2vΔSP-TM）序列。将序列插入原核表达载体pET-28a，构建原核表达质粒pET28a-CD2vΔSP-TM。根据不同的原核表达载体设计引物，以pET28a-CD2vΔSP-TM原核表达质粒为模板，通过PCR扩增CD2v序列后，将目的片段分别插入pCold-TF、pMAL-C6T、pGEX-4T-1和pET-32a原核表达载体，得到原核表达质粒pCold-TF-CD2vΔSP-TM、pMAL-C6T-CD2vΔSP-TM、pGEX-4T-1-CD2vΔSP-TM和pET32a-CD2vΔSP-TM。将上述原核表达质粒转化至DH5α大肠埃希菌感受态细胞中，涂板并挑选单克隆菌落，将PCR鉴定为阳性的菌液送至杭州尚亚科技有限公司进行测序，对测序正确的阳性菌液进行质粒抽提，用于后续原核表达实验。

1.2.2 CD2v蛋白的原核表达与鉴定

将鉴定正确的质粒转化至BL21（DE3）大肠埃希菌感受态细胞中，涂板培养后，挑取单克隆菌落接种至LB培养基中，于37 ℃活化，将活化后的菌液按照体积比1∶100转接至含抗生素（100 μg/mL）的LB液体培养基中，于37 ℃、200 r/min条件下培养约4 h，待菌液在600 nm处的吸光度值达0.6时，向菌液中加入终浓度为1.0 mmol/L的IPTG，于16 ℃、120 r/min条件下培养16 h，诱导结束后离心收集菌液，在冰浴条件下超声破碎，离心后分别吸取上清液并保留沉淀，制备样品，经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE）后，用考马斯亮蓝R250进行染色，以检测重组蛋白的表达情况及存在形式。各载体标签及CD2v重组蛋白分子量如表1所示。

表1   不同原核表达载体标签及重组蛋白分子量

Table 1  Different prokaryotic expression vector tags and molecular weights of recombinant proteins

表达载体

Expression vector

标签

Tag

重组蛋白分子量

Molecular weight of

recombinant protein/kDa

pET28aHis42
pET32aTrx62
pGEX-4T-1GST65
pMAL-C6TMBP87
pCold-TFTF85

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1.2.3 CD2v蛋白的纯化与鉴定

离心收集经低温诱导后的pCold-TF-CD2vΔSP-TM菌体沉淀，用磷酸盐缓冲液（phosphate buffer solution, PBS）重悬后，在冰浴条件下超声破碎，离心收集上清液。将上清液与Ni-NTA琼脂糖混合，以4 ℃低温翻转孵育4 h，随后用20 mmol/L咪唑去除杂蛋白，用50 mmol/L咪唑洗脱CD2v-TF重组蛋白。同样，离心收集经低温诱导后的pET28a-CD2vΔSP-TM菌体沉淀，用尿素溶液（8 mol/L尿素，20 mmol/L NaH2PO4·2H2O，300 mmol/L NaCl，pH 8.0）重悬后，在冰浴条件下超声破碎，离心收集上清液。将上清液与Ni-NTA琼脂糖混合，以4 ℃低温翻转孵育4 h，随后用缓冲液A（8 mol/L尿素，20 mmol/L NaH2PO4·2H2O，300 mmol/L NaCl，10 mmol/L咪唑，pH 8.0）、缓冲液B（8 mol/L尿素，20 mmol/L NaH2PO4·2H2O，300 mmol/L NaCl，10 mmol/L咪唑，pH 6.3）、缓冲液C（8 mol/L尿素，20 mmol/L NaH2PO4·2H2O，300 mmol/L NaCl，pH 5.9）依次去除杂蛋白，用缓冲液D（8 mol/L尿素，20 mmol/L NaH2PO4·2H2O，300 mmol/L NaCl，pH 4.5）洗脱CD2v-His重组蛋白。收集每次被洗脱的样品，用BCA法测定CD2v-TF和CD2v-His重组蛋白浓度，并将这2种重组蛋白保存于－40 ℃冰箱中。

纯化蛋白通过考马斯亮蓝R250染色和蛋白质印迹法（Western blotting）进行鉴定。在蛋白质印迹法中，将经过SDS-PAGE后的纯化蛋白分别转印至硝酸纤维素膜上，用5%脱脂奶粉封闭1 h（37 ℃），加入按体积比1∶1 000稀释的多聚组氨酸标签（His-Tag）的鼠源单抗作为一抗，37 ℃孵育1 h后，用含吐温-20的磷酸盐缓冲液（phosphate buffer solution with Tween-20, PBST）洗涤3次，每次5 min，然后加入按体积比1∶5 000稀释的HRP标记的羊抗鼠二抗，37 ℃孵育1 h，用PBST洗涤后，利用增强型化学发光（enhanced chemiluminescence, ECL）试剂进行显色。

1.2.4 2种CD2v重组蛋白的免疫反应性比较

采用间接酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA）方法比较2种CD2v重组蛋白的免疫反应性。将纯化后的2种CD2v重组蛋白用0.05 mmol/L PBS（pH 9.6）稀释至2 μg/mL，然后以100 μL/孔包被96孔酶标板，每块96孔酶标板于4 ℃过夜包被12 h，弃包被液，用200 μL/孔PBST清洗3次后，每孔加入200 μL 5%脱脂奶粉，37 ℃封闭1 h，然后用200 μL/孔PBST重复清洗3次。临床ASFV抗体阳性血清（n=5）和标准阴性血清（n=5）分别用5%脱脂奶粉按体积比1∶200、1∶400、1∶800、1∶1 600、1∶3 200、1∶6 400、1∶12 800、1∶25 600稀释后，每孔加入100 μL稀释后的溶液，37 ℃孵育1 h，每个稀释度设3个重复。用PBST洗涤3次后，按100 μL/孔加入经1∶2 000稀释的HRP标记的羊抗猪IgG，37 ℃孵育45 min，再用PBST洗涤3次后，每孔加入100 μL 3，3´，5，5´-四甲基联苯胺（3, 3´, 5, 5´-tetramethylbenzidine, TMB）显色液，37 ℃避光显色10 min后，每孔立即加入50 μL 2 mol/L H2SO4，终止显色。用酶标仪测定每孔在450 nm波长处的吸光度值，采用配对样本t检验分析相同稀释度下2种蛋白的免疫反应性差异。

2 结果与分析

2.1 原核表达质粒的构建与鉴定结果

以合成CD2v基因的质粒为模板，通过PCR扩增得到去除信号肽和跨膜区的CD2v序列片段，将其分别构建到pET-28a、pET32a、pGEX-4T-1、pMAL-C6T、pCold-TF 5个原核表达载体中，获得原核表达质粒，然后将这些质粒转化到DH5α大肠埃希菌感受态细胞中，经过对应抗性的LB平板筛选，挑取单克隆菌落接种于对应抗性的LB液体培养基中进行培养。以特异性引物（上游引物CD2v-F，5´-ATTGATTATTGGGTTAGTTTTAATAAAA-3´；下游引物CD2v-R，5´-TTAAATAATTCTATCTACATGAATAAGCGA-3´）对菌液进行PCR鉴定。结果（图1）表明，在969 bp长度附近出现目的条带。通过核酸测序确定CD2v基因序列、插入位置及开放阅读框都正确后，抽提质粒进行后续原核表达实验。

图1

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图1   重组质粒的PCR鉴定结果

M：DNA分子标志物；1～5：pET-28a-CD2vΔSP-TM、pET32a-CD2vΔSP-TM、pGEX-4T-1-CD2vΔSP-TM、pMAL-C6T-CD2vΔSP-TM和pCold-TF-CD2vΔSP-TM重组质粒的PCR扩增产物；6：阴性对照。

Fig. 1   PCR identification results of recombinant plasmids

M: DNA marker; 1-5: Amplification products of pET-28a-CD2vΔSP-TM, pET32a-CD2vΔSP-TM, pGEX-4T-1-CD2vΔSP-TM, pMAL-C6T-CD2vΔSP-TM and pCold-TF-CD2vΔSP-TM recombinant plasmids, respectively; 6: Negative control.


2.2 CD2v蛋白的原核表达与鉴定结果

将鉴定正确的原核表达质粒转化至BL21（DE3）大肠埃希菌感受态细胞中，经IPTG诱导后，通过SDS-PAGE和考马斯亮蓝R250染色确定不同重组蛋白的表达形式。结果（图2）表明：pET28a-CD2vΔSP-TM重组质粒（图2A）和pGEX-4T-1-CD2vΔSP-TM重组质粒（图2C）主要表达包涵体蛋白；pET32a-CD2vΔSP-TM重组质粒（图2B）未表达CD2v重组蛋白；pMAL-C6T-CD2vΔSP-TM重组质粒（图2D）同时表达包涵体和可溶性蛋白，其中以包涵体蛋白居多；pCold-TF-CD2vΔSP-TM重组质粒（图2E）以表达可溶性蛋白为主。

图2

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图2   5种不同原核表达载体对CD2v重组蛋白表达的SDS-PAGE分析

A～E.分别为pET-28a-CD2vΔSP-TM、pET32a-CD2vΔSP-TM、pGEX-4T-1-CD2vΔSP-TM、pMAL-C6T-CD2vΔSP-TM、pCold-TF-CD2vΔSP-TM重组质粒。M：蛋白质相对分子质量；1：未诱导菌体；2：诱导后菌体；3：诱导后菌体超声裂解上清液；4：诱导后菌体超声裂解沉淀。

Fig. 2   SDS-PAGE analysis of CD2v recombinant protein expression by five different prokaryotic expression vectors

A-E. pET28a-CD2vΔSP-TM, pET32a-CD2vΔSP-TM, pGEX-4T-1-CD2vΔSP-TM, pMAL-C6T-CD2vΔSP-TM and pCold-TF-CD2vΔSP-TM recombinant plasmids, respectively. M: Relative molecular weight of protein; 1: Uninduced bacteria; 2: Induced bacteria; 3: Bacterial supernatant by ultrasonic lysis after induction; 4: Bacterial precipitation by ultrasonic lysis after induction.


2.3 CD2v蛋白的纯化与鉴定结果

将低温诱导表达的CD2v-TF、CD2v-His重组蛋白通过超声破碎、镍柱亲和层析及洗脱等过程进行纯化，并用SDS-PAGE和蛋白质印迹法验证其纯化情况。结果表明，在预期的85 kDa附近有CD2v-TF重组蛋白阳性条带（图3），在预期的42 kDa附近有CD2v-His重组蛋白阳性条带（图4）。

图3

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图3   CD2v-TF重组蛋白纯化结果

A. SDS-PAGE分析；B.蛋白质印迹法分析。M：蛋白质相对分子质量；1～3：用20 mmol/L咪唑洗脱的杂蛋白；4～6：用50 mmol/L咪唑洗脱的目的蛋白CD2v-TF；7：纯化的目的蛋白CD2v-TF；8：诱导后菌体；9：未诱导菌体（对照）。

Fig. 3   Purification results of CD2v-TF recombinant protein

A. SDS-PAGE analysis; B. Western blotting analysis. M: Relative molecular weight of protein; 1-3: Heterologous proteins eluted with 20 mmol/L imidazole; 4-6: Target protein CD2v-TF eluted with 50 mmol/L imidazole; 7: Purified target protein CD2v-TF; 8: Induced bacteria; 9: Uninduced bacteria (control).


图4

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图4   CD2v-His重组蛋白纯化结果

A. SDS-PAGE分析；B.蛋白质印迹法分析。M：蛋白质相对分子质量；1、7：未诱导菌体（对照）；2、6：诱导后菌体；3：洗脱的杂蛋白；4：洗脱的目的蛋白CD2v-His；5：纯化的目的蛋白CD2v-His。

Fig. 4   Purification results of CD2v-His recombinant protein

A. SDS-PAGE analysis; B. Western blotting analysis. M: Relative molecular weight of protein; 1, 7: Uninduced bacteria (control); 2, 6: Induced bacteria; 3: Eluted heterologous protein; 4: Eluted target protein CD2v-His; 5: Purified target protein CD2v-His.


2.4 2种CD2v重组蛋白的免疫反应性比较分析

利用间接ELISA方法检测（图5）显示，随着抗体浓度降低，抗原抗体免疫反应性呈现下降趋势。采用配对样本t检验分析在相同稀释度下2种蛋白的免疫反应性差异，以在450 nm波长处的吸光度值表示。结果（图5）表明，在体积比1∶200和1∶400稀释度下，ASFV抗体阳性血清与CD2v-TF重组蛋白的免疫反应性显著高于与CD2v-His重组蛋白的免疫反应性（P＜0.05）。

图5

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图5   利用间接ELISA方法检测2种CD2v重组蛋白的免疫反应性

*表示与CD2v-His重组蛋白组相比在P＜0.05水平差异有统计学意义；n=3。

Fig. 5   Immunoreactivity of two CD2v recombinant proteins detected by indirect ELISA

Single asterisk (*) indicates significant differences compared with the CD2v-His recombinant protein group at the 0.05 probability level, and n=3.


3 讨论

ASF对生猪养殖行业造成了严重的经济损失，由于尚无有效的疫苗和药物进行预防或治疗，目前只能依靠严格的生物安全措施进行防控[22]。CD2v是第一个被证实对ASFV致死性攻击具有保护作用的ASFV蛋白，已成为DNA疫苗、病毒载体疫苗等研究的重要靶点，在ASFV疫苗研发中具有重大潜力[23-25]。

大肠埃希菌原核表达系统具有操作简单方便、表达量高、周期短、成本低等优点，但其表达的CD2v蛋白多以包涵体的形式存在，经尿素溶解后，蛋白空间结构被破坏而呈变性状态，空间表位丢失，导致免疫原性较差[11,26-27]，影响了其在低成本疫苗研制中的应用。本研究系统比较了5种原核表达载体不同重组标签对CD2v蛋白可溶性表达的影响。结果表明：作为被广泛应用的pET表达系统中的2个代表性载体，pET28a和pET32a均未能促进CD2v的可溶性表达；pGEX-4T-1载体虽然具有促进蛋白可溶性表达的谷胱甘肽-S-转移酶（glutathione S-transferase, GST）标签[28]，但其仍表达以包涵体形式为主的CD2v重组蛋白；pMAL-C6T载体具有麦芽糖结合蛋白（maltose binding protein, MBP）标签，该标签不仅能提高重组蛋白表达量，而且能减少蛋白降解并促进其可溶性表达[29]，在本研究中该标签虽然可提高CD2v蛋白的可溶性表达，但在非变性亲和纯化过程中杂蛋白较多，影响了CD2v蛋白的纯度；而pCold-TF载体表达的CD2v重组蛋白均以可溶性的方式存在，且可纯化获得纯度较高的可溶性重组蛋白。pCold-TF是一种冷休克载体，带有触发因子（trigger factor, TF）标签，而TF是原核细胞中与核糖体相关的分子伴侣蛋白，可促进多肽进行共翻译折叠表达，并通过提高蛋白的正确折叠来促进可溶性表达[30]。

4 结论

本研究构建了5种原核表达重组质粒，比较了CD2v蛋白的可溶性表达情况，并利用临床ASFV抗体阳性血清比较了在可溶性和包涵体形式下CD2v蛋白的免疫反应性。结果表明，TF标签可有效促进CD2v蛋白的可溶性表达，且可溶性CD2v蛋白的免疫反应性显著高于包涵体蛋白，表明蛋白的可溶性表达可能在空间表位层面影响蛋白的免疫反应性。因此，选择合适的表达载体是CD2v蛋白在原核表达系统中实现正确折叠和可溶性表达的一种有效策略。本研究为ASFV CD2v蛋白的可溶性表达提供了参考载体，为CD2v蛋白功能与免疫原性研究及亚单位疫苗研制奠定了基础。

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