循环肿瘤DNA（ctDNA）是一种无细胞状态的胞外DNA，存在于外周血、滑膜液、脑脊液等体液中，亦称血浆DNA或血清DNA，由单链DNA或双链DNA以及单链或双链DNA混合组成，以DNA蛋白质复合物或游离DNA两种形式存在。早在1947年 Mandel等就发现了循环DNA的存在，1977年Leon等人的研究表明肿瘤患者外周血清的DNA水平大大高于正常人。正常人循环血中少量游离DNA主要来源于细胞核DNA和线粒体DNA，常小于10ng/ml。而肿瘤患者循环DNA主要来自肿瘤细胞，其血浆DNA浓度平均可达180ng/ml，其来源及发生机制有多种假说：（1）肿瘤细胞不断释放DNA进入血液循环；（2）循环中肿瘤细胞或转移灶的裂解；（3）肿瘤细胞或凋亡后释放DNA入血；（4）肿瘤细胞侵袭周围正常细胞、组织变性而释放入血；（5）淋巴细胞和肿瘤细胞相互作用时，亦能释放一定量的DNA。
目前，循环DNA量和性质的改变与肿瘤相关分析是目前的一个研究热点，尤其对于实体瘤来说，检测ctDNA具有无创性、可重复性监测肿瘤的优点，且大量一期和二期临床研究数据已证明ctDNA在临床肿瘤的早期诊断、疗效观察、预后评估及转移风险分析等具有巨大的应用价值。但由于缺乏高灵敏性和高特异性的实验方法，限制了其在临床的应用。
最近来自Stanford大学的研究者们研究出一种经济的且具有高敏感性的定量检测ctDNA方法——CAPP-Seq法（cancer personalized profiling by deep sequencing，肿瘤个体化分析深度测序法）。研究者以非小细胞肺癌（NSCLC）为例向我们展示了CAPP-Seq法的科学性及优越性。在NSCLC的以往研究中，基于PCR的方法检测血浆ctDNA的常见突变基因如K-RAS、EGFR等，但大多数患者缺乏这些基因的突变。最近，有研究者采用大规模平行测序方法检测NSCLC血浆中的ctDNA，然而其敏感度低、检测成本高以及对患者选择性强，只适用于少数的患者。CAPP-Seq法就是在肿瘤基因突变数据库（COSMIC）来源寻找复发突变相关的外显子，再从肿瘤基因图谱库的407位NSCLC患者全基因组测序结果筛选。由于部分NSCLC有ALK、ROS1、RET相关的重排，也将这些基因中复发突变的外显子或内含子也包含在内。最后应用一种最大化迭代算法设计出NSCLC ctDNA的“筛选器”(selector)，其能识别139个复发突变基因中的521个外显子及12个内含子，长度约为125kb，平均能够识别4个单核苷酸突变，经过方法优化并以新一代测序法（NGS）测序后，在96%的NSCLC患者中有效，得到满意的检测效果。研究者们在不同时期的NSCLC中对CAPP-Seq可行性进行了验证，发现I期NSCLC患者的诊断敏感性为50%，II-IV期NSCLC患者的诊断敏感性达100%，而且各期肺癌患者的诊断特异性均在96%以上。研究者进一步探究后发现，即使ctDNA比例低至0.02%时也能检测到，用CAPP-Seq测定的ctDNA水平与肿瘤体积（用CT和PET评估测定）之间存在显著相关性（P=0.0002，R2=0.89）。对10例样本（7例阳性和3例阴性）进行了肿瘤标本侵入性的活检和血液标本非侵入性的CAPP-Seq检测，结果发现CAPP-Seq检测效能并不低于肿瘤活检，并能准确测定肺癌的基因型。ctDNA水平随着患者疾病进展和治疗后转归也会发生相应变化。
CAPP-Seq法克服了现有ctDNA领域的障碍，首先这一技术非常的敏感，可从血液1万个正常DNA分子中检测到一个肿瘤DNA分子; 其次，其不仅可应用于NSCLC，更可用在携带不同肿瘤基因型的各种实体瘤；再次，检测成本更低，适于临床应用等。或许有一天，应用CAPP-Seq技术临床医生可以快速、非侵袭性地诊断并监测实体肿瘤，筛查健康和高危患者，观察患者的治疗反应，以及肿瘤随时间推移发生的演变。
（尤良顺 钱文斌）