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浙江大学学报(农业与生命科学版). 2023 (5): 591-754.
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中国小麦花叶病毒富含半胱氨酸蛋白多克隆抗体的制备与应用
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戴远兴,郭留明,何婧,沈峥嵘,耿艳飞,吕明芳,袁正杰,李静,张恒木
浙江大学学报(农业与生命科学版). 2023 (5): 677-686.
DOI: 10.3785/j.issn.1008-9209.2023.02.011
中国小麦花叶病毒(Chinese wheat mosaic virus, CWMV)是小麦花叶病的重要病原体之一,长期威胁小麦的产量和品质;CWMV富含半胱氨酸蛋白(cysteine-rich protein, CRP)在病毒侵染过程中具有重要而复杂的功能。为了深入研究CRP的功能和CWMV侵染机制,本研究采用反转录聚合酶链反应(reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR)从CWMV侵染的小麦叶片中获得CRP基因编码区,将其克隆至原核表达载体pET-32a上,并将重组质粒pET-CRP转化至大肠埃希菌BL21(DE3)感受态细胞中进行诱导表达;通过镍柱亲和层析法纯化CRP重组蛋白,并用作抗原免疫新西兰白兔,制备多克隆抗体。蛋白质印迹法、间接酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)和斑点ELISA分析结果显示:纯化的CRP抗体不仅具有高度的特异性,而且效价高达1∶4 096 000,是未纯化抗体效价的4倍;该抗体能识别0.5 ng抗原,显示出较高的灵敏度;在1∶120 000稀释条件下,该抗体能特异且灵敏地识别天然CRP。综上所述,本研究所制备的CRP抗体不但可用于田间CWMV病株样品的精准诊断,还可用于植物体内瞬时表达CRP的检测分析,为后续CRP检测、定量分析及其亚细胞定位等研究提供了依据。
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利用长链非编码RNAs与mRNAs联合分析半番鸭及番鸭胚胎期性腺发育差异
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李丽,章琳俐,辛清武,缪中纬,朱志明,邱君志,郝晓娜,黄勤楼,郑嫩珠
浙江大学学报(农业与生命科学版). 2023 (5): 729-743.
DOI: 10.3785/j.issn.1008-9209.2022.07.071
本研究旨在筛选影响鸭胚胎期性腺发育的关键mRNAs和长链非编码RNAs(long non-coding RNAs, lncRNAs),科学解释半番鸭性腺发育缺陷问题。采集半番鸭(BF1、BF2、BF3)和番鸭(F1、F2、F3)各3个雄性胚胎性腺组织并提取其RNA,通过高通量测序筛选差异基因和lncRNAs,预测靶基因并进行功能注释,最后应用实时荧光定量聚合酶链反应(real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction, qRT-PCR)对测序结果进行验证。结果显示:从半番鸭和番鸭性腺组织中共筛选出1 109个差异基因;相对于番鸭,半番鸭中上调表达基因共857个,下调表达基因共252个,其中,醛酮还原酶家族1成员D1基因(aldo-keto reductase family 1 member D1 gene, AKR1D1)、17β-羟基类固醇脱氢酶3基因(17β-hydroxysteroid dehydrogenase 3 gene, 17β-HSD3)和胆固醇侧链裂解酶基因(cholesterol side-chain cleavage enzyme gene, P450scc)等可能与半番鸭性腺分化发育相关。同时,获得了733个显著差异表达的lncRNAs;相对于番鸭,半番鸭中显著上调的lncRNAs共660个,显著下调的lncRNAs共73个。靶基因预测分析显示,136个下调的lncRNAs和893个上调的lncRNAs可能参与差异基因表达并存在潜在的调控关系,其中,TCONS_00246198靶向17β-HSD3,TCONS_00229529靶向四次穿膜蛋白2基因(tetraspanin-2 gene, TSPAN2),说明以上lncRNAs可能通过靶向关键基因来参与鸭胚胎期性腺发育。qRT-PCR结果显示,差异基因和lncRNAs表达水平与转录组测序中的表达趋势一致,表明通过高通量测序获得的数据较为可靠。RNA结合蛋白免疫沉淀(RNA binding protein immunoprecipitation, RIP)试验结果发现,与IgG相比,TCONS_00246198富集水平达71.51倍,表明TCONS_00246198与17β-HSD3蛋白存在直接或间接的相互作用,即两者可能存在靶向关系。综上所述,本研究获得了一批可能影响鸭胚胎期性腺发育的关键mRNAs和lncRNAs,推测差异lncRNAs可以调控差异基因的表达,为了解鸭胚胎期性腺发育差异及禽类性腺发育机制提供了科学依据。
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猫冠状病毒非结构蛋白3的多克隆抗体制备及亚细胞定位
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王子仪,金子安,卢辰赫,乔治,王圣文,颜焰,周继勇,郑肖娟
浙江大学学报(农业与生命科学版). 2023 (5): 744-754.
DOI: 10.3785/j.issn.1008-9209.2022.08.011
冠状病毒的非结构蛋白3(non-structural protein 3, Nsp3)是复制/转录复合体的组成部分,也是重要的潜在抗病毒靶标之一。本研究在对Nsp3进行跨膜区、信号肽和抗原表位预测的基础上,通过聚合酶链反应扩增Ⅱ型猫冠状病毒(feline coronavirus, FCoV)代表毒株(WSU 79-1683)Nsp3蛋白中抗原性较好的区段(第50—550位氨基酸),随后将其亚克隆到pCOLD-TF原核表达载体上。在低温条件下,经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷诱导,成功表达分子量约为130 kDa的His-Nsp3重组融合蛋白。在非变性条件下,采用镍柱亲和层析获得了纯度较高的目的重组蛋白。以纯化的重组蛋白为抗原免疫BALB/c小鼠,制备Nsp3多克隆抗血清(多抗血清),蛋白质印迹法(Western blotting, WB)和间接免疫荧光试验(indirect immunofluorescence assay, IFA)结果显示,Nsp3多抗血清能特异性识别FCoV感染细胞中的Nsp3蛋白。采用免疫荧光双标法结合激光共聚焦显微镜对FCoV感染细胞中Nsp3蛋白的亚细胞定位进行分析,结果发现,FCoV感染细胞中Nsp3发生聚集现象,并与内质网存在共定位现象。Nsp3蛋白的特异性抗体制备以及亚细胞定位研究为进一步开展Nsp3蛋白的生物学功能分析奠定了基础。
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