浙江大学学报(工学版)

浙江大学学报(工学版), 2019, 53(3): 407-419 doi: 10.3785/j.issn.1008-973X.2019.03.001

机械工程

生物3D打印——从形似到神似

贺永,, 高庆, 刘安, 孙苗, 傅建中

3D bioprinting: from structure to function

HE Yong,, GAO Qing, LIU An, SUN Miao, FU Jian-zhong

收稿日期: 2018-06-19  

Received: 2018-06-19  

作者简介 About authors

贺永（1979—），男，教授，从事生物制造研究.orcid.org/0000-0002-9099-0831.E-mail：yongqin@zju.edu.cn , E-mail：yongqin@zju.edu.cn

摘要

系统回顾生物3D打印的提出背景，给出生物3D打印的研究范围，梳理生物3D打印的发展历程. 重点聚焦于回顾操纵细胞的生物3D打印研究，并结合课题组近年来的研究及思考，对生物3D打印的发展进行展望. 更好地结合临床需求，实现从组织结构的仿生制造过渡到功能化的再造是生物3D打印未来取得突破的关键.

关键词： 生物3D打印 ; 细胞打印 ; 生物墨水 ; 生物打印机 ; 组织工程 ; 仿生制造

Abstract

Review the background of 3D bioprinting systematically, provide the research scope of 3D bioprinting, and summarize the development of 3D bioprinting. This review focuses on the 3D bioprinting of manipulating cells, and the development of 3D bioprinting was prospected combined with the research and thought of our research group in recent years. To better integrate clinical needs to realize transition from bionic manufacturing of organizational structure to functional reconstruction is the key to the breakthrough of 3D bioprinting in the future.

Keywords： 3D bioprinting ; cell printing ; bioink ; bioprinter ; tissue engineering ; bionic manufacturing

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本文引用格式

贺永, 高庆, 刘安, 孙苗, 傅建中. 生物3D打印——从形似到神似. 浙江大学学报(工学版)[J], 2019, 53(3): 407-419 doi:10.3785/j.issn.1008-973X.2019.03.001

HE Yong, GAO Qing, LIU An, SUN Miao, FU Jian-zhong. 3D bioprinting: from structure to function. Journal of Zhejiang University(Engineering Science)[J], 2019, 53(3): 407-419 doi:10.3785/j.issn.1008-973X.2019.03.001

1. 生物3D打印概况

1.1. 3D打印简介

3D打印（3D printing），又称为增材制造（additive manufacturing）或快速原型（rapid prototyping），其特点是通过层层叠加的方式构造三维实体. 3D打印好比切土豆的逆过程，切土豆是将土豆加工成土豆片、土豆丝、土豆丁或土豆泥，而3D打印是将土豆片、土豆丝、土豆丁或土豆泥反向组装成土豆的过程，这4种反向组装土豆的方式对应了4种典型的3D打印工艺：1）采用面投影光固化进行组装，其典型代表工艺是数字光投影3D打印；2）采用一根根丝或纤维进行组装，其典型代表工艺是熔融沉积3D打印；3）采用微球进行组装，其典型代表工艺是喷墨式3D打印；4）采用粉末烧结进行组装，其典型工艺是激光选择性烧结3D打印.

传统的制造方法（如：数控加工）是将一个毛坯通过车、铣、磨、刨等加工方式不断去除材料获得成品，通常称之为减材制造（subtractive manufacturing），而在3D打印制造过程中，材料不断地增加，正好与减材制造工艺相反，故而又称之为增材制造. 由于3D打印具有可以制造复杂结构及个性化定制的优势，其被广泛应用于航空航天、建筑、工艺设计、教育、医疗、生物等领域[1-2]. 而生物3D打印（3D bioprinting）就是将3D打印技术与生物医疗相结合所发展出的一个新兴研究领域.

1.2. 生物3D打印的概念

随着生物3D打印的发展，其概念也在不断地延伸拓展，目前生物3D打印可分为广义及狭义2个概念：从广义上来说，直接为生物医疗领域服务的3D打印都可视为生物3D打印的范畴，而从狭义上来定义，通常将操纵含细胞生物墨水构造活性结构的过程称之为生物3D打印. 从广义上来分，生物3D打印大致可划分为4个层次：第一层次为制造无生物相容性要求的结构，比如目前广泛应用于手术路径规划用产品的3D打印等；第二层次为制造有生物相容性要求、不可降解的制品，比如钛合金关节、缺损修复的硅胶假体等；第三层次为制造有生物相容性要求，可降解的制品，比如活性陶瓷骨、可降解的血管支架等；第四层次就是狭义生物3D打印，即操纵活细胞构建仿生三维组织，比如打印药物筛选及机理研究用的细胞模型、肝单元、皮肤、血管等. 操纵细胞的生物3D打印过程也可称之为细胞打印（cell printing），在狭义的概念上，细胞打印与生物3D打印概念可以互换. 此外，有时也会见到器官打印（organ printing）的概念，通常上这个概念也可认为与细胞打印及狭义的生物3D打印互换. 在维基百科上，生物3D打印词条就是采用了狭义的概念，即指操纵细胞构建仿生三维组织的过程.

关于生物3D打印的前3个层次的研究有很多的报道，课题组也做了一些工作，提出了一些新的打印工艺来解决诸如脑动脉瘤模拟器[3]、颌面缺损修复用假体[4]、高强度高活性可降解的人工骨打印[5-8]等问题. 前3个层次不涉及操纵活体细胞过程，其制造过程与非生物3D打印过程无明显区别，故本综述重点回顾狭义的生物3D打印，也就是细胞打印的研究进展，并结合课题组的研究讨论生物3D打印目前所面临的挑战及未来的发展方向.

1.3. 生物3D打印意义

谈及生物3D打印绕不开2个词：组织工程（tissue engineering）及再生医学（regenerative medicine），组织再生是目的，而组织工程是手段. 组织工程这个词由著名的美国华裔科学家冯元桢提出，在1987年被美国国家科学基金委员会确定. 组织工程的定义是指先将细胞沉积在生物支架（scaffold）上形成细胞−材料复合物，然后将含细胞支架植入体内，利用体内环境进行诱导形成相应的组织或器官，实现创伤修复和功能重建. 常规的组织工程做法是将支架制造与细胞黏附分离，难以在支架不同位置实现不同种类、不同密度细胞的沉积. 生物3D打印的优势就在于多细胞空间定向操控及不同细胞密度的可控沉积恰好可以解决组织工程目前所面临的难题.

体外制造活性组织/器官一直以来就是人类孜孜不倦所追求的目标，这个宏伟的目标主要有2个需求驱动. 1）目前器官移植缺口巨大，无论是国内还是国际上，由于器官捐献量不足，配型的成功率也不高，需要器官移植的病人能做的事情主要是等待. 2016年，美国等待器官移植者约16万，捐献器官者仅有1.6万[9]. 由于受传统伦理观念的影响，国内主动捐献器官人群的比例相对较小，器官捐献的缺口更大. 我国每年等待器官移植者约30万，而捐献器官者仅有1万[10]. 因此，随着科技的发展以及人类对健康的重视，体外制造活性器官必然会成为一个研究热点. 2）目前医学机理机制研究需要更为精准的体外模型，传统的解决方案是基于细胞二维培养及动物实验. 细胞二维培养和真实体内的三维环境相比差异太大，有些情况下还有可能出现互相矛盾的结果，导致其参考价值有限. 动物实验除了有很多伦理学的问题外，最为关键的是动物的体内环境和人体环境有很大的差别. 如果能在体外采用人体细胞重构出组织/器官所在的三维环境，无疑可以很好地弥补现有解决方案的缺陷，并且这一体外器官的构建可以广泛应用于药物筛选及疾病机理探究.

1.4. 生物3D打印进展

就目前的进展来看，解决器官移植缺口这一目标过于乐观，器官远比人们想象的要复杂得多. 1）很多内在的发育机理机制在生物学上还有待更深的理解；2）重现体内的精细结构对制造而言也是一大难题. 以血管为例，血管是一个看起来结构简单的器官，但实际上血管除了有多层不同的细胞组织结构（典型血管主要有内皮、平滑肌及成纤维细胞构成）外，血管壁的选择性通透、血管壁的弹性及抗凝等功能都使得体外制造活性血管以替换体内病变血管具有相当大的难度.

对于医学机理机制研究需求，有关在体外构建含细胞的三维结构以更好地模拟体内环境这方面的研究已蓬勃发展，在大通量药物筛选、器官发育及病变的机理机制等方面的探讨已经有相关报道. 由于在理论上可以实现多种细胞在空间及时间上的定向操控，生物3D打印成为体外构造活性的三维细胞结构最为理想的手段. 在可预期的时间内，围绕体外器官模型的构建，生物3D打印必将发挥越来越大的作用.

目前社会上对生物3D打印存在一定的误解，很多人认为生物3D打印已经无所不能，什么材料都能打印，基于这一技术很快就可打印心脏、肝、肾、肺等器官并实现器官移植. 事实上，生物3D打印还远未达到最初器官打印的设想，体外打印能够用于移植的活性器官还有相当长的路要走. 仍以土豆为例，对目前生物3D打印的进展作一个形象的比喻就是：可实现由土豆丝组装成土豆片再到土豆的过程，土豆丝内的细胞也有很好的活性，但距离细胞协同产生组织乃至器官的功能还有较大的距离，换句话说，打印出的土豆可做到形似，离神似还有一定的距离（打印出的土豆难以实现种到地里后能够发芽. 这里所说的打印土豆只是一个形象的比喻，事实上生物3D打印主要操纵动物细胞，基于生物打印的方法去打印土豆目前需求不大）. 也就是说，目前可以打印出含细胞的结构，但是打印的结构仅仅在外形及结构上类似体内组织器官，结构内的细胞只具有简单的协同功能，与真实器官的复杂生理功能还有很大差距. 考虑到实现功能化是生物打印从基础研究走向实际应用的核心，如果不能解决“形似而神不似”的问题，生物打印的发展将会面临瓶颈.

2. 生物3D打印研究现状

如图1所示，生物3D打印是将生物材料（水凝胶等）和生物单元（细胞、DNA、蛋白质等）按仿生形态学、生物体功能、细胞生长微环境等要求用3D打印的手段制造出具有个性化的生物功能结构体的制造方法[11, 12]. 相比于传统制造方法（以切削加工为例），生物打印有3个显著特点：1）在材料使用上，生物打印从传统制造的金属材料转变为载细胞的水凝胶材料（称作生物墨水）；2）在成形方式上，生物打印从传统制造的金属弹塑性变形转变为水凝胶所特有的交联成形；3）在加工后处理上，生物打印从传统制造的晶向结构调控转变为细胞的功能化诱导. 因此，从制造角度看，生物3D打印面临2个难题：1）控形制造以实现形似. 需要寻找合适的水凝胶材料并开发稳定的打印工艺，确保载细胞的水凝胶利用交联特性精确成形；2）控性制造以实现神似. 对打印后的结构需要提供细胞特定生长微环境并进行功能化诱导，使得独立的细胞个体融合成有功能的组织.

图 1

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图 1   生物3D打印原理

Fig.1   Schematic diagram of 3D bioprinting


现有研究大都围绕这2个难题，从材料、工艺、装备、应用4个方面努力实现生物3D打印的技术突破.

2.1. 生物墨水研究

开发合适的生物墨水一直是生物3D打印中的一个核心问题. 生物墨水首先要有非常好的生物活性，类似于体内的细胞外基质环境，便于打印后的细胞进一步发育，并建立细胞彼此间的通信. 生物墨水的另一大需求是成形性，三维打印要求墨水在打印时必须具有很好的流动性，打印后又能很快固化以便于固定成形. 通过提高水凝胶浓度及交联剂密度可加快固化时间，提高凝胶强度，有利于更好的打印成形，但同时会降低凝胶含水量，缩小凝胶内部微孔径，不利于细胞生存及细胞外基质的沉积，因此生物墨水有一个合适的成形工艺区间[13]，也就是所谓的Biofabrication Window. 该窗口主要是指兼顾打印要求、细胞活性及生长要求，由打印工艺参数（打印速度、挤出压力、打印温度、墨水浓度、交联剂浓度、光固化时间等）构成的一个能成功打印的区间. 在具体打印过程中，可以根据实际细胞类型和打印精度的需要沿不同方向移动窗口，调整凝胶性能.

目前的生物墨水主要有离子交联型、温敏型、光敏型及剪切变稀型4大类. 离子交联型主要是通过离子交联反应实现水凝胶的固化，比如海藻酸盐系列墨水，使用时海藻酸钠中的钠离子与钙离子进行置换，获得海藻酸钙水凝胶；温敏型墨水主要是通过加热或冷却的方式实现墨水从溶胶态到凝胶态的转变，比如明胶类墨水，打印时需要加热喷头以熔化明胶，冷却底部的打印平台以实现明胶定形；光敏型墨水主要是通过光来激活墨水中的光引发剂实现墨水从溶胶态到凝胶态的转变，比如目前课题组广泛使用并已产业化的甲基丙烯酸酐化明胶（GelMA，EFL-GM系列）材料[14]；剪切变稀型墨水主要是利用一些材料的表观黏度随着切应力的增加而减小的现象，在不受到剪切力时表现为凝胶态，当受到剪切力作用时变为溶胶态，比如采用卡波姆胶+GelMA或胶原构成生物墨水.

生物墨水的性能可采用可打印性、生物兼容性及机械性能来评价. “可打印性”用于评价墨水的成形性能，要求材料黏度可调可控、溶胶态到凝胶态的相变转换速度快、可打印工艺参数窗口宽；“生物兼容性”用于评价墨水模拟细胞外基质的能力，要求墨水能尽可能地接近所打印细胞在体内的微环境，细胞能在凝胶化的墨水内增殖、伸展、分化并实现最终彼此间通讯[13]. 机械性能要求凝胶化后的墨水有足够的强度来支持后续的培养及体内植入过程. 通常打印后的结构需要体外培养一段时间，培养过程中可能会出现营养的灌注、降解等，要求结构必须有足够的强度支撑这一过程，同样植入体内时如果强度太低也会导致植入失败.

动物细胞分泌的细胞外基质主要由三大类成分组成：结构蛋白（胶原、弹性蛋白等）、专一蛋白（纤维蛋白等）及蛋白聚糖. 最理想的生物墨水无疑就是能逼近天然的细胞外基质，因而不同的细胞所需的生物墨水也需要调整，原则上讲要尽可能添加细胞在体内生长时所需的物质. 比如在打印软骨细胞时，添加一些透明质酸（软骨中常见的组分）会对后期的培养及功能化有较好的促进作用.

目前最常用的海藻酸盐系生物墨水成形性能及机械性能较好，缺点是生物兼容性较弱，直接影响打印后细胞向组织的转化；而胶原类生物墨水由于来自动物体内，有很好的生物兼容性，缺点是成形速度慢，机械性能差，需要后续的改性或者混入其他材料中使用. 就目前看，GelMA材料兼具可打印性及可成形性两大优点，有望在生物3D打印中获得广泛的应用. 除了成凝胶性能及生物相容性外，水凝胶作为典型的软物质材料，打印后的变形也严重影响三维结构的高精度制造，现有的很多文献报道主要还是关于准三维结构的打印（基本还是打印一些网格结构）. 真正实现类组织结构的打印还需要从打印工艺及打印方法上做很多努力.

2.2. 生物3D打印工艺研究进展

根据成形原理和打印材料的不同，生物3D打印技术又可细分为喷墨式、激光直写式、挤出式、光固化式打印等.

2.2.1. 喷墨式生物3D打印（inkjet-based 3D bioprinting）

以液滴为基本成形单元的打印过程，可比喻为以土豆丁组装土豆的过程. 喷墨打印被认为是最早的生物3D打印技术[15]. 与传统的2D喷墨打印类似，利用压电或热力驱动喷头，将生物墨水（水凝胶和细胞的混合物）分配成一系列的微滴，如图2所示. 经过层层打印，三维含有细胞的结构可以成形. 由于这个过程中微滴是成形的基本单元，如何保证微滴相互黏结融合非常重要.

图 2

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图 2   喷墨式生物3D打印原理

Fig.2   Schematic diagram of inkjet-based 3D bioprinting


由于商用的喷墨打印机很容易获取，将其改造成三维打印装置较为容易，因此喷墨打印是成本相对较低的生物打印技术. 另外喷墨打印机上可装多个喷头，可同时打印不同细胞，打印速度快. 很多学者发表了关于打印过程中的细胞活性[16]、生物墨水形成微滴的变形机理[17] 以及如何打印复杂的三维结构[18-20]的研究.

由于喷头的驱动压力较小，无法打印高黏度的材料和高浓度的细胞. 低黏度的材料使打印成形的结构强度变小，无法满足后续体外培养和移植的需求. 黏度要求使得适用的生物材料范围变窄. 另外，在喷墨打印过程中，可能会对细胞产生机械损伤或者热损伤[21]. 这些缺点限制了喷墨打印技术的广泛应用.

2.2.2. 激光直写式生物3D打印（laser direct writing 3D bioprinting）

激光直写技术最早被用来制造加工电子元器件的金属模板[22]. 在2000年，Odde等[23]利用这个技术来打印活细胞，接着激光直写式生物打印技术得到了发展[24-30]. 这种方法也是以液滴作为基本成形单元，如图3所示，激光吸收材料用来产生微气泡以避免细胞直接接触高能量的激光. 首先，将一层激光吸收材料涂覆在玻璃基底上，将生物墨水均匀地铺展在激光吸收层表面；打印时，激光穿透玻璃基底使吸收层材料产生气泡，通过气泡的膨胀驱动生物材料和细胞脱离基底，沉积到成形平台上. 通过三维运动平台驱动玻璃基底或者成形平台的运动，三维结构可以制造成形. 从某种意义上说，激光直写技术是一种无喷头的喷墨打印方式.

图 3

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图 3   激光直写式生物3D打印原理

Fig.3   Schematic diagram of laser direct writing 3D bioprinting


与喷墨打印技术相比，激光直写技术可以避免生物墨水和处理装置的直接接触，这种非接触式的制造方式不会对细胞造成机械剪切损伤，这种方式可以打印较高黏度的生物材料，而且适用的材料范围也比喷墨打印广泛. 然而，大部分相关研究还停留在讨论这种工艺过程本身，缺乏进一步的应用探讨，目前限制该工艺广泛应用的原因包括：1）基于激光直写原理的打印机成本比较高，工艺也不够成熟，缺乏商业化的打印装置；2）每打印一层时，在激光吸收材料上涂覆生物墨水比较耗时；3）产生的微滴的重复性还需要进一步研究.

2.2.3. 挤出式生物3D打印（extrusion-based 3D bioprinting）

挤出式打印技术是应用最为广泛的生物打印方法，是从喷墨打印技术演变过来的，可以打印黏度较高的生物材料[31]. 这一方法利用气压或者机械驱动的喷头将生物墨水可控挤出，如图4所示. 微纤维从喷头处被挤出，沉积到成形平台上形成二维结构，随着喷头或者成形平台z方向上的运动，二维结构层层堆积形成三维结构.

图 4

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图 4   挤出式生物3D打印原理

Fig.4   Schematic diagram of extrusion-based 3D bioprinting


在挤出式打印过程中，通过连续挤出力可以挤出不间断的纤维，而不只是单个的微滴. 这种成形方式可以打印不同黏度的生物材料和不同浓度的细胞，材料适用范围比较广，可以制造出结构强度较好的组织结构[32-35].

2.2.4. 光固化式生物3D打印（photocuring-based 3D bioprinting）

光固化打印技术最初用于制造细胞支架[36-39]，细胞种在打印的支架表面，而不是直接和材料一起成形. 后来，光固化打印技术被改用于生物打印，与激光直写式打印类似，光固化打印也是利用光来选择性交联生物墨水，层层固化形成三维结构[40-41]. 如图5所示，紫外光通过数字微镜装置选择性地投射到生物墨水表面，被照射的区域材料开始固化，通过成形平台的上下运动，逐层固化得到三维结构.

图 5

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图 5   基于数字微镜（DMD）的光固化式生物3D打印原理

Fig.5   Schematic diagram of photocuring-based 3D bioprinting with digital micro-mirror device （DMD）


光固化打印装置利用数字光投射器对生物墨水的整个面进行固化，效率较高，不论单层结构的复杂程度如何，打印时间都是相同的，且打印精度较高. 打印机只需要一个垂直方向运动的平台，相比于其他方法，装置比较简单，利于控制；缺点是紫外光及其引发剂会对细胞造成损伤.

2.3. 生物3D打印装备研究

由于喷墨式、激光直写式及光固化式生物3D打印技术对打印材料、打印工艺及成形设备的要求比较高，且应用范围相对较窄，目前基于这些技术的打印装备大都为自主搭建，尚处于实验室研究阶段，还未有成熟的打印装备报道. 挤出式生物3D打印可以打印离子、温度和光交联型水凝胶，材料适用范围较广，工艺可控可调，且可打印复杂结构，因此市面上成熟的生物3D打印机大都是基于挤出式打印原理研发的，包括德国EnvsionTEC公司的3D Bioplotter、美国Organovo公司的NovoGen MMX 3D Bioprinter、瑞士RegenHU公司的BioFactory和3D Discovery系列生物打印机，以及课题组研发并在苏州智能制造研究院产业化的EFL-BP系列生物3D打印机.

典型的基于挤出方式的生物3D打印机一般包括4个模块：三维运动模块、喷头挤出模块、成形功能模块以及辅助功能模块[42]，如图6所示. 三维运动模块是形成三维结构的基础模块，通过控制器控制电机转动，通过丝杠导轨带动滑块水平运动. 其中运动平台的行程决定打印结构的最大尺寸，定位精度影响成形结构的精度，移动速度影响打印效率. 挤出模块包括挤出装置和喷头，利用挤出装置将储料腔内的材料通过喷头挤出，这个过程要求挤出力足够大，可以打印不同黏度的材料. 挤出形式包括气压式、活塞式和螺杆式，可适用不同材料的打印. 功能模块是保证材料形成三维结构的核心，主要根据水凝胶的交联原理（温敏、光敏等）设置相应的喷头加热装置、平台制冷装置、光固化装置等，以保证水凝胶挤出后，可以快速交联定形，形成精度较高、稳定性较好的三维结构. 辅助功能模块一般有摄像装置、清洗装置、灭菌装置等，用于成形过程观察、喷头处理以及打印细胞时提供无菌环境等. 如图7所示，除了外观设计不同，现有商业化的生物3D打印机的配置基本相同，均配有多喷头，支持多材料打印.

图 6

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图 6   典型的基于挤出方式的生物3D打印机组成

Fig.6   Typical composition of extrusion-based 3D bioprinter


图 7

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图 7   商业化的生物3D打印机

Fig.7   Commercialized 3D bioprinter


多功能集成式的生物3D打印机价格昂贵，操作复杂，考虑到大部分用户都是生物医学背景，缺乏数控设备操作经验，使用多功能生物3D打印机有较大难度，课题组从用户的需求及实用性出发，研发了EFL-BP系列的生物3D打印机[43]. 该设备为便携式可放入超净工作台的桌面型生物3D打印机(见图8)，轻便小巧，可搭载气动、挤出、近场直写、光固化等喷头，可打印水凝胶、磷酸盐、硅酸盐、聚乳酸（PLA）、聚乙烯醇（PVA）等材料，且可以直接打印细胞，细胞的存活率在90%以上. 其最大特点是模块化、功能简单易用，这也是生物3D打印设备真正实用及普及的发展方向.

图 8

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图 8   课题组研发的EFL-BP系列生物3D打印机

Fig.8   3D bioprinter （EFL-BP） developed by our research group


利用自主研发的生物3D打印机，本课题组设计了很多原创的制造工艺. 如图9所示，可以实现单细胞分辨率的打印（图9（a））；可打印分辨率为3 µm左右的高精度细胞支架（图9（b））；可在直径为2 mm的微球内构造复杂结构[44]，诸如玫瑰花等（图9（c））；可打印内置螺旋结构的凝胶纤维[45]（图9（d））；可采用液态支撑打印复杂凝胶结构（图9（e））、可打印耳朵等仿生器官结构（图9（f））.

图 9

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图 9   课题组设计的原创打印工艺

Fig.9   Original printing process designed by our research group


2.4. 生物3D打印的应用研究

由于生物3D打印不仅可以制造特定形状的结构，而且可以提供细胞三维培养环境，生物3D打印在组织器官的制造中有着广泛地应用，目前主要用于软骨、皮肤、血管、肿瘤模型及其他复杂器官的打印.

2.4.1. 软骨打印

软骨组织的细胞组成比较简单，并且没有复杂的毛细血管，因此用生物打印制造软骨组织的研究比较多[46-48]. 如图10（a）所示，Cui等[49]利用挤出式生物打印工艺将软骨细胞和高分子聚合物一起打印出来，制造关节组织，并用于软骨修复. 半月板在人体膝关节起负重作用，由于伤病和运动导致的半月板损伤很难治疗，一些学者希望通过生物打印的方法体外重建半月板结构[50-51]. 如图10（b）所示，Narayanan等[50]利用挤出式生物打印将人脂肪干细胞和PLA纤维、海藻酸钠水凝胶打印成半月板形状，研究表明：添加纤维提高了细胞的增殖能力，并且使细胞分泌了胶原和蛋白聚糖，证明已有软骨形成. 据报道，通过生物打印的方法可制造出更加复杂的软骨结构[52-56]. Armstrong等[52]用海藻酸钠和泊洛沙姆（Pluronic-F127）混合水凝胶来打印鼻子结构，而本课题组基于数字光固化技术打印出了GelMA材质的鼻子结构，如图10（c）所示. 如图10（d）所示，Kang等[53]采用不同的喷头，同时打印支撑材料、牺牲层材料和细胞，以打印耳朵结构为例展示了多喷头混合打印在制造复杂组织器官结构中的应用. 用同样的混合打印方法，Mannoor等[56]将软骨细胞和导电聚合物打印成耳朵形状，制造出的耳朵具有部分听力功能（见图10（e））.

图 10

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图 10   软骨组织的生物3D打印

Fig.10   3D bioprinting of cartilage tissues


2.4.2. 皮肤打印

皮肤是人体最大的器官，起维持体内平衡和保护作用[57]，其垂直的分层结构为体内水分和小分子的出入以及外源物的进入提供了屏障. 这种典型的分层结构非常适合采用生物打印来制造，已有很多研究报道[58-61]. 如图11（a）所示，Koch等[27]用激光直写式生物打印方法，将成纤维细胞和角质细胞混在胶原里打印成分层结构，研究结果表明，细胞可以很好地增殖生长，并且可以形成细胞连接. 如图11（b）所示，Lee等[57]利用挤出式生物打印工艺制造多层皮肤结构. 类似地，如图11（c）所示，Lee等[62]开发了一种多喷头的挤出打印装置，将皮肤的成纤维细胞层和角质细胞层交替打印，制造成的皮肤结构在伤口敷料和药物测试应用中有着很好的应用前景. 皮肤打印的难点是解决全层皮肤的打印及后续的存活.

图 11

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图 11   皮肤的生物打印

Fig.11   3D bioprinting of skin


2.4.3. 血管打印

利用生物3D打印方法制造血管结构或血管流道网络一直是组织工程领域的研究热点. 根据制造目标不同，可以分为2种思路：一种是仿结构，直接打印模拟血管结构特征的凝胶管；另一种是仿功能，间接构造模拟营养输送功能的流道网络. 如图12（a）所示，Christensen等[63]利用喷墨打印制造出了分叉的凝胶管结构. 此外，Xiong等[64]利用激光直写方法，Tabriz等[65]利用挤出工艺直接打印出了凝胶管结构. 如图12（b）所示，Zhu等[66]利用光固化工艺打印出了三维凝胶流道网络结构. 基于牺牲层工艺的挤出打印是最常用的间接构造流道网络的打印方法. 如图12（c）所示，Miller等[67]选择以糖作为牺牲层材料，首先利用挤出方式打印糖支架，然后将糖支架包埋在含有细胞的凝胶材料里，最后将糖溶掉形成流道网络. 与此类似，明胶、琼脂糖、F127也常作为牺牲层材料来构建凝胶流道网络[68-70]. 此外，本课题组基于同轴挤出打印方法，提出了流道网络同步构造的打印工艺（见图12（d）），并应用于跨尺度血管结构的制造[71-72]，如图12（e）所示（L929: Mouse fibroblasts；MOVAS：Mouse smooth muscle cells，HUVEC: Human umbilical vein endothelial cells）.

图 12

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图 12   血管的生物3D打印

Fig.12   3D bioprinting of vascular structures


2.4.4. 肿瘤模型打印

研究细胞间的相互作用以及细胞与细胞微环境的关系是研究肿瘤成因的一个方法，传统的二维肿瘤模型难以真实反映复杂的肿瘤结构，这就限制了基于体外肿瘤模型在药物筛选和致病机理方面的应用研究. 随着生物打印的出现，很多肿瘤模型在体外被构建并用于药物筛选研究[73-77]，包括肝癌模型、胶质瘤模型、宫颈癌模型和卵巢癌模型等. 如图13所示，Zhao等[78]用挤出打印的方法将宫颈癌Hela细胞制造成了三维结构，研究结果表明，与二维细胞培养相比，三维状态下细胞以球形结构生长，增殖能力更强，MMP蛋白表达更高，对紫杉醇展示出更高的抗药性，这些特性更接近于体内肿瘤的真实特征. 肿瘤模型打印技术为肿瘤研究以及药物筛选提供了有利的工具.

图 13

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图 13   肿瘤模型的生物3D打印

Fig.13   3D bioprinting of tumour model


2.4.5. 复杂组织器官打印

人体内大部分组织器官都由不同功能的细胞、不同尺度的结构组成. 应用生物打印技术制造这些结构一直是研究的热点[79-83]. 如图14（a）所示，Duan等[84]利用双喷头挤出式打印装置，将主动脉瓣间质细胞和平滑肌细胞混在海藻酸钠/明胶中打印出主动脉瓣导管结构. 如图14（b）所示，Hinton等[85]利用宾汉流体作为软支撑，打印出了复杂的器官结构，如心脏. 如图14（c）所示，Ma等[86]利用光固化的方法打印出了含有血管网络的肝小叶结构. 如图14（d）所示，Lozano等[87]采用同轴喷头挤出装置将神经元细胞打印成类大脑结构，研究结果表明，打印出的神经细胞可以伸展并长出突触. 类似地，如图14（e）所示，神经元细胞可以通过喷墨打印的方式打印[88]. 虽然生物3D打印取得了可喜的进展，但现有报道中所打印的器官大部分还是结构上的近似或者单一功能的实现，要实现复杂器官的打印，还需要多学科研究人员的协同努力.

图 14

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图 14   复杂组织器官的3D打印

Fig.14   3D bioprinting of complex tissues


3. 生物3D打印的发展趋势

对细胞打印而言，生物墨水的可控化、打印结构的活性化、打印结构的功能化可概括为其控形控性所涵盖的三大基础科学问题，解决这些问题需要攻克从墨水的合成、打印工艺的调控、营养输送通道的构建到功能化的诱导等系列难题.

3.1. 高生物相容性生物墨水合成及打印工艺开发

实现打印结构功能化的目标，关键在于选用合适的生物墨水. 作为细胞的沉积载体，生物墨水为细胞提供特定的生长微环境，是细胞功能化诱导的前提，生物墨水的选用应以生物功能性为导向，而不是以结构成形性为主要目标. 因此，开发高生物相容性的生物墨水，并实现其批量稳定合成，是生物打印得以成功应用的基础.

此外，缺乏针对高生物相容性生物墨水的打印工艺也是制约结构功能化的瓶颈之一. 以挤出式生物打印为例，可打印性要求生物墨水具有可控的流变性能和交联特性. 工艺设计过程需要考虑生物墨水黏度高难挤出、黏度低不成形以及交联速度慢、成形精度低等问题. 因此，针对高生物相容性生物墨水开展制造工艺及成形机理研究是生物打印的一个重点发展方向.

3.2. 组织/器官结构的精准仿生

器官是由不同尺寸、不同软硬度和不同细胞的组织结构组成的. 以血管为例，真实血管的直径从微米尺度到厘米尺度（从20 μm的毛细血管到2.5 cm的动脉血管），包含三层细胞结构：成纤维细胞层、平滑肌细胞层和内皮细胞层，每层结构的细胞功能也不同. 又如，细胞外包裹的细胞外基质也是一个含有纳米、微米纤维的结构. 此外组织内部也存在相当多的过渡界面以及软硬度存在诸多变化的结构. 组织及器官的复杂性给精准仿生及打印带来了相当大的难度，要解决这个问题，多尺度、多材料和多细胞的打印将是未来的一个发展重点.

除了在技术上不断提升打印精度以更好地逼近真实的组织结构外，另一个命题也很有趣，即近似到何种程度才可满足功能重建的要求. 生命结构如此精巧，完全从工程角度来解决仿生过程易陷入唯技术论. 借助细胞打印构造一个初始的组织形态，然后将这个原始组织交给生命体去管理调控，也许是未来体外构造器官的可行途径.

3.3. 结构内部类血管网络的构造

目前的生物3D打印受限于水凝胶有限的营养渗透能力，很多区域营养难以有效输送，导致后续的培养失败，因此器官尺寸无法扩大. 这也是目前大部分带细胞的结构都是以网格状结构为主的原因，组织内部遍布的血管网络是组织能够保持存活的根本. 同样打印的结构内部也需要有对应的通道结构以输送营养才能保证后续的存活及进一步的功能化培养. 尽管目前已有很多构建流道网络的方法，但是每种方法都有局限性. 基于凝胶颗粒融合的喷墨打印和激光直写方法精度很高，但是很难打印复杂血管网络. 基于牺牲层工艺的挤出打印需要二次成形，过程复杂. 为了更有效地构造类血管的流道网络，满足营养输送的需求，需要进一步深化打印工艺，更有效地构造多尺度营养输送网络，并通过力学及化学刺激，促使其血管化.

3.4. 打印结构后续的功能化诱导

目前大部分研究还停留在打印工艺、打印机理上，而以组织制造为导向，研究组织制造过程中的功能化问题，相关报道较少. 功能化的问题是生物3D打印从基础研究走向实际应用的核心. 如果不能解决形似而神不似的问题，不能实现生物3D打印的功能化突破和应用，生物3D打印的发展将会面临瓶颈. 打印结构后续的功能化是评价打印性能的金标准，也是生物3D打印的最终目的.

要解决功能化的问题，需要墨水有好的生物兼容性，具有足够的强度以满足营养灌注及植入体内的需要. 此外构建解决体内的刺激环境，包括机械力刺激及生长因子等化学载荷刺激，也对打印结构的功能化至关重要.

4. 结　语

生物3D打印是将生物制造与增材制造结合起来的一项新技术，是机械、材料、生物、医学等多学科交叉的前沿技术，为组织工程和再生医学领域的研究提供了新途径. 目前生物打印已在生物墨水制备、打印工艺研发、打印设备开发及医学应用研究方向取得了很多进展，但目前这些研究大都聚焦解决制造问题，未来应与临床需求紧密结合，尽快实现生物3D打印技术的功能化突破和应用.

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