浙江大学学报(工学版)

浙江大学学报(工学版), 2023, 57(4): 643-656 doi: 10.3785/j.issn.1008-973X.2023.04.001

机械与能源工程

生物墨水挤出打印成型精度评价方法概述

林泽宁,, 蒋涛,, 尚建忠, 杨云, 洪阳, 罗自荣

国防科技大学 智能科学学院，湖南 长沙 410073

Overview of methods for evaluating accuracy of bioink extrusion bioprinting

LIN Ze-ning,, JIANG Tao,, SHANG Jian-zhong, YANG Yun, HONG Yang, LUO Zi-rong

College of Intelligence Science and Technology, National University of Defense Technology, Changsha 410073, China

通讯作者: 蒋涛，男，副教授. orcid.org/0000-0002-9406-5061. E-mail： jiangtao@nudt.edu.cn

收稿日期: 2022-08-28  

基金资助: 国家自然科学基金资助项目（52105039）；湖南省研究生科研创新资助项目（CX20220027）；国防科技大学科研计划资助项目（ZK-19）；国防科技大学智能科学学院青年骨干教师资助项目（4142Z6G2）

Received: 2022-08-28  

Fund supported: 国家自然科学基金资助项目（52105039）；湖南省研究生科研创新资助项目（CX20220027）；国防科技大学科研计划资助项目（ZK-19）；国防科技大学智能科学学院青年骨干教师资助项目（4142Z6G2）

作者简介 About authors

林泽宁（1997—），男，博士生，从事生物3D打印与生物机器人的研究.orcid.org/0000-0002-5827-0594.E-mail：linzening@nudt.edu.cn , E-mail：linzening@nudt.edu.cn

摘要

为了推动挤压生物3D打印结构精度的提升，介绍了以水凝胶为代表的生物墨水挤压打印原理及相关数学模型. 针对打印精度的影响因素，从结构设计、生物墨水特性、打印设备及工艺参数三方面进行系统分析，总结各参数对打印精度的作用. 按照定量评价方法所涉及参数的维度归纳总结并分析不同方法的优缺点，从仿真预测、克服材料力学行为、辅助打印等方面提出研究思路，为后续挤压生物3D打印技术的进一步发展提供参考.

关键词： 挤压生物3D打印 ; 打印精度 ; 结构设计 ; 生物墨水特性 ; 工艺参数 ; 定量打印评价方法

Abstract

The principle of extrusion-based bioprinting with bioinks represented by hydrogels and the related mathematical model were introduced in order to improve the accuracy of extrusion-based 3D bioprinting structure. The factors affecting the printing accuracy were systematically analyzed in terms of structural design, bioink properties, bioprinting equipment and technological parameters, and the role of each parameter on the printing accuracy was summarized. The advantages and disadvantages of different methods were analyzed based on the dimensions of the parameters involved in the quantitative evaluation methods. Research ideas from simulation prediction, overcoming material mechanical behaviors and assisted printing were proposed, which provided references for the further development of the extrusion-based 3D bioprinting technology.

Keywords： extrusion-based 3D bioprinting ; printing accuracy ; structure design ; bioink property ; process parameter ; quantitative printing evaluation method

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本文引用格式

林泽宁, 蒋涛, 尚建忠, 杨云, 洪阳, 罗自荣. 生物墨水挤出打印成型精度评价方法概述. 浙江大学学报(工学版)[J], 2023, 57(4): 643-656 doi:10.3785/j.issn.1008-973X.2023.04.001

LIN Ze-ning, JIANG Tao, SHANG Jian-zhong, YANG Yun, HONG Yang, LUO Zi-rong. Overview of methods for evaluating accuracy of bioink extrusion bioprinting. Journal of Zhejiang University(Engineering Science)[J], 2023, 57(4): 643-656 doi:10.3785/j.issn.1008-973X.2023.04.001

随着科技水平的提升与再生医学的发展，体外构建组织器官模型以替代或修复病变组织的功能成为研究热点[1-3]. 由于三维组织结构复杂、微环境控制难度大的因素限制，通过传统加工方式难以实现各种不规则生物组织或器官的有效构建. 生物3D打印技术的出现为克服这些难题带来了希望[4]. 生物3D打印技术可以分为广义与狭义2个概念[5-7]. 从广义概念出发，直接为生物医疗领域服务的3D打印均属于生物3D打印技术，如钛合金关节、惰性金属骨骼、硅胶假体等. 从狭义概念出发，将含细胞的软材料（或称为生物墨水）打印出具有生物活性的结构的过程称为生物3D打印，如类器官制造、脂肪组织重构、血管构建等.

根据成型原理与打印材料的不同，生物3D打印技术可以分为挤出式、喷墨式、光固化[8-10]等. 与其他生物打印技术相比，挤压生物打印因材料适用范围广泛、价格低廉、可打印复杂结构等独特优势，引起科研人员极大的研究兴趣[11-13]. 挤压生物打印又称为墨水直写，它通过连续挤出力，将生物墨水从容器中挤出到平台上，堆叠成三维结构[14-15].

理想的生物墨水应具有良好的可打印性、生物相容性、力学特性等性能. 水凝胶作为使用最多的生物墨水，能够模拟天然细胞外基质环境，具有可调的理化性能. 常见的水凝胶包括细胞外基质（基质胶）、多糖（海藻酸盐、透明质酸等）、蛋白质（明胶、胶原等）与合成高分子材料（聚己内酯、聚乳酸等）等[16-19]. 使用这些单一或复合材料，科研人员在血管构建、类器官制造、皮肤损伤修复等方面取得突破性进展[20-24]. Song等[25]将甲基丙烯酰化明胶（Methacrylate Gelatin, GelMA）与改性聚(3,4-二氧乙烯噻吩)(Poly(3,4-ethylenedioxythiophene)， PEDOT)为主要材料制备成导电水凝胶生物墨水，负载神经干细胞挤压打印形成支架. 该支架适中的孔径（50~80 μm）与硬度（约为0.5 kPa）促进神经元细胞的增殖与分化. 采用类似的材料，Su等[26]挤压打印明胶/壳聚糖水凝胶，形成仿生多分叉血管. 该血管具有良好的生理稳定性，形状可以维持至少3个月.

构建高精度打印结构且维持较高的细胞活性是使用挤压生物打印方式体外构建组织器官的关键问题[27-28]. 其中，三维结构的打印精度主要指打印结构在长度、宽度和高度方面与原始CAD模型的大小和空间位置相匹配的程度. 打印结构的精度及细胞活性由材料流变特性、挤压速度、喷嘴尺寸等工艺参数决定. 聚焦于构建高精度打印结构，本文简要介绍了挤压生物打印的原理和相关数学模型，分析影响打印精度的主要参数及规律. 基于打印结构所面临的形状保真度与打印分辨率问题，归纳总结国际上打印精度的定量评价方法，分析现有评价方法的特点. 结合课题组研究基础及国内外研究现状，提出提高挤压打印结构精度的研究思路，旨在为挤压生物打印技术的进一步发展提供参考.

1. 软材料挤压生物打印原理

1.1. 挤压生物3D打印技术原理

现有的挤压生物3D打印过程分为以下几步. 1）根据研究目的选择生物墨水进行配置，将配置完成的生物墨水置于容器（如针筒）之中. 2）建立三维实体模型，进行切片并导入打印系统. 3）设定工艺参数（如挤出速度、喷嘴移动速度、层厚等），使喷嘴按照设定轨迹在基底上连续挤出微丝. 4）建立打印精度评价方法，判断打印质量，进行参数校正. 5）输出优化参数，打印最优结构[11, 14, 29]（见图1）. 基于给定压力的不同方式，可以将常见的挤压生物3D打印方式分为活塞挤出式、螺旋挤出式与气动挤出式[7]，原理如图2所示.

图 1

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图 1   挤压生物3D打印过程

Fig.1   Progress of extrusion-based 3D bioprinting


气动挤出式生物打印技术的原理简单，它直接利用压缩空气给生物墨水提供推力，使其顺利挤出形成微丝，如图2所示. 气动挤出式打印技术可以进一步细分为基于阀门的挤压打印和无阀挤压打印. 前者可控制脉冲频率与压力，适用于高精度打印；后者因配置简单，适用范围较广[17]. 当生物墨水的黏度低于104 Pa∙s时，常使用气动挤出式打印系统进行打印[29].

图 2

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图 2   3种挤出生物3D打印技术

Fig.2   Three extrusion-based 3D bioprinting technologies


活塞挤出式生物打印技术属于机械式出液系统，原理如图2所示. 它将针筒的活塞尾端通过螺杆与步进电机连接，步进电机将螺杆的旋转运动转化为活塞的直线运动，推动生物墨水顺利挤出[5]. 活塞式挤出打印系统对通过喷嘴的生物墨水流动提供更直接的控制，可以打印一些固态或半固态的生物墨水. 采用类似的原理，螺旋挤出式生物3D打印直接通过步进电机进行螺旋旋转挤出生物墨水，如图2所示. 螺旋挤出式打印系统适合打印高黏度材料（黏度可高达104 Pa·s），常用于聚己内酯这类高黏度材料的打印. 材料中混合细胞会对细胞造成损伤[17]，且存在价格昂贵、消毒步骤繁琐的不足，打印过程中须根据所使用的生物墨水特性、打印精度及打印结构功能等方面的要求选择合适的打印系统.

1.2. 挤压生物打印的基本数学模型

基于挤压打印原理和生物墨水流变特性，研究人员建立一系列数学模型. 在挤压生物3D打印过程中，软材料的流动类型由雷诺系数 ${Re} $定义[30]，如下所示：

$ {{{Re}}} = \frac{{{F_{\rm{g}}}}}{{{F_{\rm{m}}}}} = \dfrac{{\rho s{v^2}}}{{\dfrac{s}{d'}\eta v}} = \dfrac{{\rho vd'}}{\eta }. $

式中： ${F_{\rm{g}}}$、 ${F_{\rm{m}}}$、 $\rho $、 $v$、 $d'$、 $\eta $分别为惯性力、黏性力、液体密度、液体流速、管道直径和流体黏度. 挤压打印的软材料满足雷诺系数远小于1，表现为层流. 虽然实际的挤压生物打印设备较复杂，但挤出过程的主要部件是依靠挤出流体的喷嘴. 根据形状，喷嘴可以大致分为圆柱形和圆锥形2种.

对于圆柱形喷嘴而言，假定材料是均匀、各向同性且不可压缩，且满足润滑边界条件和温度恒定条件[31]. 在挤压过程中，体积流量qV的计算公式为

$ \begin{split} & q_V = {\text{π}} {R^3}{\left( {\frac{{\Delta pR}}{{2{K}L}}} \right)^{\frac{1}{{{n_{\rm{s}}}}}}} \frac{{{n_{\rm{s}}}}}{{{n_{\rm{s}}} + 1}} \left[ ({1 - X){^{\frac{{{n_{\rm{s}}} + 1}}{{{n_{\rm{s}}}}}}} - } \right.\\ &\left. {\frac{{2{n_{\rm{s}}}}}{{2{n_{\rm{s}}} + 1}}{{(1 - X)}^{\frac{{2{n_{\rm{s}}} + 1}}{{{n_{\rm{s}}}}}}} + \frac{{2n_{\rm{s}}^2}}{{(2{n_{\rm{s}}} + 1)(3{n_{\rm{s}}} + 1)}}{{(1 - X)}^{\frac{{3{n_{\rm{s}}} + 1}}{{{n_{\rm{s}}}}}}}} \right]. \end{split} $

式中：K为黏度指数；ns为剪切流动指数； $X = {{2{\tau _{\text{y}}}L}}/({{\Delta pR}})$，其中 $L$、 $\Delta p$、 $R$、 ${\tau _{\text{y}}}$分别为喷嘴总长、喷嘴压强变化、喷嘴半径、单轴剪切屈服应力；ns为剪切流动指数. 对于式（2），可以分为 $ {n_{\rm{s}}} $=1， ${\tau _{\text{y}}}$=0以及前两者同时存在的情况.

1）若 ${n_{\rm{s}}}$=1，则为宾汉流体. 宾汉塑性体的主要流动特征是存在屈服应力，当超过屈服应力时，软材料才可流动. 本构方程为

$ \tau =\left\{ {\begin{array}{l}{\tau }_{{\rm{y}}}+{\eta }_{{\rm{p}}}\dot{\gamma }, \;普通\text{Bingham}流体;\\ {\tau }_{{\rm{y}}}+K{{\dot{\gamma }}^{n_{\rm{s}}}}, \; 非线性\text{Bingham}流体. \end{array} } \right.$

式中： $ \tau $为切应力， $ {\eta _{\rm{p}}} $为塑性黏度. 当超过屈服应力后，流体遵循牛顿黏度定律，这类软材料称为普通宾汉流体；当流动规律遵循幂律定律时，称为非线性宾汉流体（或Herschel-Bulkley流体）.

2）若 ${\tau _{\text{y}}}$= 0，则式（3）变化为符合幂律定律的管流方程. 研究人员针对其流动行为，提出各类形式的本构方程. 较常见的经验方程包括Ostwald-de Wale幂律定律、Cross方程. 软材料打印时，若剪切速率在约1~1 000 s−1区间内，则切应力τ与剪切速率 $\dot \gamma $满足Ostwald-de Wale幂律定律：

$ {\eta }=\frac{\tau }{\dot{\gamma }}=K{\dot{\gamma }}^{n_{\rm{s}}-1} . $

随着 $n_{\rm{s}}$趋向于0，剪切变稀行为增强；若 $n_{\rm{s}}$趋向于1，则非牛顿行为随之降低（ns = 1，则表现为牛顿行为）[32]. 研究人员提出Cross方程[33]：

$ {\eta} = {\eta _\infty }+\frac{{{\eta _0} - {\eta _\infty }}}{{1+K{{\dot \gamma }^m}}} . $

式中： $ {\eta _0} $与 $ {\eta _\infty } $分别为零剪切黏度与无穷剪切黏度，即在剪切速率趋向于0与∞时的材料黏度. 该本构方程与式（4）相比更加全面，但参数较多导致应用不如后者普遍.

对于圆锥型喷嘴而言，挤压打印过程较复杂. 它同时存在剪切流动与拉伸流动. 现有的理论模型主要采用2种方法进行构建：一种是基于柯西动量方程与材料基本物理特征（如黏度、屈服应力等）推导流动方程，一种是推导与观察得到的数据匹配的经验公式. 前者的典型例子为Cogswell’s公式[34]、Snelling公式[35]，后者的典型代表为Benbow和Bridgewater公式[36-38]. 对于这些圆锥形喷嘴的典型数学模型，Jiang等[31]进行了系统阐述，具体讨论在开发挤压生物打印过程中完整模型的潜在贡献，在此不进一步展开.

基于上述数学模型，研究人员可以将挤压打印系统所涉及的工艺参数（例如针咀内径、材料流变特性、压强等）代入相关模型，得到理论流量、理论宽度. 基于数学模型拟合得到的数据，可以代入流体仿真软件对打印过程进行仿真. 通过仿真可以预测打印行为，减少一些重复性实验，有助于以更少的材料进行打印，得到优化后的打印参数及打印结构[39-40]. 以满足Herschel-Bulkley模型的软材料为例，在数学模型中涉及输入（压强p）、边界条件（例如喷嘴的长度、内径、角度等）、材料属性（例如材料的屈服应力）及输出（体积流量qV）. 利用Herschel-Bulkley模型（见式（3）、（2）），可以得到微丝理论宽度、理论流量、相应的屈服应力等，代入流体仿真软件（如Fluent、Polyflow）进行分析，由此预测不同打印参数下的打印行为.

2. 挤压生物3D打印工艺参数

挤压打印不含细胞的生物相容性支架时，需要尽可能地提高结构打印精度. 当挤压打印包含细胞的生物墨水时，需要同时兼容细胞的生物活性与打印精度[41-42]. 挤压打印结构成型精度主要分为形状保持度（或者称为形状保真度）与打印分辨率. 形状保真度主要是指微丝或结构维持形状的能力，包括微丝（或结构）的塌陷程度、粗糙程度. 分辨率指生物墨水基于一系列工艺参数组合后能否达到所需要的极限精度. 基于课题组的前期研究及国内外的研究现状可知，影响形状保真度与打印分辨率的主要工艺参数分别为挤压生物打印模型结构设计、生物墨水流变特性、挤压生物打印设备及打印参数3个方面[43]. 对工艺参数进一步细分，如表1所示.

表 1   挤压生物3D打印参数及其效果

Tab.1  Effect and technological parameters of extrusion-based bioprinting

工艺参数 具体参数 效果
材料流变特性 黏度、屈服应力等 剪切速率的增加使黏度降低，表明材料具有剪切变稀行为；屈服应力可以抵抗重力或表面张力的变形.
模型设计 结构尺寸或形状 结构尺寸过于精细或形状复杂，使打印难度增加，对材料、设备的要求更高.
挤压生物打印设备及打印参数 X、Y、Z轴精度 影响喷嘴的实际移动距离.
温度控制 影响温敏材料的流变特性.
喷嘴长度、内径等 同规格圆锥形喷嘴打印微丝的均匀性比圆柱形好，内径小的喷嘴打印出来的微丝更细.
喷嘴移动速度 速度过慢可能导致材料堆积，增加喷嘴速度可在一定程度提高微丝均匀性.
挤出速度 材料挤出速度快或慢可能使微丝过粗或难以挤出.
层厚 增加层厚将减少打印时间，但可能增加结构的粗糙程度.
微丝走向 45°与90°走向结构稳定性不同.
喷嘴尖端距离基底高度 打印高度过高时，对直角的打印容易出现滞后现象.
基底材料 较高刚度的基底难以维持一些低黏度材料或任意形状的结构（例如下窄上宽结构）

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2.1. 挤压生物打印结构设计

通过计算机断层扫描（如CT扫描）和三维建模技术（如Solidworks软件）,可以得到生物组织器官的三维模型[44]. 模型的尺寸与孔径大小将影响结构的打印精度与细胞功能性. 生物3D打印的最终目的是构建具有功能化的生物组织，整体尺寸是根据实际需求构建的，不能为提高精度随意更改尺寸. 此处仅讨论模型内部的填充孔径对结构精度的影响.

孔径决定细胞的生理功能实现与打印精度. 孔径较大，易使结构产生塌陷. 孔径较小，不利于细胞正常生理功能的实现（当孔径小于细胞直径时，细胞难以在结构内部发生迁移，实现正常的生理活动）[18, 45-46] ，对分辨率的要求更高. Habib等[47]对由羧甲基纤维素与海藻酸钠的复合生物墨水进行塌陷实验，实验结果表明，随着距离的增加（从1 mm增加至6 mm），塌陷现象加剧（质量浓度为0.04 g/mL的海藻酸钠/质量浓度为0.01 g/mL的羧甲基纤维素在4 mm位置完全塌陷）. 虽然孔径较大，容易使结构发生塌陷，但当材料屈服应力足够大时，可以减小材料的塌陷程度. 当羧甲基纤维素的质量浓度由0.01 g/mL提升到0.04 g/mL时，屈服应力增加，微丝几乎不存在塌陷，更有利于分辨率的进一步提升. 3D打印的结构精度与模型的孔径、材料特性均存在直接关系，下节具体阐述材料特性.

2.2. 生物墨水流变特性

生物墨水流变特性描述了材料在外力作用下的变形和流动，是对打印精度及细胞活性影响最大的工艺参数[28]. 随着生物墨水流变特性的增强，结构稳定性随之提升，细胞活性随之下降；反之亦然（见图3（a））. 描述生物墨水的主要流变特性参数包括黏度、剪切变稀特性、屈服应力等[48- 49]，可以通过流变仪进行温度扫描、时间扫描、流动曲线扫描等测试，得到不同生物墨水相应的流变参数[50].

图 3

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图 3   生物墨水的流变特性

Fig.3   Rheological properties of bioinks


黏度是液体在压力作用下流动的阻力，主要由生物墨水的相对分子质量与浓度决定[51]. 提高黏度可以在一定程度上提高打印精度，但高黏度会导致切应力的增大，影响生物墨水中细胞的生物活性. Blaeser等[52]探究不同浓度海藻酸钠通过不同型号的喷嘴时，切应力对细胞活性的影响. 当切应力低于5 kPa时，细胞可以保持96%的细胞活力；当切应力增至10 kPa时，细胞仅剩76%的细胞活力. 此外，研究人员发现，当生物墨水的黏度低于100 Pa∙s时，材料流动性强，却难以维持形状. 黏度过低的生物墨水因流动性强，更难达到结构所需的分辨率. 当黏度高于104 Pa∙s时，面临难以顺利沉积的问题[29].

生物墨水的剪切变稀行为与黏度密切相关，剪切变稀特性可以显著降低挤压过程对细胞的损害，提升细胞存活率[47, 53]. 从打印过程来看，生物墨水通过喷嘴时经历高剪切变形，黏度下降使生物墨水可以顺利挤出. 在材料挤出后，剪切速率迅速下降且黏度上升，有效减缓打印结构的塌陷[54-56]. 从流变学角度来看，生物墨水的黏度随着剪切速率的增加而减小（见图3（b））.

描述材料流变特性的另一重要参数为屈服应力. 材料的屈服应力可以对抗重力或表面张力造成的变形，表现出材料的黏弹性行为，预测生物墨水在挤压后保持形状的程度. 在生物墨水不超过屈服强度的条件下，去除切应力后可以恢复原来的形状（产生弹性形变）. 在超过阈值（即屈服应力）后，材料会发生屈服，导致塑性形变（见图3（c））[57- 58]. 图中，G'为存储模量，G''为耗散模量. Paxton等[32]总结了常见材料的屈服应力，以供研究人员参考，质量分数为20%、25%、30%的poloxamer 407的屈服应力分别为93.6、227、348 Pa. 他们发现温敏性材料（海藻酸钠/明胶）的黏度随温度t而发生变化（见图3（d））. 基于流变测试所得的数据，可以采用1.1节所示的本构方程，判断材料在外力作用下的变形与流动.

生物3D打印通常须将细胞混入材料中进行打印，内嵌的细胞会对材料的流变特性产生影响（如黏度、屈服应力、存储模量等），从而间接影响打印精度[59-60]. 细胞占据水凝胶内部的部分体积，随着细胞浓度的增加,可能会阻碍或限制某些反应基团的接触，影响材料的流变性能和交联速率. Schwartz等[59]使用质量浓度为0.07 g/mL的明胶与肿瘤细胞，探索细胞密度对材料和打印性能的影响，发现当细胞密度大于5 × 107 mL−1时，材料的剪切变稀特性增强，影响打印精度. 当挤压打印包含细胞的生物墨水时，应关注细胞与生物墨水相互作用后的流变特性.

2.3. 挤压生物打印设备与打印参数

机器精度作为挤压生物3D打印系统的硬件条件，三轴精度及温度控制精度是影响打印结构精度的工艺参数. 三轴精度影响打印参数的实际效果，温度控制影响温敏性材料的流变特性与形状维持能力. 挤压生物3D打印机的三轴精度要求通常为5~100 μm[28]，现有的商业化挤压式3D打印机大多数已满足相应的三轴精度. 苏州EFL公司的BP6601、CELLINK公司的Bio x6与SUNP公司的BIOMAKER 4精度可以分别达到5、1、1 μm. 在温度控制方面，材料常用于4、20、37 ℃及少部分低温环境，现有商业化打印机拥有高低温喷头，可以满足基本使用条件. 除此之外，现有的商业化打印机开发出多喷头系统，以此满足复合材料与复合结构的打印需求.

在硬件条件满足的基础上，打印参数的设置是除材料特性以外研究较多的工艺参数. 打印参数涉及挤出速度、喷嘴尖端距离平台高度、喷嘴类型等多种变量（如表1所示），对打印结构精度与细胞活性都会产生较大的影响. 微丝作为打印结构的基本组成单元，研究人员常对微丝打印质量进行评价，选择合适的打印参数. 在此过程中，他们发现一些通用性规律.

董兰兰等[61]研究GelMA复合凝胶打印特性时发现，当挤出速度v低于8.64 mm/h时材料无法连续出丝，当速度高于13 mm/h时微丝宽度d增加到 (880.6± 52.3) μm，是喷嘴直径(400 μm，理论微丝宽度)的2倍（见图4（a））. 由此可以得出结论，挤压速度（或压强）过大易导致微丝宽度变大，挤压速度过小易导致材料堆积在喷嘴处或无法挤出材料[62-63]（在其余条件不变的情况下）. 该复合生物墨水在其余条件不变的情况下，更改速度都难以达到较高的分辨率，而更改喷嘴移动速度有助于提升分辨率.

图 4

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图 4   不同的打印参数测试

Fig.4   Test of different bioprinting parameters


本团队建立打印精度的评价公式，粗糙度系数RN越高，则打印精度越差[64]. 以打印质量浓度为0.01 g/mL的海藻酸钠/质量浓度为0.07 g/mL的明胶为例（喷嘴移动速度v1为6 mm/s），G25圆锥形喷嘴的RN为7.99%，G25圆柱形喷嘴的RN高达43.58%（见图4（b））. 图中，喷嘴尖端离打印平台的距离为0.2 mm，压强为100 kPa，交联时间为20 min. 就喷嘴型号而言，同尺寸的圆锥形喷嘴比圆柱形喷嘴的打印精度高. 对于同种类型的喷嘴而言，喷嘴尖端的内径越小，则挤出的微丝越细，但可能导致微丝断裂或无法挤出. 为了提高微丝挤出能力，则必须提高压强，由此可能导致切应力增加，使得细胞造成损害[14, 65]. 除此之外，喷嘴的长度与制造喷嘴的材料可能会对打印精度产生影响. 当喷嘴材料的粗糙度较高时，可能阻碍材料的流动，从而降低打印精度，但目前对相关方面的研究较少.

与喷嘴密切相关的另外2个参数是喷嘴的移动速度及其距离平台的高度. 顾恒等[62]打印GelMA复合凝胶时，喷嘴移动速度从 1 mm/s 提高到14 mm/s，挤出微丝的最大直径从 1 211.2 μm减小到333.8 μm. 当移动速度增加到 15 mm/s时，微丝直径约为293 μm（接近喷嘴内径200 μm），且开始出现微丝中断现象（见图4（c））. 图中， $\bar d $为线宽平均值. 他们发现当喷嘴距离平台的高度从185.92 μm增加至557.76 μm时，微丝宽度由 500.2 μm减小到 421.2 μm；若喷头高度继续增加，则出现断裂现象（见图4（d））. 图中，p为喷嘴宽度与挤出微丝直径的比例. 由此可知，当喷嘴的移动速度过小时，挤出的微丝宽度过大；在合适的范围内增大喷嘴移动速度，微丝宽度随着移动速度的增加而减小；当喷嘴移动速度过快时，可能导致材料断裂. 喷嘴尖端距离平台的高度规律与移动速度类似，存在一个阈值. 基于以往实验可知，当高度较大时，喷嘴可以顺利挤出微丝的移动速度阈值会下降.

在打印过程中，更改层厚与微丝走向可以获得更精确的孔径，如图5所示.当层厚恒定时，更高层的质量及打印过程中的压力波动会导致孔径发生变化[63, 66]. Cutolo等[67]研究发现，当CoCr支架层厚增大30 μm时，在不影响支架几何尺寸的情况下提高了10%的打印速度. Ruiz-cantu等[68]测试微丝沿45°与90°走向的孔径、孔隙率、模量等性能，结果表明，前者的平均孔径、压缩模量分别比后者高出361%与减小21.3%，影响了支架的结构稳定性. 合理的层厚及微丝走向将决定生物墨水的打印效果.

图 5

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图 5   实体模型结构设计所需考虑的因素

Fig.5   Considerations for solid model structural design


除了上述打印参数的影响以外，研究人员逐渐开始关注到材料所打印到的基底平台的参数设置. 传统挤压打印系统的基底是具有较高刚度的平台，但难以打印一些低黏度材料或任意形状的结构（例如下窄上宽结构）. 为了解决该问题，科研人员提出将微丝悬浮打印在低浓度微凝胶中的悬浮打印方法. 该方法具有结构不易塌陷、打印材料无脱水问题、可以实现任意方向打印等优势[69]. Hinton等[69]将低黏度的海藻酸钠在含有钙离子的微凝胶中打印成骨头、血管这些具有良好形状保真度的三维结构（见图6），而这在传统的平台上打印是具有难度的（不进行预交联的情况下）.

图 6

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图 6   悬浮打印的三维结构

Fig.6   Three-dimensional structures by fresh print


以上打印参数及其规律是研究人员通过长时间研究并通过控制变量所得到的. 这些工艺参数在打印过程中处于耦合关系，受到材料流变特性的影响. 若想得到最优打印参数，则可以先初步确定打印范围再进一步实验，以减小试验次数.

3. 打印精度定量评价方法

生物墨水为软材料，在挤压打印过程中受到温度、压力、喷嘴类型等工艺参数的影响，容易使打印结构出现打印精度和分辨率不足的情况. 为了得到具有较高精度的打印结构，国内外研究人员基于挤压打印原理和生物墨水特性提出相应的评价方法. 现有的打印精度评价方法包括机器学习、模拟仿真（如流体动力学仿真）及实验测试3种方式[70]. 机器学习作为人工智能的一个分支，可以基于以前的经验进行学习和预测，准确识别逐层生物打印中的异常. 研究人员在打印喷嘴一侧安装摄像头，通过摄像头捕捉每一层图像，作为机器学习工具的原始数据. 设定不连续（断裂现象）、粗糙（不光滑表面现象）、分辨率低（距离设定宽度差别较大）等为异常，机器学习可以识别异常并不断优化打印数据，如图7（a）所示[71-72]. 要使用机器学习进行判断，需要具有足够多的原始数据，才能更接近实际打印情况. 模拟仿真评价方法主要以CFD流体仿真为主. 将流变测试实验所获得的生物墨水特性代入数学模型，得到屈服应力、理论流量、微丝理论宽度等拟合数值. 将该公式与喷嘴实体模型作为流体仿真所使用的模型，可以模拟打印过程并获得合适的打印参数，如图7（b）所示[73-74].

图 7

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图 7   流体仿真与机器学习的测试结果

Fig.7   Test results of fluid simulation and machine learning


除了上述2种评价方法外，研究人员常使用一些定量评价方法对实验结果进行分析，得到合适的打印参数. 现有的定量评价方法是基于挤压生物打印原理和生物墨水特性提出来的. 通过实验对不同打印参数的打印结果进行测试，利用定量评价方法可以得到具有最优精度的工艺参数（比如压强、速度、温度等），促进打印结构精度的提升. 利用定量评价方法所进行的实验得到的参数，可以进一步修正基于数学模型和流体仿真所使用的公式，用于其余生物墨水的打印性能预测. 根据国际上现有定量打印精度评价方法的研究现状，按照评价公式中参数所涉及的维度进行分类，分析总结不同方法所存在的优缺点（所有定量测试方法在实验过程中至少测量3次取均值）.

3.1. 一维定量评价方法及特点

一维定量评价方法的操作简单且节约材料，常用来评价微丝的均匀性（或称为粗糙度）. Soltan等[75]将海藻酸钠/明胶生物墨水打印单层微丝，测量 $d$与理论长度 $D$，得到定量值：

$ U = \frac{{{d}}}{D}. $

若 $ U＞1 $，则表明微丝实际大于理论宽度；若 $U = 1$，则表明微丝达到理论宽度，如图8（a）所示. 通过测试，Soltan等[75]得到质量浓度为0.06 g/mL海藻酸钠/质量浓度为0.02 g/mL明胶配比的生物墨水在使用交联剂的情况下接近理论微丝宽度. 该方法给打印精度评价提供了一种简单、可行的思路，然而未考虑微丝不同位置宽度存在的误差.

图 8

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图 8   一维定量评价方法

Fig.8   Single-dimensional quantitative evaluation method


考虑微丝不同位置的宽度误差，笔者等[64]提出定量粗糙度的测定方法，如图8（b）所示. 打印单条微丝并测定微丝任意10个点的宽度，求取均值与方差，得到定量系数：

$ {R_{\rm{N}}} = \frac{{{W_{{\rm{SD}}}}}}{{{W_{\rm{m}}}}} \times 100{\text{%}} . $

若 ${R_{\rm{N}}} = 0$，则微丝表面光滑；若 ${R_{\rm{N}}} > 0$，则微丝表面粗糙. 实验结果表明，质量浓度为0.01 g/mL的海藻酸钠/质量浓度为0.07 g/mL的明胶材料的最小 ${R_{\rm{N}}}$（≈ 2.77%）远大于质量分数为25%的F127材料（≈ 0.4%），打印精度更低.

除了打印单层微丝评价均匀性以外，Bednarzig等[76]打印2层微丝，测量每条微丝宽度与2层微丝交叉处的最大弧度（见图8（c）），计算方法如下所示：

$ {U_{\rm{s}}} = {d_{\rm{c}}} - {d_{\rm{m}}}. $

$U_{\rm{s}} $越接近于0，则均匀性越好，表面微丝具有高形状保真度和良好的可堆叠性. 该方法综合考虑了塌陷度与形状保真度，但测量过程中最大弧度与微丝的宽度测量可能存在较大的人工误差.

研究人员不仅可以利用一维评价方法判断均匀性，而且针对塌陷程度进行测试. 董兰兰等[61]将纳米黏土、甲基纤维素、GelMA混合生物墨水打印成圆管结构，利用下式对打印过程中层与层之间的融合和塌陷程度进行测试：

$ {F_{\text{h}}} = \frac{{{h_{\rm{a}}}}}{{{h_{\rm{t}}}}} \times 100{\text{%}} . $

式中： ${h_{\rm{a}}}$和 ${h_{\rm{t}}}$分别为实际高度与理论高度. 测试得到所使用配比的材料的 ${F_{\text{h}}}$约为93%，基本无塌陷.

3.2. 二维定量评价方法及特点

二维定量评价方法作为常见的打印精度评价方法，Ouyang等[77]提出测定孔隙率的方法，示意图如图9（a）所示. 他们打印2层垂直的微丝，采用Image J软件分别测量打印完成后的每个孔实际周长 $L$和面积 $A$. 使用 $\Pr $这个定量系数表示打印精度，如下式所示：

图 9

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图 9   基于面积变化的评价方法

Fig.9   Evaluation method based on area change


$ \Pr = \frac{{{L^2}}}{{16A}}. $

若 $\Pr $< 1，则随着 $\Pr $的减小，凝胶程度降低；若 $\Pr = 1$，则为理论矩形形状；若 $\Pr > 1$，则随着 $\Pr $的增大，凝胶程度越高. 该方法被众多科研人员广泛应用，Distler等[78]采用该方法评价了由电活性聚吡咯（electroactive polypyrrole，PPy）修饰的生物墨水打印精度，0.1 g/moL PPy修饰的生物墨水（ $\Pr $≈1.04）接近理论形状，0.2 g/moL PPy修饰的生物墨水 $\Pr $下降. 该方法综合考虑了微丝宽度与塌陷情况，但可能需要消耗更多的材料.

He等[65]通过测量实际面积与理论面积的相对值判断打印精度（见图9（b）），计算方法如下所示:

$ \varphi = \frac{{{A_{{\rm{Rt}}}} - {A_{{{\rm{Re}}} }}}}{{{A_{{\rm{Rt}}}}}} \times 100{\text{%}} . $

式中： ${A_{{\rm{Rt}}}}$与 ${A_{{{\rm{Re}}} }}$分别为理论面积与实际面积. 打印精度越高，则φ越趋向于0. 基于该方法，Giuseppe等[79]采用不同的计算公式，对不同浓度的海藻酸钠-明胶材料打印质量进行评价，得到质量浓度为0.09 g/mL海藻酸钠/质量浓度为0.06 g/mL明胶的打印精度高达98.8%.

为了完善打印精度评价方法，Hazur等[80]介绍综合考虑2个方向的微丝宽度与均匀性的打印精度评价体系，如下所示：

$ \begin{split} & P = \\ & {{\left[ {\left| {\dfrac{1}{2} \left( {\dfrac{{{{\mathop L\limits^ - }_{{\rm{b}}x}}}}{{L_x}} + \dfrac{{{{\mathop L\limits^ - }_{{\rm{b}}y}}}}{{L_y}}} \right) - 1} \right|+1} \right]^{-1} \left[ {\dfrac{1}{2} \left( {\dfrac{{{\rm{S}}{{\rm{D}}_{{\rm{b}}x}}}}{{L_x}}+\dfrac{{{\rm{S}}{{\rm{D}}_{{\rm{b}}y}}}}{{L_y}}} \right) + 1} \right]^{-1}}}. \end{split} $

式中： ${{\mathop L\limits^ -} _{{\rm{b}}x}}$、 ${{\mathop L\limits^ -} _{{\rm{b}}y}}$分别为交联前沿x、y方向的测量长度均值， ${\rm{S}}{{\rm{D}}_{{\rm{b}}x}}$、 ${\rm{S}}{{\rm{D}}_{{\rm{b}}y}}$分别为交联前沿x、y方向的长度的标准差， $L_x$与 $L_y$分别为设定的长度. 该方法综合考虑2个方向微丝的均匀度与宽度，理想条件下 $P = 1$.

塌陷度作为打印精度的一个重要指标，Bednarzig等[76]通过测定截面比评价塌陷度（见图10（a）），计算方法如下所示：

图 10

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图 10   塌陷度二维评价方法

Fig.10   Evaluation method of double dimension collapse degree


$ w = \frac{{\sqrt 2 D}}{l} \times 100{\text{%}} . $

式中： $w$、 $l$分别为截面比、实际测量的对角线长度. $w$越接近于1，则可堆叠性越好. 研究人员常在一个支撑结构上打印单条微丝，判断微丝塌陷程度[81]. 在设定的理想条件下，微丝与间距构成矩形单元，面积为 $A_{\rm{a}}^{\rm{c}}$；当微丝存在塌陷情况时，与支撑柱形成圆弧，面积为 $A_{\rm{t}}^{\rm{c}}$，如图10（b）所示. 实际面积与理论面积相除，得到塌陷系数：

$ C_{\rm{f}} = \frac{{A_{\rm{t}}^{\rm{c}}}}{{A_{\rm{a}}^{\rm{c}}}} \times 100{\text{%}} . $

$ C_{\rm{f}} $越接近于1，则微丝越不容易产生塌陷现象.

3.3. 定量评价方法的总体特性分析

相比于前2种维度的定量评价方法，三维定量评价方法较少. 现有的三维定量评价方法是通过分别测量打印完成的三维结构X、Y、Z方向实际长度，与理论长度比较[70]. 实际长度与设计长度的比例越接近于1，打印精度越好. 对以上3种不同维度的评价方法的优缺点进行比较，如表2所示.

表 2   不同维度的定量评价方法比较

Tab.2  Comparison of quantitative evaluation methods in different dimensions

维度 具体评价方法 优点 缺点 评价标准
一维 式（6） 直接判断微丝宽度是否符合理论宽度 未考虑微丝不同位置宽度存在的误差 精细度
式（7） 考虑微丝不同位置、宽度相对误差 未涉及微丝的精细程度，比如宽度 粗糙度
式（8） 同时考虑塌陷度与形状保真度 测量过程中最大弧度与微丝的宽度测量可能
存在较大的人工误差 		塌陷度与粗糙度
式（9） 用简单可行的方法判断塌陷程度 材料耗费较多，且未考虑粗糙度 塌陷度
二维 式（10） 综合考虑微丝宽度与塌陷情况 未考虑微丝的粗糙程度且消耗较多的材料 塌陷度与精细度
式（11） 综合考虑微丝宽度与塌陷情况 未考虑微丝的粗糙程度且消耗较多的材料 塌陷度与精细度
式（12） 综合考虑微丝2个方向的粗糙度与宽度 在可能存在宽度过大但均匀、宽度接近理论宽度但粗糙
这2种情况下得到的P相等 		粗糙度与精细度
式（13） 仅使用2层微丝即可判断塌陷程度 实际对角线位置的判断可能误差大 塌陷度
式（14） 仅使用1条微丝对塌陷程度进行判断 测量实际面积困难较大，易出现误差 塌陷度
三维 式（15） 测量整体结构的塌陷度与精细度 未考虑不同位置的粗糙度且材料耗费过多 精细度与塌陷度

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通过归纳总结现有的定量打印精度评价方法，可以发现这些评价方法存在以下特点.

1）随着维度的增大，评价方法考虑的参数更加全面. 消耗的材料可能随之增多，一些价格昂贵的材料（如基质胶）难以进行大批量实验.

2）打印精度评价方法具有普适性，但所得到的打印规律大多数基于特定材料，导致规律不具有普适性. 此类研究方法存在于表象学研究.

现有的大多数评价方法较难做到全面评价打印精度，在进行打印精度评价时可以考虑多维度联合评价. 为了节省材料，选择一维评价方法得到接近理论微丝宽度与均匀性的可打印参数范围. 使用二维评价方法测定塌陷度，缩小可打印域. 基于可打印域打印具有一定高度且含有细胞的打印结构，得到合适的打印参数，看能否达到所需的分辨率.

4. 结　语

挤压生物3D打印技术因材料适用范围广泛、价格低廉、可打印复杂结构等独特优势，被科研人员广泛应用于皮肤、神经、血管等方面的研究. 为了构建高精度的打印结构，本文对挤压生物打印技术原理及打印过程中的数学模型进行阐述，分析影响打印精度的工艺参数及作用. 针对国际上现有的定量打印精度评价方法，按照维度进行归纳总结，分析不同方法的优缺点.

在挤压生物打印领域，获得高形状保真度和高分辨率的结构以模拟和接近天然组织一直是许多研究人员关注的主要焦点. 现在对打印精度测试与提高的通用做法是采用实验科学的方法进行，但这将消耗科研人员大量的研究时间与实验材料[28]. 本文从以下几个方面提出一些可能进一步提升打印结构精度的研究思路.

（1）使用机器学习的方法对材料属性进行预测，缩短实验时间并减小实验误差. 在打印过程中，联合理论模型和机器学习，实现打印精度的实时智能自反馈控制.

（2）探究材料宏-微观的物理-化学特性对精细度、塌陷度以及分辨率的定量影响，利用原位流变、实时显微成像方法实时测定或观察打印过程中材料的机械特性及内含细胞的形态变化，使评价方法具有深层的理论依据.

（3）扩充生物墨水库并进行分类，形成同种分类材料的打印精度普适性分析方法及不同分类材料的评价方法自动选择. 在此基础上，借助大数据形成面向用户需求的材料快速筛选和推荐系统.

（4）影响打印精度的主要原因在于材料的流动行为及重力、表面张力等，可引入新的策略抵消这些力的作用[28]. 例如，添加增稠剂提高材料的存储模量与屈服应力，使用悬浮打印方式[69]抵消重力产生的影响. 对于一些低黏度或机械性能差的材料，使用同轴打印方式[43]或使用牺牲材料提供支架，实现间接打印[82]. 通过这种方式，可以在一定程度上解决分辨率不足与结构易塌陷的问题.

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