浙江大学学报(工学版), 2021, 55(6): 1168-1174 doi: 10.3785/j.issn.1008-973X.2021.06.018

电气工程

高压纳秒脉冲电场消融黑色素瘤细胞实验研究

马振宏,, 刘振,, 殷胜勇, 马榕蔚, 闫克平

1. 浙江大学 工业生态与环境研究所,浙江 杭州 310027

2. 浙江大学 医学院附属第一医院,浙江 杭州 310007

Experimental study on melanoma cell ablation by high-voltage nanosecond pulsed electric field

MA Zhen-hong,, LIU Zhen,, YIN Sheng-yong, MA Rong-wei, YAN Ke-ping

1. Institute of Industrial Ecology and Environment, Zhejiang University, Hangzhou 310027, China

2. The First Affiliated Hospital, School of Medicine, Zhejiang University, Hangzhou 310007, China

通讯作者: 刘振,男,副教授. orcid.org/0000-0002-5268-1018. E-mail: zliu@zju.edu.cn

收稿日期: 2020-06-4  

基金资助: 国家自然科学基金资助项目(81971768);国家科技重大专项资助项目(2018ZX10301201-006-001);中国博士后科学基金资助项目(2018M642437)

Received: 2020-06-4  

Fund supported: 国家自然科学基金资助项目(81971768);国家科技重大专项资助项目(2018ZX10301201-006-001);中国博士后科学基金资助项目(2018M642437)

作者简介 About authors

马振宏(1994—),男,硕士生,从事脉冲电场生物医学应用的研究.orcid.org/0000-0003-0266-9915.E-mail:815093280@qq.com , E-mail:815093280@qq.com

摘要

为了研究高压纳秒脉冲电场(nsPEF)消融恶性肿瘤的关键影响参数,基于火花开关和传输线变压器(TLT)技术,自主研制重频高压纳秒脉冲电场(RnsPEF)发生系统,可以稳定输出纳秒级脉宽的指数脉冲,证实了高压纳秒脉冲电场杀伤肿瘤细胞的效果和可控性. 以贴壁生长于六孔板中B16黑色素瘤细胞为对象,研究脉冲次数、峰值电压、重复频率和电极针对间距对肿瘤细胞消融效果的影响. 以电极杯中B16肿瘤细胞悬液为研究对象,结合CCK-8检测法开展脉冲处理后细胞活性的研究. 结果发现,高压脉冲电场和脉冲能量注入密度是影响纳秒脉冲电场消融肿瘤细胞的关键因素,重复频率对消融效果的影响不大. 结果显示,自制RnsPEF系统消融B16肿瘤细胞的阈值电场强度为6.8 kV/cm,注入能量密度的阈值为11.4 J/cm3和最佳消融次数为500次脉冲.

关键词: 纳秒脉冲电场(nsPEF) ; 指数脉冲 ; 火花开关 ; 传输线变压器(TLT) ; B16肿瘤细胞 ; 肿瘤消融 ; 细胞活性

Abstract

A repetitive high-voltage nanosecond pulsed electric field (RnsPEF) generation system was independently developed based on the spark switch and transmission line transformer (TLT) technology in order to analyze the key impact parameters of the process of malignant tumors ablation by high-voltage nanosecond pulsed electric field (nsPEF). The system can stably generate nanosecond exponential pulse. The experimental results proved the effectivity and controllability of RnsPEF on tumor cells ablation. B16 melanoma cells adherently seeded in six-well plates as the research object to analyze the effects of pulse number, peak voltage, repetition frequency and electrode spacing on tumor cells ablation. Cell counting kit-8 (CCK-8) was applied to measure cell viability of B16 tumor cells suspension in the cuvette after treated by pulses. The experimental results show that the pulsed electric field intensity and injected energy density of the applied RnsPEF play the key roles in determining the ablation effect. The repetition frequency hardly affects the ablation results. The pulsed electric field intensity threshold of RnsPEF ablating B16 melanoma cells is 6.8 kV/cm, and the injected energy density threshold is 11.4 J/cm3, as well as the optimal pulse number is 500 pulses.

Keywords: nanosecond pulsed electric field (nsPEF) ; exponential pulse ; spark switch ; transmission line transformer (TLT) ; B16 tumor cell ; tumor ablation ; cell viability

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本文引用格式

马振宏, 刘振, 殷胜勇, 马榕蔚, 闫克平. 高压纳秒脉冲电场消融黑色素瘤细胞实验研究. 浙江大学学报(工学版)[J], 2021, 55(6): 1168-1174 doi:10.3785/j.issn.1008-973X.2021.06.018

MA Zhen-hong, LIU Zhen, YIN Sheng-yong, MA Rong-wei, YAN Ke-ping. Experimental study on melanoma cell ablation by high-voltage nanosecond pulsed electric field. Journal of Zhejiang University(Engineering Science)[J], 2021, 55(6): 1168-1174 doi:10.3785/j.issn.1008-973X.2021.06.018

目前,癌症是人类死亡的主要原因之一. 根据世界卫生组织的最新统计[1]可知,全球2018年预估有900多万人死于癌症. 迄今为止,虽然多种治疗癌症方法已经形成并成功在临床中得到应用,如手术治疗、放射治疗、化疗、热消融和冷冻消融等,但是尚未有一种方法或者化学药物能够适用于所有恶性肿瘤的治疗. 继续寻找新的有效治疗恶性肿瘤且安全可靠的手段刻不容缓.

近年来,随着电场在生物效应方面理论和技术的不断更新和发展,脉冲电场(PEF)逐渐成为生物医学领域的研究热点. 其中电穿孔疗法(reversible electroporation, RE)[2]和不可逆电穿孔(irreversible electroporation, IRE)[3-4]已经成功应用于临床治疗,在肿瘤消融方面表现出效率高、效果好、毒性小和适用范围广等优势[5-7]. 尤其IRE应用高强度微秒电脉冲,诱导细胞质膜产生不可逆穿孔[8],不借助化学药物可以致使目标肿瘤组织坏死或凋亡. 由于IRE电脉冲的持续时间短,在清除肿瘤组织的同时不会造成热损伤,可以保留重要的结构,例如血管、胆管和神经束等. 这种非热消融方式在姑息治疗肝癌、胰腺癌、前列腺癌和结肠癌等方面获得临床应用[9-13].

在细胞膜不可逆电穿孔技术采用的微秒电脉冲的基础上,纳秒脉冲电场(nsPEF)能够降低输入能量来实现肿瘤消融,可望成为临床应用中的新一代非热肿瘤消融技术. 目前,Wang等[14-15]的研究结果表明,纳秒脉冲电场消融肿瘤有一些新的优势,其中大多数试验研究所用的nsPEF基于Blumlein传输线产生的方波脉冲. 根据以往的报道[16-17]可知,由RC电路产生的指数脉冲被证实可用于消融恶性肿瘤,这为研制安全、有效的肿瘤治疗装置提供了新思想.

基于火花开关和传输线变压器(TLT)技术自制重频高压纳秒脉冲(RnsPEF)发生系统,可以稳定输出指数衰减型纳秒级电脉冲,用于证实其消融效果和可控性. 为了研究RnsPEF系统消融肿瘤细胞的关键参数,本文以B16黑色素瘤细胞为研究对象,研究RnsPEF系统的基本参数对肿瘤细胞消融效果的影响规律,确定了阈值电场强度、注入能量密度阈值和最佳脉冲次数. 本文的科研成果可以为RnsPEF系统治疗肿瘤细胞的参数选择和优化提供依据,从而实现高效治疗恶性肿瘤,为实验室的细胞效应向研究应用转化提供了可能.

1. 材料与方法

1.1. 实验流程

图1所示为用于物性参数测量、B16肿瘤细胞体外消融实验的实验流程图. 图1主要包括4个部分:初级微秒脉冲充电电源(A)、纳秒脉冲发生装置(B)、电学参数测量部分(C)以及脉冲处理单元(D).

图 1

图 1   B16肿瘤细胞体外消融实验流程图

Fig.1   Experimental flow chart for B16 tumor cells ablation in vitro


1.2. 实验设备
1.2.1. 重频高压纳秒脉冲发生系统

试验所用的RnsPEF系统由闫克平课题组自主研制. 该系统主要包括2个部分:初级微秒充电电源和纳秒脉冲发生装置,实物图如图2所示. 如图2(a)所示,基于全固态器件的初级微秒脉冲充电电源可以通过调节半导体开关MOSFET的宽度和导通顺序,控制工作电压和重复频率. 如图2(b)所示,纳秒脉冲发生装置主要由高压电容CH、火花开关和两级TLT同轴电缆构成. 如图3所示,火花开关整体呈圆柱形,高220 mm,底面直径为94 mm,采用3个电极、2个间隙的结构,直径均为15 mm,2个间隙大小相同,间隙距离为2 mm,间隙不需吹气,重复频率可达100次脉冲/s (pps, pulses per second). 2级TLT同轴电缆输入端和输出端均采用并联,电路示意图如图4所示. 电缆型号为R223,线长为1.5 m,特性阻抗Z0=50 Ω,因此输入端和输出端阻抗均为25 Ω.

图 2

图 2   RnsPEF发生系统

Fig.2   RnsPEF generation system


图 3

图 3   火花开关剖面图

Fig.3   Profile of spark switch


图 4

图 4   传输线变压器示意图

Fig.4   Schematic diagram of transmission line transformer


1.2.2. 用于传输脉冲的电极针对和电极杯

试验采用电极针对和电极杯,分别处理贴壁细胞和细胞悬液.

1)高压脉冲电场处理贴壁于六孔板底部B16的肿瘤细胞时,采用自制的二电极针结构,如图5所示. 电极针材料选择生物医学304不锈钢,用厚度为0.2 mm、内径与电极针直径匹配的特氟龙管作为绝缘外套. 脉冲处理时,电极针对平行且中心对称放置,由2块亚克力平板固定,万向机械表座支撑,如图5所示.

图5(a)所示,电极针对尺寸配置可以描述为E[Φ, D, L],其中Φ为针的直径,D为2个电极中心之间的距离,L为电极针从特氟龙管中暴露的前端长度.

2)处理B16细胞悬液时,采用如图5所示含有2块平行铝板电极的电极杯结构,电极间距d=0.4 cm. 脉冲处理时,电极杯通过一底座与RnsPEF系统输出端连接,如图5所示.

图 5

图 5   用于脉冲处理的电极针对和电极杯

Fig.5   Electrodes and cuvette for pulse processing


1.2.3. 电压电流输出波形

采用脉冲处理贴壁细胞或细胞悬液时,所用的细胞培养液由4 ℃新鲜DMEM培养液和浓度为290 nmol/L的甘露醇溶液按1∶3的体积比混合配制而成,此时电导率为3.7 S/m,阻抗远大于TLT输出阻抗. 由于TLT输出阻抗和负载不匹配,与CH的充电电压相比,在负载上获得的峰值电压将近增加1倍[18]. 如图6所示为CH上充电电压为9.5 kV时的电压u和电流i的输出波形. 其中电压波形峰值电压VP约为20 kV,主脉冲上升沿约为15 ns,脉宽约为30 ns,整个波形半高脉宽(FWHM)约为500 ns. 电流波形趋势与电压波形一致,峰值电流为60 A. 单脉冲能量为

$W = \int_0^T {ui{\rm{d}}t} .$

式中: $W$为单次脉冲能量, $u$为电压, $i$为电流, $T$为周期. 利用式(1)计算得到W为77.9 mJ.

图 6

图 6   电压电流波形图

Fig.6   Voltage and current waveforms


1.3. 实验材料

细胞培养:B16黑色素瘤细胞由浙江大学第一附属医院提供. 在无菌条件下,将B16肿瘤细胞接种在DMEM培养基(Gibco-Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)中,培养液中含有10%胎牛血清(V/V, FBS, SAFC biosciences, Lenexa, KS, USA)和100单位/mL青霉素和0.1 mg/mL链霉素(Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA). 在37 ℃、体积分数为5% 的CO2培养箱中培养,每天换液,隔48~72 h进行一次传代培养. 取对数生长期细胞,经质量分数为0.25%的胰蛋白酶(Gibco-Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)消化,离心,重悬,制成浓度为1.6×105 cells/mL的细胞悬液. 将细胞悬液接种在含有培养基的六孔板中,每孔加1 mL细胞悬液,待肿瘤细胞贴壁生长至六孔板底面,融合度达到90%,备用. 将1 mL细胞悬液添加至电极杯中,待脉冲处理.

1.4. 实验方法
1.4.1. RnsPEF脉冲处理

通过控制变量实验方法,研究RnsPEF系统工艺参数,如峰值电压、脉冲次数、重复频率、电极针间距及注入能量密度对贴壁生长于六孔板中B16肿瘤细胞消融效果的影响. 分别采用不同电场强度和脉冲次数的电脉冲,处理电极杯中的细胞悬液,设置对照组,用CCK-8试剂检测细胞相对活性. 其中电场强度为

$E = {{{V_{\rm{P}}}}}/{{{d}}}.$

式中: ${V_{\rm{P}}}$为峰值电压,d为电极杯两铝板电极间距.

1.4.2. 苏木素伊红(HE)染色法

脉冲处理后,采用质量分数为70%的乙醇溶液洗涤3次. 用质量分数为4%的多聚甲醛溶液固定15 min,用清水洗涤3次. 添加苏木素染色液染色5~10 min,弃去苏木素染色液,用清水洗涤一次. 添加伊红染色溶液染色1 min. 染色后的结果经扫描呈现. 消融区域面积可以用ImageJ软件测量.

1.4.3. CCK-8检测细胞活性

各组肿瘤细胞悬液经脉冲处理后,分别取50 μL,接种于含有50 μL培养液的96孔板中,每组设置5个复孔,设置空白组,空白组仅含有新鲜培养液. 在二氧化碳培养箱培养24 h后,每孔添加10 μL CCK-8(Dojindo, Kumamoto, Japan),继续在37 ℃、体积分数为5%的CO2的条件下培养2 h,利用酶联免疫检测仪在450 nm波长下检测各孔吸光度(OD). 肿瘤细胞相对活性为

${V_{\rm{C}}} = \frac{{{{\rm{OD}}_{\rm{T}}} - {{\rm{OD}}_{\rm{B}}}}}{{{{\rm{OD}}_{\rm{C}}} - {{\rm{OD}}_{\rm{B}}}}}.$

式中: ${{\rm{OD}}_{\rm{T}}}$${{\rm{OD}}_{\rm{C}}}$${{\rm{OD}}_{\rm{B}}}$分别为实验组、对照组和空白组的吸光度.

2. 结果及讨论

2.1. RnsPEF系统工艺参数对贴壁B16肿瘤细胞消融效果的影响

2.1.1. 脉冲次数的影响

控制重复频率为10 pps,电极针对E[0.5,10,10],当峰值电压为20和28 kV时,不同脉冲次数处理后,B16肿瘤细胞经HE染色后如图7所示. 图中,脉冲处理后仍然存活的细胞会继续贴壁生长,HE染色后呈紫红色的区域为未消融区域;坏死或凋亡的细胞会从六孔板底壁脱离,HE染色后呈椭圆形空白的区域为消融区域. 用消融区域面积可以表示RnsPEF系统的消融肿瘤效果. 从图7可知,消融区域形状接近椭圆,边界清晰,内部无残留肿瘤细胞,可见该RnsPEF系统对B16肿瘤细胞具有较好的治疗效果. 利用ImageJ软件测量图7中的消融区域面积,得到不同脉冲次数n与消融面积S的关系曲线,如图8所示. 在5组平行实验中,在500次脉冲之前,脉冲次数增加,有效处理时间增加,注入能量密度随之增大,B16肿瘤细胞消融面积呈明显上升的趋势. 当脉冲次数约为500次脉冲时,达到相应条件下的最大消融范围,此时RnsPEF系统的能量效率最高. 在500次脉冲之后,增加脉冲次数对消融面积的影响甚微,这是因为RnsPEF消融肿瘤细胞主要基于电效应而非热效应,在峰值电压和电极针对配置固定的情况下,电场强度分布已经确定,由于RnsPEF系统消融肿瘤细胞阈值电场强度的存在,消融面积存在最大值.

图 7

图 7   不同脉冲次数处理后RnsPEF系统的消融效果(重复频率为10 pps、电极针对配置E[0.5,10,10])

Fig.7   Ablation effect of RnsPEF system under different pulse numbers (repetition frequency is 10 pps, electrodes E[0.5,10,10])


图 8

图 8   不同脉冲次数处理后RnsPEF系统的消融面积(重复频率为10 pps、电极针对E[0.5,10,10])

Fig.8   Ablation area of RnsPEF system under different pulse numbers (repetition frequency is 10 pps, electrodes E[0.5,10,10])


由此可见,脉冲次数为RnsPEF系统消融B16肿瘤细胞的重要因素之一. 当脉冲次数为500次脉冲时,RnsPEF系统消融B16肿瘤细胞的效益最高.

2.1.2. 峰值电压的影响

基于2.1.1节的实验结果,处理贴壁B16肿瘤细胞实验的脉冲次数均选择500次脉冲. 研究重复频率为10 pps,电极针对配置E[0.5,10,10]的条件下,峰值电压对B16肿瘤细胞消融效果的影响如图9所示. 可知,随着VP的增大,S增大. 由此可见,峰值电压是影响RnsPEF系统消融肿瘤细胞的关键因素,当峰值电压增大时,注入能量密度随着脉冲电场强度的增大而增大,RnsPEF系统杀伤B16肿瘤细胞的能力增强,因此消融范围增大.

图 9

图 9   不同峰值电压处理后RnsPEF系统的消融面积(重复频率为10 pps,脉冲次数为500次脉冲,电极针对E[0.5,10,10])

Fig.9   Ablation area of RnsPEF system under different peak voltages (repetition frequency is 10 pps, pulse number is 500 pulses, electrodes E[0.5,10,10])


2.1.3. 重复频率的影响

与峰值电压实验类似,在固定电极针对配置和峰值电压的条件下,研究不同重复频率对B16肿瘤细胞消融效果的影响,结果如图10所示. 可以看出,在电场强度和有效作用时间固定的情况下,重频频率从5 pps变化到25 pps,B16消融面积的变化很小. 重复频率的变化不影响注入能量密度,所以对肿瘤细胞的消融效果不会有太大的影响.

图 10

图 10   不同频率处理后的RnsPEF消融效果(峰值电压为26 kV、脉冲次数为500次脉冲、电极针对配置E[1.0,12,10])

Fig.10   Ablation effect of RnsPEF system under different repetition frequency (peak voltage is 26 kV, pulse number is 500 pulses, electrodes E[1.0,12,10])


2.1.4. 电极针对间距的影响

除了研究RnsPEF系统工艺参数对消融效果的影响外,还开展了不同尺寸配置的电极针对如何影响消融效果的实验研究. 控制峰值电压和重复频率不变,电极针暴露端长度L=10 mm,如图11所示为不同电极针对间距D下B16肿瘤细胞消融后的HE染色图. 如图11所示,随着电极针间距从10 mm变化到20 mm,消融区域先是由椭圆变化为哑铃形,再由哑铃形逐渐变化成2个独立的圆. 如图12所示,当D=16 mm时,最大消融面积S分别为215.3 mm2(Φ=0.5 mm)和179.3 mm2(Φ=1.0 mm). 由此可见,电极针对间距的改变,会改变电场强度的分布,从而间接改变消融区域的面积和形状. 选择合适的峰值电压和电极针对参数组合,RnsPEF系统可以应用于不同形状肿瘤组织的消融.

图 11

图 11   不同间距电极针处理后RnsPEF系统的消融效果(重复频率为10 pps,峰值电压为26 kV,脉冲次数为500次脉冲)

Fig.11   Ablation effect of RnsPEF system under electrodes with different spacings (repetition frequency is 10 pps, peak voltage is 26 kV, pulse number is 500 pulses)


图 12

图 12   不同间距电极针处理后的RnsPEF系统消融面积(重复频率为10 pps,峰值电压为26 kV,脉冲次数为500次脉冲)

Fig.12   Ablation area of RnsPEF system under electrodes with different spacings (repetition frequency is 10 pps, peak voltage is 26 kV, pulse number is 500 pulses)


2.1.5. B16肿瘤细胞消融效果分析

本文实验中,脉冲处理前混合培养液温度为4 ℃,室温为24 ℃,如图13所示为由FLIR热成像仪记录的1组实验脉冲处理后培养液温度分布情况(峰值电压为28 kV,频率为10 pps,脉冲次数800次脉冲). 其中对照组未经脉冲处理,如图13(a)所示为可见图像,如图13(b)所示为对应的热成像图. 可以看出,脉冲处理后培养液温度最高为18.6 ℃,因此实验中可以忽略温度过高对B16肿瘤细胞带来的热损伤. 由此可见,高压脉冲电场是影响肿瘤消融效果的主要因素. 基于2.1.2节和2.1.4节的结果可以看出,峰值电压和电极针对会改变电场强度的分布,对B16肿瘤细胞的消融效果影响很大. 脉冲次数直接影响有效作用时间,是影响消融效果的重要因素. 重复频率对B16肿瘤细胞的消融效果几乎没有影响.

图 13

图 13   脉冲处理后培养液的温度分布(重复频率为10 pps,峰值电压为28 kV,脉冲次数为800次脉冲)

Fig.13   Temperature distribution of culture medium after pulse treatment (repetition frequency is 10 pps, peak voltage is 28 kV, pulse number is 800 pulses)


目前,关于脉冲电场消融肿瘤细胞的机理假说,以电崩解和电穿孔为主流[19-20]. 基于这2种机理假说可知,影响RnsPEF系统消融肿瘤细胞效果的关键参数是脉冲电场强度和有效作用时间,即脉冲次数. 能量密度的计算公式为

$Q = \sigma {E^2} \left( {n\tau } \right).$

式中: $Q$为脉冲注入能量密度, $\sigma $为电导率, $E$为电场强度,n为脉冲次数, $\tau $为单次脉冲有效作用时间.

式(4)中,除有效作用时间 ${n\tau }$和电场强度的影响因素外,还有一个影响因素为电导率,取决于肿瘤组织本身的性质,Wang等[14, 21-22]的研究表明不同种类细胞对脉冲电场的敏感性不同. 由此可知,脉冲电场强度和注入能量密度是影响RnsPEF系统消融肿瘤效果的根本因素. 若要使肿瘤细胞坏死或凋亡,需要满足以下条件:

$E \geqslant {E_{\rm{V}}},$

$Q \geqslant {Q_{\min }}.$

式中: $E$为肿瘤细胞处分布的电场强度, ${E_{\rm{V}}}$为RnsPEF系统消融肿瘤细胞的阈值电场强度, ${Q_{\min }}$为消融肿瘤细胞的能量密度阈值.

从式(4)可以看出,当RnsPEF系统稳定输出纳秒电脉冲( $E$$\tau $不变)消融确定肿瘤组织( $\sigma $不变)时,脉冲注入能量密度与 $n$正相关. 结合式(6)可知,存在最优脉冲次数,使得RnsPEF系统消融目标肿瘤细胞的能量效率最高.

2.2. 脉冲处理后B16肿瘤细胞的相对活性

通过上述实验发现,基于消融阈值电场强度,选择合适的峰值电压和电极针对参数组合,RnsPEF可以在较少损伤正常组织的情况下完成治疗,且阈值电场强度的确定可以为临床中已知形状和大小的肿瘤参数选择和优化提供依据. 通过CCK-8试剂检测细胞活性法,开展相关研究. 结果如图14所示,重复频率为10 pps,脉冲次数为500次脉冲,分别以E为3.6、4.5、5.9、6.8、7.8和8.6 kV/cm的电脉冲处理后,电极杯细胞悬液中的肿瘤细胞相对活性VC为93.5%、72.8%、66.8%、19.3%、6.3%和8.8%. 由于酶活性不会降至0,一般对于CCK-8检测法,24 h后细胞相对活性测量值小于20%时,可以认为细胞活性受到抑制[14-15]. 当脉冲电场强度从5.9 kV/cm变化到6.8 kV/cm时,肿瘤细胞的相对活性出现骤降,该现象与阈值电场强度的含义基本一致. RnsPEF系统消融B16肿瘤细胞阈值电场强度为5.9~6.8 kV/cm. 在肿瘤治疗过程中,为了确保消融完全,将6.8 kV/cm视为阈值电场强度,对RnsPEF系统肿瘤治疗参数的选择和优化具有指导性意义.

图 14

图 14   不同电场强度处理后的B16肿瘤细胞活性(重复频率为10 pps,脉冲次数为500次脉冲)

Fig.14   Cell viability of B16 tumor cells under different electric field intensity (repetition frequency is 10 pps, pulse number is 500 pulses)


为了验证最优脉冲次数和确定RnsPEF系统消融B16肿瘤细胞时需注入的能量密度阈值. 基于上述结果,控制电场强度为6.8 kV/cm,对电极杯中的细胞悬液分别施加不同次数的电脉冲,实验结果如图15所示. 当n从200次脉冲递增至600次脉冲时,VC分别为86.3%、56.4%、24.3%、6.3%和5.1%. 由此可见,当脉冲次数为500次脉冲时,肿瘤细胞活性降至6.3%,基本上全部死亡. 在阈值电场强度下,RnsPEF系统消融B16肿瘤细胞时的最优脉冲次数为500次脉冲. 此时,对应的注入能量密度阈值可由式(4)计算,约为11.4 J/cm3.

图 15

图 15   不同脉冲次数处理后的B16肿瘤细胞活性(重复频率为10 pps,电场强度为6.8 kV/cm)

Fig.15   Cell viability of B16 tumor cells under different pulse number (repetition frequency is 10 pps, electric field intensity is 6.8 kV/cm)


3. 结 论

(1)介绍基于火花开关和TLT技术的新型重频高压纳秒脉冲(RnsPEF)发生系统,可以稳定输出脉宽为ns级的指数脉冲,证实了高压纳秒脉冲电场消融肿瘤细胞的效果和可控性.

(2)基于脉冲处理贴壁生长于六孔板中B16黑色素瘤细胞的实验结果,发现脉冲电场强度和注入能量密度是影响RnsPEF系统消融效果的关键因素. 重复频率对消融效果的影响不大.

(3)通过分析CCK-8试剂检测RnsPEF系统脉冲处理后肿瘤细胞活性的实验结果发现,RnsPEF系统消融B16肿瘤细胞所需的电场强度阈值为6.8 kV/cm,注入能量密度阈值为11.4 J/cm3,最优脉冲次数为500次脉冲.

参考文献

BRAY F, FERLAY J, SOERJOMATARAM I, et al

Global cancer statistics 2018: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries

[J]. CA: A Cancer Journal for Clinicians, 2018, 68 (6): 394- 424

DOI:10.3322/caac.21492      [本文引用: 1]

WEAVER J C

Electroporation of cells and tissues

[J]. IEEE Transactions on Plasma Science, 2000, 28 (1): 24- 33

DOI:10.1109/27.842820      [本文引用: 1]

RUBINSKY B

Irreversible electroporation in medicine

[J]. Technology in Cancer Research and Treatment, 2016, 6 (4): 255- 260

URL     [本文引用: 1]

ESSER A, SMITH K, GOWRISHANKAR T, et al

Towards solid tumor treatment by irreversible electroporation: intrinsic redistribution of fields and currents in tissue

[J]. Technology in Cancer Research and Treatment, 2007, 6 (4): 261- 274

DOI:10.1177/153303460700600402      [本文引用: 1]

MIKLAVCIC D, SERSA G, BRECELJ E, et al

Electrochemotherapy: technological advancements for efficient electroporation-based treatment of internal tumors

[J]. Medical and Biological Engineering and Computing, 2012, 50 (12): 1213- 1225

DOI:10.1007/s11517-012-0991-8      [本文引用: 1]

HABERL S, MIKLAVCIC D, SERSA G, et al

Cell membrane electroporation-Part 2: the applications

[J]. IEEE Electrical Insulation Magazine, 2013, 29 (1): 29- 37

DOI:10.1109/MEI.2013.6410537     

ZAGER Y, KAIN D, LANDA N, et al

Optimization of irreversible electroporation protocols for in-vivo myocardial decellularization

[J]. Plos One, 2016, 11 (11): e0165475

DOI:10.1371/journal.pone.0165475      [本文引用: 1]

VROOMEN L G P H, PETRE E N, CORNELIS F H, et al

Irreversible electroporation and thermal ablation of tumors in the liver, lung, kidney and bone: what are the differences?

[J]. Diagnostic and Interventional Imaging, 2017, 98 (9): 609- 617

DOI:10.1016/j.diii.2017.07.007      [本文引用: 1]

SILK M T, WIMMER T, LEE K S, et al

Percutaneous ablation of peribiliary tumors with irreversible electroporation

[J]. Journal of Vascular and Interventional Radiology, 2014, 25 (1): 112- 118

DOI:10.1016/j.jvir.2013.10.012      [本文引用: 1]

MARTIN R C G, KWON D, CHALIKONDA S, et al

Treatment of 200 locally advanced (stage Ⅲ) pancreatic adenocarcinoma patients with irreversible electroporation

[J]. Annals of Surgery, 2015, 262 (3): 486- 494

DOI:10.1097/SLA.0000000000001441     

GIRELLI R, FRIGERIO I, GIARDINO A

Results of 100 pancreatic radiofrequency ablations in the context of a multimodal strategy for stage III ductal adenocarcinoma

[J]. Langenbecks Archives of Surgery, 2013, 398 (1): 63- 69

DOI:10.1007/s00423-012-1011-z     

MARTIN R C G, MCFARLAND K, ELLIS S, et al

Irreversible electroporation in locally advanced pancreatic cancer: potential improved overall survival

[J]. Annals of Surgical Oncology, 2013, 20: 443- 449

DOI:10.1245/s10434-012-2736-1     

SIDDIQUI I A, KIRKS R C, LATOUCHE E L, et al

High-frequency irreversible electroporation

[J]. Surgical Innovation, 2017, 24 (3): 276- 283

DOI:10.1177/1553350617692202      [本文引用: 1]

WANG Y B, YIN S Y, ZHOU Y, et al

Dual-function of baicalin in nsPEFs-treated hepatocytes and hepatocellular carcinoma cells for different death pathway and mitochondrial response

[J]. International Journal of Medical Sciences, 2019, 16 (9): 1271- 1282

DOI:10.7150/ijms.34876      [本文引用: 3]

YIN S Y, CHEN X H, ZHANG X M, et al

Nanosecond pulsed electric field (nsPEF) treatment for hepatocellular carcinoma: a novel locoregional ablation decreasing lung metastasis

[J]. Cancer Letters, 2014, 346 (2): 285- 291

DOI:10.1016/j.canlet.2014.01.009      [本文引用: 2]

KLEIN N, GUNTHER E, MIKUS P, et al

Single exponential decay waveform; a synergistic combination of electroporation and electrolysis (E2) for tissue ablation

[J]. PeerJ, 2017, 5 (5): 96- 106

[本文引用: 1]

ZHANG Y, LYU C, LIU Y, et al

Molecular and histological study on the effects of non-thermal irreversible electroporation on the liver

[J]. Biochemical and Biophysical Research Communications, 2018, 500 (3): 665- 670

DOI:10.1016/j.bbrc.2018.04.132      [本文引用: 1]

YIN S Y, LIU Z, SHAHRIAR M A, et al

Ultrastructural changes in hepatocellular carcinoma cells induced by exponential pulses of nanosecond duration delivered via a transmission line

[J]. Bioelectrochemistry, 2020, 135: 107548

DOI:10.1016/j.bioelechem.2020.107548      [本文引用: 1]

CHANG D C, REESE T S, CHANG D C, et al

Changes in membrane-structure induced by electroporation as revealed by rapid-freezing electron-microscopy

[J]. Biophysical Journal, 1990, 58 (1): 1- 12

DOI:10.1016/S0006-3495(90)82348-1      [本文引用: 1]

CHEN W, LEE R C

Altered ion channel conductance and ionic selectivity induced by large imposed membrane potential pulse

[J]. Biophysical Journal, 1994, 67 (2): 603- 612

DOI:10.1016/S0006-3495(94)80520-X      [本文引用: 1]

姚陈果, 孙才新, 米彦, et al

陡脉冲不可逆性电击穿治疗肿瘤的研究

[J]. 高电压技术, 2007, 33 (2): 7- 13

DOI:10.3969/j.issn.1003-6520.2007.02.002      [本文引用: 1]

YAO Chen-guo, SUN Cai-xin, MI Yan, et al

Study on the treatment of tumor by steep pulse irreversible electrical breakdown

[J]. High Voltage Technology, 2007, 33 (2): 7- 13

DOI:10.3969/j.issn.1003-6520.2007.02.002      [本文引用: 1]

IVEY J W, WASSON E M, ALINEZHADBALALAMI N, et al

Characterization of ablation thresholds for 3D-cultured patient-derived glioma stem cells in response to high-frequency irreversible electroporation

[J]. Research, 2019, 2019 (2): 1- 14

URL     [本文引用: 1]

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