浙江大学学报（农业与生命科学版）

浙江大学学报（农业与生命科学版）, 2023, 49(3): 328-340 doi: 10.3785/j.issn.1008-9209.2022.04.291

园艺科学

基于代谢组学和转录组学挖掘荷叶生物碱合成途径关键基因

李双琴,,, 汪仲毅, 赵琬玥, 陈龙清, 胡慧贞,,

西南林业大学园林园艺学院/云南省功能性花卉资源及产业化技术工程研究中心，云南 昆明 650224

Mining key genes of alkaloid synthesis pathway in lotus leaves based on metabolomics and transcriptomics

LI Shuangqin,,, WANG Zhongyi, ZHAO Wanyue, CHEN Longqing, HU Huizhen,,

College of Landscape Archi-tecture and Horticulture Sciences, Southwest Forestry University/Yunnan Engineering Research Center for Functional Flower Resources and Industrialization, Kunming 650224, Yunnan, China

通讯作者: 胡慧贞（https://orcid.org/0000-0002-0641-9465），E-mail：Jenny_0129@swfu.edu.cn

收稿日期: 2022-04-29   接受日期: 2022-06-30  

基金资助: 国家自然科学基金项目.  31860231
云南省高层次人才引进计划产业人才专项“云南省荷花种质资源创新及其产业化培育项目”.  YNQR-CYRC-2018-007
西南林业大学科研启动基金项目.  01102-112109

Received: 2022-04-29   Accepted: 2022-06-30  

作者简介 About authors

李双琴（https://orcid.org/0000-0003-1407-4361），E-mail：lishuangqin@swfu.edu.cn , E-mail：lishuangqin@swfu.edu.cn

摘要

为探究荷叶生物碱生物合成的分子机制，对生物碱含量差异显著品种‘太空莲’（高生物碱含量）、‘巨无霸’（中生物碱含量）和‘大足红莲’（低生物碱含量）的成熟荷叶进行代谢组学和转录组学测序分析。代谢组学分析发现，在‘大足红莲’及‘太空莲’（低生物碱含量vs高生物碱含量）、‘大足红莲’及‘巨无霸’（低生物碱含量vs中生物碱含量）、‘太空莲’及‘巨无霸’（高生物碱含量vs中生物碱含量）3组中分别存在30、32、14种差异代谢物。这些差异代谢物主要为3类异喹啉类生物碱——苄基异喹啉类、双苄基异喹啉类、阿朴啡类生物碱，包括山矾碱、3´-葡萄糖基-6，7-二羟基-N-甲基-苄基四氢异喹啉、多巴胺、L-酪胺等。为了挖掘上述异喹啉类生物碱生物合成途径的关键基因，进一步对3个品种进行转录组学测序分析。结果表明，‘大足红莲’及‘太空莲’、‘大足红莲’及‘巨无霸’、‘太空莲’及‘巨无霸’3组中的差异表达基因（differentially expressed genes, DEGs）分别为2 866、2 739、3 932个，共有的DEGs有379个，这些共有基因中含有异喹啉类生物碱生物合成途径基因。结合代谢组学分析结果，最终筛选并通过实时荧光定量聚合酶链反应验证得到6个关键DEGs——NnCYP80G、Nn6OMT、NnTYDC、NnNCS、NnRAV和NnERF，它们可用于后续基因功能验证和分子调控网络解析。

关键词： 荷叶生物碱 ; 差异代谢物 ; 差异表达基因 ; 实时荧光定量聚合酶链反应

Abstract

In order to explore the molecular mechanism of alkaloid biosynthesis in lotus leaves, metabolomics and transcriptomics sequencing analyses were performed on mature lotus leaves of ‘Taikong Lian’ (high alkaloid content), ‘Juwuba’ (medium alkaloid content) and ‘Dazu Honglian’ (low alkaloid content) cultivars with significant differences in alkaloid content. Metabolomics analysis showed that there were 30, 32 and 14 different metabolites in the three groups of ‘Dazu Honglian’ vs ‘Taikong Lian’ (low vs high alkaloid content), ‘Dazu Honglian’ vs ‘Juwuba’ (low vs medium alkaloid content), and ‘Taikong Lian’ vs ‘Juwuba’ (high vs medium alkaloid content), respectively. These differential metabolites were mainly three types of isoquinoline alkaloids, namely benzylisoquinoline, bis-benzylisoquinoline and aporphine alkaloids, specifically including caaverine, 3´-glucosyl-6, 7-dihydroxy-N-methyl-benzyltetrahydroisoquinoline, dopamine, L-tyramine, etc. To further explore the key genes of the above isoquinoline alkaloid biosynthesis pathway, the transcriptomics sequencing analysis of three cultivars were performed. The numbers of differentially expressed genes (DEGs) among the three groups (‘Dazu Honglian’ vs ‘Taikong Lian’, ‘Dazu Honglian’ vs ‘Juwuba’, and ‘Taikong Lian’ vs ‘Juwuba’) were 2 866, 2 739 and 3 932, respectively; and there were 379 DEGs in common, which contained isoquinoline alkaloid biosynthesis pathway genes. Combined with the results of metabolomics analysis, six key DEGs, including NnCYP80G, Nn6OMT, NnTYDC, NnNCS, NnRAV and NnERF, were finally screened and verified by real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction, which can be used for subsequent gene function verification and molecular regulation network analysis.

Keywords： lotus leaf alkaloids ; differential metabolites ; differentially expressed genes (DEGs) ; real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction

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本文引用格式

李双琴, 汪仲毅, 赵琬玥, 陈龙清, 胡慧贞. 基于代谢组学和转录组学挖掘荷叶生物碱合成途径关键基因. 浙江大学学报（农业与生命科学版）[J]. 2023, 49(3): 328-340 doi:10.3785/j.issn.1008-9209.2022.04.291

LI Shuangqin, WANG Zhongyi, ZHAO Wanyue, CHEN Longqing, HU Huizhen. Mining key genes of alkaloid synthesis pathway in lotus leaves based on metabolomics and transcriptomics. Journal of Zhejiang University （Agriculture & Life Sciences）[J]. 2023, 49(3): 328-340 doi:10.3785/j.issn.1008-9209.2022.04.291

莲（Nelumbo nucifera），是莲科（Nelumbona-ceae）莲属（Nelumbo）水生植物[1]，常被人们称为“神圣莲花”，为我国传统名花中唯一的水生花卉[2-3]，其株型、花型、花色和花期等观赏性状均表现出极为丰富的变化，集观赏、食用和药用于一身，具有广阔的应用前景[4]。在山水园林中，莲可作为主题水景植物、夏季湿地花卉、盆栽盆景及插花等。除具有观赏价值外，莲还具有药用、食用价值，如荷叶具有润肠排毒、降脂减肥等功效[5-6]，其中生物碱为荷叶的主要生物活性成分。药理研究报道表明，荷叶生物碱除具有调节脂质代谢、降糖等药效外，还具有抗脑缺血、抑制骨质疏松、抗菌、抗病毒、抗黑色素生成等药理作用，且不少药理作用已申报专利[7-8]。荷叶生物碱成分多种多样，目前，已从荷叶中分离出的生物碱类化学成分有30多种[9]，按照其核心结构及连接基团的不同，分为苄基异喹啉类、双苄基异喹啉类、阿朴啡类和其他类生物碱。目前的研究多集中于对荷叶生物碱的分离检测、成分鉴定和活性成分的作用分析等方面，而对不同品种荷叶生物碱的成分检测及其生物合成机制研究相对较少，特别是荷叶生物碱生物合成相关基因的功能和转录因子的调控机制尚不清楚[10]。

本研究以荷叶生物碱含量差异显著的3个莲品种的叶片为研究对象，通过代谢组学和转录组学联合分析，解析不同莲品种叶片的生物碱组分与含量差异，挖掘荷叶生物碱生物合成的候选基因和转录因子，并通过实时荧光定量聚合酶链反应（real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction, qRT-PCR）进行初步验证，为后续深入研究荷叶生物碱生物合成途径提供依据，也为高生物碱含量莲品种的培育提供基因资源和基础材料，以期加快高生物碱莲新品种的培育。

1 材料与方法

1.1 植物材料

基于本课题组前期研究结果，本试验所用植物材料为生物碱含量存在显著差异的‘太空莲’（‘Taikong Lian’, TKL）、‘巨无霸’（‘Juwuba’, JWB）、‘大足红莲’（‘Dazu Honglian’, DZHL）品种，均来源于云南省曲靖市。采集3个品种的成熟鲜叶（至少3个生物学重复），立即置于液氮中冷冻，带回实验室后储存在－80 ℃冰箱中，备用。

1.2 代谢组学分析

1.2.1 生物碱提取

将采集的植物样品置于Scientz-100F冻干机（宁波新芝生物科技股份有限公司）中进行真空冷冻干燥后，利用MM 400研磨仪（德国Retsch公司）以30 Hz、1.5 min研磨至粉末状。称取100 mg粉末，溶解于1.2 mL 70%甲醇提取液中，每30 min涡旋一次，每次持续30 s，共涡旋6次后置于4 ℃冰箱中过夜，然后以1.2×104 r/min离心10 min。吸取上清液，用微孔（0.22 μm）滤膜过滤样品，并保存于进样瓶中，用于超高效液相色谱（ultra-high performance liquid chromatography, UPLC）-串联质谱（tandem mass spectrometry, MS/MS）分析。

1.2.2 色谱和质谱采集条件

数据采集仪器系统主要包括超高效液相色谱和串联质谱[岛津企业管理（中国）有限公司]。超高效液相色谱条件如下。SB-C18色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.8 µm，美国Agilent公司）；流动相：A相为超纯水（加入0.1%甲酸），B相为乙腈（加入0.1%甲酸）；洗脱梯度：0 min时B相比例为5%，9.0 min内B相比例线性增加到95%，并维持1 min，10.0～11.1 min B相比例降为5%，并以5%平衡至14.0 min；流速0.35 mL/min；柱温40 ℃；进样量4 μL。质谱条件参数如下：涡轮喷雾离子源；离子源温度550 ℃；离子喷雾电压5 500 V（正离子模式）/－4 500 V（负离子模式）；离子源气体Ⅰ（GSⅠ）、气体Ⅱ（GSⅡ）和帘气分别设置为50、60、172 kPa；碰撞诱导电离参数设置为高。

利用Analyst 1.6.3软件处理数据，并对样品代谢物进行UPLC-MS/MS定性定量分析，按峰面积归一化法计算得出各成分相对含量。

1.3 转录组测序

利用EASYspin植物RNA快速提取试剂盒（北京艾德莱生物科技有限公司）提取荷叶鲜样RNA，利用琼脂糖凝胶电泳分析RNA的完整性及是否存在污染，利用高精确度Qubit 2.0荧光计测量RNA浓度。利用2100生物分析仪（美国Agilent公司）精确检测RNA的完整性发现，所有样品的D（260 nm）/D（280 nm）＞1.8，RNA完整性数（RNA integrity number, RIN）＞6.0，质量浓度为300～400 ng/μL，说明荷叶RNA样品满足建库测序质量要求。利用Illumina HiSeq平台进行测序。

1.4 基因序列比对和差异表达基因挖掘

在进行数据分析前，为确保基因序列有足够高的质量，需对测序数据进行严格的质量控制。将测序得到的原始图像进行碱基识别分析，获得原始数据，然后将原始数据过滤，去除带接头的、含有N碱基和低质量的序列，并经过测序错误率和GC含量分布检查后，利用HISAT2及TopHat v.2.0.12软件将处理过的序列与莲总参考基因组序列进行比对。用DESeq2软件鉴定差异表达基因[11]，将错误发现率（false discovery rate, FDR）＜0.05和|log2（差异倍数）[log2 (fold change), log2 (FC)]|≥1的基因确定为差异表达基因[12]。

1.5 qRT-PCR分析

为了验证挖掘出的差异表达基因，挑选6个候选基因（NnCYP80G、Nn6OMT、NnTYDC、NnNCS、NnRAV和NnERF）进行qRT-PCR分析。参照1.3节的方法提取3个品种荷叶鲜样RNA，用反转录试剂盒M-MLV 4 First-Strand cDNA Synthesis Kit（美国BioMed公司）合成cDNA，利用LightCycler® 480Ⅱ荧光定量PCR仪进行qRT-PCR扩增。程序如下：95 ℃预变性10 min；95 ℃变性15 s，60 ℃退火、延伸各30 s（40个循环）。从65 ℃升至95 ℃，每升温0.5 ℃采集一次荧光信号，绘制熔解曲线。以莲actin基因（F：5´-CTCCGTGTTGCCCCTGAAG-3´；R：5´-CCAGCAAGGTCCAACCGAAG-3´）[10]作为内参基因，每个样品均设置3个重复，利用Primer-BLAST设计引物（表1），使用2－ΔΔCT方法计算基因的相对表达量。

表1   qRT-PCR引物信息

Table 1  Information of qRT-PCR primers

基因名称

Gene name

基因号

Gene ID

正向引物（5´→3´）

Forward primer (5´→3´)

反向引物（5´→3´）

Reverse primer (5´→3´)

NnCYP80GLOC104595105GATCGATTGCTTTCAGGCCGTTTCTCCTCTCTGGCGTGTG
Nn6OMTLOC104590845GGCGAAGAACGATATGGGCTGCCGACCAAGCTATCCTTGA
NnTYDCLOC104610815TGGCAAATAGCCCTCAGTCGCGGCACCACAATCTCAAACC
NnNCSLOC104609606GCGTTGGCACCATTCTATACGGCACGATTCAGCGTCTTTCTC
NnRAVLOC104603036TCTTCCCTTGCTTGACCGACAATTTAACCGGCGTCTCCGT
NnERFLOC104610490AGCTGGAGCAAACTAAGCGTTCTGCGTGCTGTTTCGGTAT

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试验结果数据表示为平均值±标准差，并采用SPSS 20.0对各组数据进行方差检验，以P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 代谢组质量评估及代谢物分析

UPLC-MS/MS分析表明，TKL、JWB、DZHL（图1）3个莲品种的生物碱含量从高到低依次是TKL、JWB、DZHL，其中，JWB的生物碱含量比TKL低15.28%，DZHL的生物碱含量分别比JWB和TKL低31.83%和41.24%（图2）。

图1

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图1   3个莲品种及其荷叶样品

Fig. 1   Three lotus cultivars and their leaf samples


图2

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图2   TKL、JWB和DZHL的生物碱相对含量

短栅上不同小写字母表示在P＜0.05水平差异有统计学意义。

Fig. 2   Relative contents of alkaloids in TKL, JWB and DZHL cultivars

Different lowercase letters above bars indicate significant differences at the 0.05 probability level.


基于本地代谢数据库，对3个品种成熟荷叶（每个品种3次重复）的9个检测样品的代谢物进行UPLC-MS/MS定性定量分析。基于多反应监测（multiple reaction monitoring, MRM）模式的代谢物检测多峰图（图3A）展示了样品中能够检测到的物质，不同颜色的质谱峰代表一个代谢物。基于UPLC-MS/MS检测平台和自建数据库共检测到55种生物碱。总离子流图谱比对结果表明，正负离子流曲线重叠性高，色谱峰的保留时间和峰强度均一致。正交偏最小二乘判别分析（orthogonal partial least squares-discriminant analysis, OPLS-DA）[13]结果（图3B）表明，试验所得数据的准确率较高，结果可信。主成分分析（principal component analysis, PCA）（图3C）和聚类分析（图4A）结果显示，3个品种的代谢物存在显著差异，可用于后续研究。

图3

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图3   代谢物质量评估

Fig. 3   Metabolite quality assessment


进一步对3个品种间的差异代谢物进行分析，结果发现：DZHL及TKL组有30种差异代谢物（附表1，http://www.zjujournals.com/agr/CN/10.3785/j.issn.1008-9209.2022.04.291），其中，有28种差异代谢物上调，2种差异代谢物下调（图4B）；DZHL及JWB组有32种差异代谢物（附表2，http://www.zjujournals.com/agr/CN/10.3785/j.issn.1008-9209.2022.04.291），其中，有30种差异代谢物上调，2种差异代谢物下调（图4B）；TKL及JWB组有14种差异代谢物（附表3，http://www.zjujournals.com/agr/CN/10.3785/j.issn.1008-9209.2022.04.291），其中，有7种差异代谢物上调，7种差异代谢物下调（图4B）。3组的差异代谢物主要归属于3类异喹啉类生物碱——苄基异喹啉类、双苄基异喹啉类、阿朴啡类生物碱。对DZHL及TKL、DZHL及JWB、TKL及JWB 3组差异代谢物取交集，发现共有6个差异代谢物（图4C），分别为山矾碱、3´-葡萄糖基-6，7-二羟基-N-甲基-苄基四氢异喹啉、多巴胺、L-酪胺、前荷叶碱、异美迪紫檀素，其中前5种为异喹啉类生物碱或异喹啉类生物碱的合成前体。在DZHL及TKL、DZHL及JWB、TKL及JWB 3组中山矾碱的差异倍数对数值分别为1.44、3.14和1.70；3´-葡萄糖基-6，7-二羟基-N-甲基-苄基四氢异喹啉的差异倍数对数值分别为2.87、1.65和1.21；多巴胺的差异倍数对数值分别为2.77、1.30和1.47；L-酪胺的差异倍数对数值分别为4.44、2.77和1.67；前荷叶碱的差异倍数对数值分别为1.07、3.62和2.55。

图4

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图4   TKL、JWB和DZHL中差异代谢物聚类热图（A）、火山图（B）及维恩图（C）

A.红色代表高含量，绿色代表低含量；C.圆圈里的数字代表差异代谢物数量。

Fig. 4   Clustering heatmap (A), volcano plot (B) and Venn diagram (C) of differential metabolites in TKL, JWB and DZHL cultivars

A. Red and green represent high content and low content, respectively; C. The data in the circle represent the numbers of differential metabolites.


京都基因和基因组数据库（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG）有助于把基因、表达信息及代谢物含量作为一个整体网络进行研究。由图5A可知：生物碱差异较大的2组（DZHL及TKL组、DZHL及JWB组）差异代谢物在异喹啉类生物碱生物合成途径上显著富集；但TKL及JWB组没有在异喹啉类生物碱生物合成途径上显著富集，而是在酪氨酸代谢途径上富集。酪氨酸代谢途径是合成异喹啉类生物碱的前体途径，表明TKL及JWB组差异代谢物也参与了异喹啉类生物碱的合成。结合差异代谢物在3个品种中的具体变化和差异倍数对数值，筛选出异喹啉类生物碱中变化最显著的9种生物碱，包括山矾碱、3´-葡萄糖基-6，7-二羟基-N-甲基-苄基四氢异喹啉、多巴胺、L-酪胺、前荷叶碱、甲基乌药碱、N-甲基乌药碱、荷叶碱、莲碱（图5B）；后续将重点对这几种生物碱的合成途径基因进行深入挖掘。

图5

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图5   TKL、JWB和DZHL中差异代谢物的KEGG富集图（A）及其显著差异代谢物的生物碱相对含量（B）

GDNM-BnTHIQ：3´-葡萄糖基-6，7-二羟基-N-甲基-苄基四氢异喹啉。短栅上不同小写字母表示不同品种间同一代谢物的生物碱相对含量在P＜0.05水平差异有统计学意义。

Fig. 5   KEGG enrichment diagram of differential metabolites (A) and relative contents of alkaloids in significantly differential metabolites (B) in TKL, JWB and DZHL cultivars

GDNM-BnTHIQ: 3´-glucosyl-6, 7-dihydroxy-N-methyl-benzyltetrahydroisoquinoline. Different lowercase letters above bars indicate significant differences in relative contents of alkaloids of the same metabolite among different cultivars at the 0.05 probability level.


2.2 异喹啉类生物碱生物合成途径的基因挖掘

为了进一步挖掘上述异喹啉类生物碱生物合成途径的关键基因，对3个品种共9个样品进行转录组测序分析。利用Illumina HiSeq测序平台对cDNA文库加以检索，通过碱基识别转变为高质量数据，其Q30碱基百分比≥95%，测序质量良好。各个样品中GC含量平均为45.61%，大约有96%的序列被比对到莲总参考基因组上，包括93%的单一映射序列和2.62%的多重映射序列。

按照差异基因的筛选要求（|log2 (FC)|≥1，且FDR＜0.05），利用DESeq2软件对差异表达基因（differentially expressed genes, DEGs）进行分类，共鉴定出5 779个DEGs：DZHL及TKL组共有2 866个DEGs，其中，879个上调，1 987个下调；DZHL及JWB组共有2 739个DEGs，其中，1 399个上调，1 340个下调；TKL及JWB组共有3 932个DEGs，其中，2 519个上调，1 413个下调。维恩图分析发现，对DZHL及TKL、DZHL及JWB、TKL及JWB 3组DEGs取交集，共获得379个DEGs（图6A），进一步对这3组DEGs绘制热图，发现这些基因分别聚集在不同位置（图6B），表明3个品种DEGs的表达水平有显著差异，可进行下一步候选基因的挖掘。

图6

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图6   TKL、JWB和DZHL中差异基因维恩图（A）和聚类热图（B）

A.圆圈里的数字代表差异代谢物数量；B.红色代表高表达量，绿色代表低表达量。

Fig. 6   Venn diagram (A) and clustering heatmap (B) of differential genes in TKL, JWB and DZHL cultivars

A. The data in the circle represent the numbers of differential metabolites; B: Red and green represent high expression level and low expression level, respectively.


本研究重点对图5B中有显著差异的生物碱合成途径基因进行深入挖掘。如图7所示：L-酪氨酸途径中合成酪胺的酪氨酸多巴脱羧酶（tyrosine decarboxylase, TYDC）基因（NnTYDC，编号为LOC104610815、LOC104612241）在TKL（高生物碱品种）中的表达水平高于JWB（中生物碱品种）和DZHL（低生物碱品种）；L-酪氨酸途径中合成L-多巴胺的多酚氧化酶（polyphenol oxidase, PPO）基因（NnPPO，LOC104588897）和合成4-羟基苯丙酮酸的内酰胺酶（New Delhi metallo-β-lactamase, NDM）基因（NnNDM，LOC104602643、LOC104599457）均在低生物碱品种中高量表达；多巴胺和4-羟基苯基乙醛在去甲乌药碱合酶（norcoclaurine synthase, NCS）基因（NnNCS，LOC104590414、LOC104609606、LOC104590417）的调控下合成（S）-去甲乌药碱，其中NnNCS（LOC104590417）在高生物碱品种中的表达水平显著高于中、低生物碱品种；（S）-去甲乌药碱在去甲乌药碱6-O-甲基转移酶（norcoclaurine 6-O-methyltransferase, 6OMT）基因（Nn6OMT，LOC104590845、LOC104587969）的调控下合成（S）-乌药碱，其表达模式与NnNCS一致；（S）-乌药碱在（S）-乌药碱-N-甲基转移酶[(S)-coclaurine N-methyltransferase, CNMT]、（S）-N-甲基乌药碱-3´-羟化酶[(S)-N-methylcoclaurine 3´-hydroxylase, CYP80B]和3´-羟基-N-甲基乌药碱4´-O-甲基转移酶（3´-hydroxy-N-methylcoclaurine 4´-O-methyltrans-ferase, 4´OMT）基因的调控下合成（S）-牛心果碱；（S）-牛心果碱再通过NnCYP719A（LOC104604446）、Nn7OMT（LOC104585771）、NnNDM（LOC104602643、LOC104599457）、NnCYP80G（LOC104595105）基因使C—C苯酚耦合后进一步合成莲碱、荷叶碱、O-降荷叶碱等阿朴啡类生物碱。值得注意的是，（S）-牛心果碱转化为阿朴啡类生物碱需要进行酶促反应，如在C-4´位置进行脱羟基，在C-3´位置进行去甲基化。因此，仍需要更多的研究来进一步阐明将（S）-N-甲基乌药碱或（S）-牛心果碱转化为阿朴啡类生物碱的酶促反应机制。

图7

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图7   异喹啉类生物碱生物合成途径基因表达水平示意图

Fig. 7   Schematic diagram of gene expression levels of isoquinoline alkaloid biosynthesis pathway


已有的研究表明，几种转录因子（transcription factors, TFs）如bHLH、WRKY和ORCA3等都参与了植物中异喹啉类生物碱生物合成的调控[14-15]。因此，本研究挖掘了参与异喹啉类生物碱生物合成的TFs，包括5个NnERF、4个NnWRKY、2个NnZAT、2个NnMYB和1个NnbHLH。对上述转录因子进行基因表达水平分析，结果发现：NnERF（LOC104606214）在低生物碱品种中的表达水平显著高于中、高生物碱品种，同属于ERF的转录因子基因NnRAV（LOC104603036）在低生物碱品种DZHL中的表达水平高于高生物碱品种TKL；而NnWRKY（LOC104588301、LOC104594045、LOC104603312、LOC104610723）和NnZAT（LOC104608146、LOC104594613）则在JWB（中生物碱品种）中高量表达；NnMYB（LOC104605119）在高生物碱品种TKL中的表达水平高于中、低生物碱品种JWB和DZHL；NnbHLH（LOC104606713）在高生物碱品种TKL中的表达水平高于低生物碱品种DZHL。

2.3 候选基因的qRT-PCR验证

为了初步验证挖掘出的基因，对挑选的6个候选基因（NnCYP80G、Nn6OMT、NnTYDC、NnNCS、NnRAV和NnERF）进行qRT-PCR分析。结果（图8）发现，这6个基因在3个高、中、低生物碱含量代表性品种中的表达模式与转录组测序一致，具体表现为NnCYP80G、Nn6OMT在高生物碱品种TKL中的表达量高于低生物碱品种DZHL，而NnTYDC、NnNCS、NnRAV和NnERF在中、低生物碱品种中的表达量高于高生物碱品种。推测不同品种中生物碱积累量的不同导致了调控生物碱含量变化的基因表达模式的不同，因此，同一基因在不同莲品种中的表达模式存在差异，其具体功能和分子调控网络有待进一步研究。

图8

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图8   TKL、JWB和DZHL成熟荷叶中候选基因相对表达量

短栅上不同小写字母分别表示不同品种候选基因的FPKM值（RNA-Seq）及其相对表达量（qRT-PCR）在P＜0.05水平差异有统计学意义。

Fig. 8   Relative expression levels of candidate genes in mature lotus leaves of TKL, JWB and DZHL cultivars

Different lowercase letters above bars indicate significant differences of FPKM values of candidate genes (RNA-Seq) and relative expression levels of candidate genes (qRT-PCR) among different cultivars at the 0.05 probability level, respectively.


3 讨论与结论

荷叶作为一种药食两用的材料，具有丰富的药理活性。DENG等研究发现，荷叶的主要生物活性成分是异喹啉类生物碱，而双苄基异喹啉类生物碱主要积累在胚芽组织中，在叶片中几乎检测不到[16]。近些年，罂粟（Papaver somniferum）[17-18]、日本黄连（Coptis japonica）[19]、花菱草（Eschscholzia californica）[20]和黄唐松草（Thalictrum flavum）[21]等植物已经成为异喹啉类生物碱生物合成研究的模式植物。荷叶生物碱代谢途径非常复杂，其中（S）-牛心果碱是大多数异喹啉类生物碱（如吗啡、血根碱、罂粟碱和小檗碱等）中常见的前体[22]。

目前，对荷叶生物碱的研究尚不深入，其相关途径的关键基因及功能也不清楚。本研究通过代谢组学和转录组学联合分析发现，异喹啉类生物碱，特别是山矾碱、3´-葡萄糖基-6，7-二羟基-N-甲基-苄基四氢异喹啉、多巴胺、L-酪胺、前荷叶碱、甲基乌药碱、N-甲基乌药碱、荷叶碱、莲碱等，是不同莲品种中差异显著的荷叶生物碱。在此基础上，对上述物质合成途径上的关键基因进行了挖掘和初步验证，得到6个关键候选基因——NnCYP80G、Nn6OMT、NnTYDC、NnNCS、NnRAV和NnERF。有研究显示，在小檗属（Berberis L.）中发现的黄芦木碱是一种双苄基异喹啉类生物碱，它是由（S）-N-甲基乌药碱经过CYP80G催化产生的[23]。本研究挖掘出叶转录组中CYP80G的一个同源基因NnCYP80G，且在3个品种中的表达量有所差异，其中在高生物碱品种TKL中的表达量显著高于低生物碱品种DZHL，说明NnCYP80G可能在异喹啉类生物碱生物合成途径上正调控生物碱的合成。研究发现，（S）-N-甲基乌药碱转化为（S）-牛心果碱需要CYP80B和4´OMT催化的2个酶促反应步骤[24]，两者分别负责阿朴啡类生物碱合成过程中C-3´和C-4´位置的羟基化和甲基化[25-26]，但荷叶中的异喹啉类生物碱在C-3´和C-4´位置不含任何羟基或甲基，且在本研究中也没有发现NnCYP80B和Nn4´OMT基因在3个品种中有差异表达，因此，推断NnCYP80B和Nn4´OMT催化的2个酶促反应步骤对于荷叶异喹啉类生物碱生物合成并不是主要的，这2个基因可能与阿朴啡类生物碱的生物合成有关[27]。有研究表明，NCS是异喹啉类生物碱生物合成途径中的第一个关键基因[28]，并在富含异喹啉类生物碱的物种如黄唐松草、罂粟、花菱草中被分离和鉴定出[29]。本研究中，NnNCS基因在低生物碱品种DZHL中的表达量显著高于高生物碱品种TKL，说明NnNCS基因可能在异喹啉类生物碱生物合成途径中负调控生物碱的合成。越来越多的证据表明，生物碱的积累在转录水平上受到转录因子如ERF和bHLH等的调控[30-31]，并且研究报道另一类转录因子WRKY可以通过激活日本黄连和花菱草花中的4´OMT来控制异喹啉类生物碱的积累[32-33]。在本研究中也观察到这种转录调控现象，异喹啉类生物碱生物合成途径的转录因子基因NnERF和NnRAV在低生物碱品种中的表达量高于高生物碱品种，暗示这2个转录因子可能在异喹啉类生物碱生物合成途径上负调控生物碱的合成。目前，莲有上千个品种，多样性丰富，本研究仅挑选3个荷叶生物碱含量差异显著的品种进行基因挖掘，后续将扩大调查的品种数量，更深入、系统地分析荷叶生物碱合成的分子机制。

综上所述，本研究挖掘出的候选基因与荷叶中异喹啉类生物碱生物合成途径密切相关，研究这些基因的功能将有助于更深入地解析荷叶异喹啉类生物碱的生物合成，促进高生物碱含量以及含不同类型生物碱的莲新品种的培育。但由于目前莲的再生和遗传转化体系尚不成熟，很难获得转基因阳性株系，因此，本研究挖掘出的候选基因尚不能在莲中进行本源功能验证，莲的分子辅助育种还处在研究瓶颈期，后续将重点突破这一局限性，克服对莲基因功能验证的不足。

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