浙江大学学报（农业与生命科学版）

浙江大学学报（农业与生命科学版）, 2023, 49(1): 65-75 doi: 10.3785/j.issn.1008-9209.2021.12.281

植物保护

内蒙古阴山沿麓马铃薯枯萎病病原菌的分离鉴定及其生物学特性

贾瑞芳,,1,2, 康立茹2, 赵远征1, 安乐3, 张之为2, 赵君2, 徐利敏,,1, 张键,,2

1.内蒙古自治区农牧业科学院植物保护研究所，内蒙古 呼和浩特 010031

2.内蒙古农业大学园艺与植物保护学院，内蒙古 呼和浩特 010018

3.凉城县农牧和科技局农广校，内蒙古 乌兰察布 013750

Isolation, identification and their biological characteristics of pathogens of potato Fusarium wilt in Yinshan area, Inner Mongolia

JIA Ruifang,,1,2, KANG Liru2, ZHAO Yuanzheng1, AN Le3, ZHANG Zhiwei2, ZHAO Jun2, XU Limin,,1, ZHANG Jian,,2

1.Plant Protection Institute, Inner Mongolia Academy of Agricultural & Animal Husbandry Sciences, Huhhot 010031, Inner Mongolia, China

2.College of Horticulture and Plant Protection, Inner Mongolia Agricultural University, Huhhot 010018, Inner Mongolia, China

3.Agricultural Broadcasting School, Liangcheng County Agricultural and Animal Husbandry and Technology Bureau, Ulanqab 013750, Inner Mongolia, China

通讯作者: 徐利敏（https://orcid.org/0000-0002-2084-6033），E-mail：xulimin@163.com张键（https://orcid.org/0000-0002-1381-9176），E-mail：zhj19890128@126.com

收稿日期: 2021-12-28   接受日期: 2022-07-20  

基金资助: 内蒙古自治区科技计划项目.  2021GG0010.  2021GG0011.  2019GG180
内蒙古农牧业创新基金项目.  2019CXJJN07-2

Received: 2021-12-28   Accepted: 2022-07-20  

作者简介 About authors

贾瑞芳（https://orcid.org/0000-0001-6761-2085），E-mail：jiaruifang1028@emails.imau.edu.cn , E-mail：jiaruifang1028@emails.imau.edu.cn

摘要

为明确内蒙古阴山沿麓地区马铃薯枯萎病病原菌种类及其生物学特性，本研究以2018—2019年采集的463份马铃薯枯萎病植株为材料，采用组织分离法对病原菌进行分离纯化，按照柯赫氏法则进行致病力检测，利用形态学特征结合延伸因子1α（elongation factor 1α, EF1α）测序结果明确病原菌种类及分类地位，并对其生物学特性进行比较研究。结果显示：分离得到的139株镰刀菌属真菌均能引起马铃薯枯萎病，这些镰刀菌分属于10个种，分别为尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）64株、木贼镰刀菌（F. equiseti）30株、轮枝镰刀菌（F. verticilloides）10株、锐顶镰刀菌（F. acuminatum ）12株、芬芳镰刀菌（F. redolens）4株、茄病镰刀菌（F. solani）6株、三线镰刀菌（F. tricinctum）7株、层出镰刀菌（F. proliferum）2株、接骨木镰刀菌（F. sambucinum）3株、厚垣镰刀菌（F. chlamydosporum）1株，其中尖孢镰刀菌的分离率为46.0%，为优势分离菌株。生物学特性测定结果表明：供试镰刀菌在马铃薯葡萄糖琼脂培养基平板上的适宜生长pH为7～9，锐顶镰刀菌、接骨木镰刀菌的最适生长温度为25 ℃，其余镰刀菌种最适生长温度为30 ℃。通过致病力测定发现：鉴定出的10种镰刀菌的致病力差异显著，其中尖孢镰刀菌是引起内蒙古阴山沿麓地区马铃薯枯萎病的优势病原菌，发病植株病情指数为60.19，显著高于其他9种镰刀菌。

关键词： 马铃薯枯萎病 ; 镰刀菌 ; 生物学特性 ; 致病力

Abstract

To clarify the pathogen species and their biological characteristics of potato Fusarium wilt in Yinshan area of Inner Mongolia, 463 samples infected with potato wilt were selected as objects from 2018 to 2019. Pathogens were isolated and purified by tissue isolation and the pathogenicity was detected by Koch’s postulate. The types and classification of pathogens were identified by morphology and elongation factor 1α (EF1α) sequencing analysis, and the comparative study of their biological characteristics was conducted. The results showed that 139 strains of Fusarium spp. caused potato Fusarium wilt, which belonging to 10 species, among them, 64 strains of F. oxysporum, 30 strains of F. equiseti, 10 strains of F. verticillioides, 12 strains of F. acuminatum, four strains of F. redolens, six strains of F. solani, seven strains of F. tricinctum, two strains of F. proliferum, three strains of F. sambucinum and one strain of F. chlamydosporum were identified,and theisolation rate of F. oxysporum was 46.0% and it was the dominant isolate. The results of biological characteristic determination showed that the optimum growth pH value of all tested strains on potato dextrose agar (PDA) was 7-9. The optimum growth temperatures of F. acuminatum and F. sambucinum were both 25 ℃, and the other Fusarium species were 30 ℃. Further analysis of pathogenicity showed that there were differences among ten Fusarium wilt pathogens. The disease index caused by F. oxysporum was 60.19, and it was higher than other nine Fusarium species, which was the dominant pathogen of potato Fusarium wilt in Yinshan area of Inner Mongolia.

Keywords： potato Fusarium wilt ; Fusarium spp. ; biological characteristics ; pathogenicity

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贾瑞芳, 康立茹, 赵远征, 安乐, 张之为, 赵君, 徐利敏, 张键. 内蒙古阴山沿麓马铃薯枯萎病病原菌的分离鉴定及其生物学特性. 浙江大学学报（农业与生命科学版）[J]. 2023, 49(1): 65-75 doi:10.3785/j.issn.1008-9209.2021.12.281

JIA Ruifang, KANG Liru, ZHAO Yuanzheng, AN Le, ZHANG Zhiwei, ZHAO Jun, XU Limin, ZHANG Jian. Isolation, identification and their biological characteristics of pathogens of potato Fusarium wilt in Yinshan area, Inner Mongolia. Journal of Zhejiang University （Agriculture & Life Sciences）[J]. 2023, 49(1): 65-75 doi:10.3785/j.issn.1008-9209.2021.12.281

马铃薯（Solanum tuberosum L.）原产于南美洲的安第斯山脉，具有生育期短、适应性强、产量高、经济效益好等特点，是继水稻、玉米和小麦之后的第四大粮食作物[1]。我国马铃薯种植面积和总产量均居世界首位，2019年的种植面积和总产量分别为491.5万hm2和9 188.1万t，占全球总种植面积的28.3%和总产量的24.8%（联合国粮食及农业组织数据，http://www.fao.org/statistics/en/）。枯萎病被认为是世界范围内严重限制马铃薯产量的土传病害之一[2-3]，在世界各马铃薯种植区普遍发生，易于流行且难以防治，可造成30%～50%的马铃薯减产[4]。随着马铃薯主粮化战略的不断推进[5]，枯萎病的发生会导致马铃薯种植轮作倒茬困难，连作障碍加剧，使得马铃薯的土传病害呈高发态势[6]。据统计，我国马铃薯土传病害的年均发生面积约43.7万hm2，一般导致马铃薯减产20%～30%，严重时减产50%～60%，甚至绝收[7]。内蒙古自治区内一些马铃薯种植区病害发生严重的地块，其发病株率高达78%，导致马铃薯减产和品质下降[8]。

镰刀菌（Fusarium spp.）是引起植物真菌类病害的重要病原菌，能够危害马铃薯[9]、小麦[10]、大豆[11]等粮食作物，主要侵染植物的根、茎和果实，引起植物产生根腐、茎腐和干腐等多种症状[12]。目前常采用形态学特征结合延伸因子1α（elongation factor 1α, EF1α）测序方法对镰刀菌进行鉴定，一般通过扩增获得EF1α序列在NCBI数据库（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）中进行同源性比对，同时，还利用真菌EF1α序列构建系统发育树，确定病原菌种类及其遗传变异性[13-14]。镰刀菌的多型性和易变异性使得镰刀菌成为真菌类群中最难鉴定的属，从而也衍生出了Gerlaeh & Nirenberg、Nelson等多个镰刀菌的分类系统[15]。随着分子生物学技术的迅速发展，内转录间隔区（internal transcribed spacer, ITS）、EF1α和β-微管蛋白（β-tubulin）等基因等位点被越来越多地用于镰刀菌属及种间的鉴定[16]。马铃薯枯萎病是由镰刀菌属真菌引起的土传病害，在马铃薯的整个生育期均能侵染。发病后，地上部主要表现为植株萎蔫和枯死[17]。1924年，WEISS[18]从美国约克郡马铃薯茎秆的维管束中首次分离获得尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）。随后，RAKHIMOV等[19]报道茄病镰刀菌（F. solani）、尖孢镰刀菌、串珠镰刀菌（F. moniliforme）、雪腐镰刀菌（F. nivale）和接骨木镰刀菌（F. sambucinum）等均可引起马铃薯枯萎病。彭学文等[20]报道河北省马铃薯枯萎病是由茄病镰刀菌、串珠镰刀菌以及尖孢镰刀菌引起。王丽丽等[21]报道在新疆地区尖孢镰刀菌和串珠镰刀菌均能够引起马铃薯枯萎病；随后，杨波等[22]确定木贼镰刀菌（F. equiseti）、芬芳镰刀菌（F. redolens）、茄病镰刀菌和锐顶镰刀菌（F. acuminatum）均能够引起新疆地区马铃薯镰刀菌根腐病，其中茄病镰刀菌为优势致病菌。王玉琴等[23]首次确认燕麦镰刀菌（F. avenaceum）是甘肃定西地区马铃薯枯萎病主要致病菌。

本团队在2018—2019年间对内蒙古阴山沿麓马铃薯枯萎病的发生情况进行了普查，调查的40个马铃薯种植地块中枯萎病的发生程度不同。其中，内蒙古自治区乌兰察布市察哈尔右翼中旗前进营村、兴和县南关村、兴和县二台子村、白音察干三义村等种植马铃薯品种‘V7’和‘后旗红’的地块发病程度较轻，发病率为5%～20%；内蒙古自治区乌兰察布市察哈尔右翼前旗三号地村、丰镇市白庙村、武川县冰不浪村等马铃薯种植地块发病程度较重，发病率为40%～50%。本研究以内蒙古阴山沿麓马铃薯主要种植区采集的疑似枯萎病株为试验材料，采用组织分离法对病原菌进行分离和纯化，并利用柯赫氏法则对获得的分离物进行致病力测定。结合形态学和分子生物学方法对分离物进行鉴定；同时，从鉴定出的镰刀菌属不同种中随机挑选1株代表菌株，对其生物学特性和致病力进行比较研究，以期为丰富我国马铃薯枯萎病病原菌的种类以及为马铃薯枯萎病防治提供一定的参考依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

463份马铃薯病样分别采集自内蒙古自治区呼和浩特市、乌兰察布市、锡林郭勒盟和河北省张家口等40个马铃薯种植地块（附表1，http://www.zjujournals.com/agr/CN/10.3785/j.issn.1008-9209.2021.12.281）。供试马铃薯品种为感枯萎病品种‘费乌瑞它’，购自呼和浩特市武川县塞丰马铃薯种业有限公司。

1.2 试剂及仪器

DNA分子标志物、Taq DNA聚合酶，购自天根生化科技（北京）有限生物公司；聚合酶链反应（polymerase chain reaction, PCR）引物由北京厚生博泰生物技术有限公司合成；其余分析纯试剂均购自呼和浩特市鸿之惠商贸有限公司。

TU-1901双光束紫外可见分光光度计，购自北京普析通用仪器有限责任公司；PTC-200 DNA Engine PCR仪，购自美国Bio-Rad公司；5804台式高速多功能离心机，购自德国Eppendorf公司。

1.3 病原菌的分离纯化

采用常规组织分离法[24]对病原菌进行分离和纯化。对马铃薯发病植株的茎基部进行表面清洁，取病健交界处长5 mm、宽3 mm的组织薄片，经75%乙醇消毒3～5 s后晾干，平铺于含有50 mg/mL卡那霉素的水-琼脂（water-agar, WA）培养基（琼脂15 g，用蒸馏水定容至1 000 mL）平板上。每个平板上放置6～8块组织薄片，置于25 ℃下恒温培养3～5 d。待组织薄片周围长出菌落后，在菌落边缘挑取菌丝转到马铃薯葡萄糖琼脂（potato dextrose agar, PDA）培养基（马铃薯200 g、葡萄糖20 g、琼脂15 g，用蒸馏水定容至1 000 mL）平板上进行扩繁培养，待菌落生长到3/4皿处，采用平板稀释法进行单孢分离并获得分离物的纯培养。

1.4 致病力测定

将上述纯化后的菌株在PDA平板上培养5 d后，在菌落边缘打取3个直径为5 mm的菌饼，然后放入装有150 mL Cazpek培养基（NaNO3 2 g、K2HPO4 1 g、KCl 0.5 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、FeSO4 0.01 g、蔗糖30 g，用蒸馏水定容至1 000 mL）的锥形瓶，于25 ℃、150 r/min条件下振荡培养7 d，配制浓度为1×107个/mL的分生孢子悬浮液。采用灌根接种法进行致病力的回接鉴定。

分离物的回接鉴定选用生长4周左右的‘费乌瑞它’幼苗。在营养钵中利用水果刀进行伤根处理后，浇入配制好的分离菌株孢子悬浮液100 mL。以浇水的马铃薯幼苗作为对照组（CK）。接种28 d后观察接种分离物的马铃薯植株是否出现下部叶片萎蔫黄化、上部叶片褪绿萎蔫症状，以确定分离物是否致病。按照上述病原菌的分离方法从发病植株的茎基部进行病原菌的再分离。

1.5 病原菌的形态学鉴定

将纯培养的菌株接种在PDA平板上，于25 ℃恒温、黑暗条件下培养7 d，观察菌落形态。从菌落表面挑取培养物，在40×目镜下观察菌丝体和孢子的形态。根据Gerlach系统[25]和Nelson系统[15]分类标准进行初步鉴定。

1.6 病原菌的分子生物学鉴定

1.6.1 基因组DNA提取

在分离物的菌落边缘用直径为5 mm的打孔器打取菌饼，接种至PDA平板上，于25 ℃下培养7 d后收集菌丝。采用十六烷基三甲基溴化铵（cetyltrimethylammonium bromide, CTAB）法[26]提取菌株基因组DNA。

1.6.2 PCR扩增及测序

采用镰刀菌属真菌的特异性引物EF-1H/EF-2T对分离得到的镰刀菌进行分子鉴定。其中：EF-1H，5´-ATGGGTAAGGAAGACAAGAC-3´；EF-2T，5´-GGAAGTACCAGTGATCATGTT-3´[27]。以菌株DNA为模板，利用上述特异性引物进行PCR扩增。PCR扩增体系（25 μL）：模板DNA 1.0 μL，上、下游引物各1 μL，2×Easy Taq PCR Super Mix 12.5 μL，ddH2O 9.5 μL。PCR扩增程序：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，58 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，循环35次；72 ℃延伸5 min。扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测后，将纯化产物送到北京厚生博泰生物技术有限公司测序。将分离菌株的EF1α序列与GenBank中相关种类序列进行同源性检索，利用MEGA 7.0软件中的邻接（neighbour-joining, NJ）法构建系统发育树，分析所分离菌株与参考菌株间的亲缘关系，确定其分类地位。

1.7 代表菌株生物学特性的比较

以每个种随机选取的菌株为研究对象，对其生物学特性进行比较研究。

生长速率的测定：将纯培养的菌株用直径为5 mm的打孔器打取菌饼后接种于PDA平板上，于25 ℃条件下培养。在不同培养时间点采用十字交叉法逐日测量、记录菌落直径。每个菌株设置3个重复。

产孢量测定：用直径为5 mm的打孔器从菌落边缘打取菌饼后接种于PDA平板上，于25 ℃条件下培养7 d，用10 mL无菌水冲洗培养皿。用4层脱脂纱布过滤，取滤液并用血球计数板计算分生孢子的数量。

不同培养温度的影响：用直径为5 mm的打孔器从菌落边缘打取菌饼后接种于PDA平板上，分别在5、10、15、20、25、30、35、40 ℃条件下进行恒温、黑暗培养。培养7 d后采用十字交叉法测量菌落直径，每个处理重复3次。

培养基pH值的影响：用直径为5 mm的打孔器从菌落边缘打取菌饼后分别接种于pH 4、5、6、7、8、9、10、11的PDA培养基上，于25 ℃恒温、黑暗条件下培养，7 d后采用十字交叉法测量菌落直径，每个处理重复3次。

1.8 代表菌株致病力的测定

利用上述方法获得分生孢子液后按照1.4节中描述的致病力测定方法进行人工接种。每个菌株接种10株马铃薯幼苗。以接种水的马铃薯幼苗作为对照组。每个菌株设置3个重复。接种28 d后参照马铃薯枯萎病的病级标准[28]进行调查：0级，叶片没有明显枯黄萎蔫，植株生长正常；1级，0%～20%的叶片枯黄萎蔫；2级，＞20%～40%的叶片枯黄萎蔫；3级，＞40%～60%的叶片枯黄萎蔫；4级，＞60%～80%的叶片枯黄萎蔫；5级，80%以上的叶片枯黄萎蔫。

病情指数=∑（各病级数值×各级病株数）/（调查总株数×最高病级数值）×100。

1.9 数据统计与分析

采用SPSS 17.0软件进行数据统计与分析，应用Duncan’s新复极差法进行差异显著性检验。利用MEGA 7.0软件对基因序列构建系统发育树。

2 结果与分析

2.1 分离菌株的获得及其形态学特征

采用常规组织分离法对从内蒙古阴山沿麓的40个马铃薯种植区中采集的发病株茎基部进行病原菌的分离，单孢纯化后共获得139株菌株。根据菌落颜色、菌丝体和分生孢子形态将获得的菌株划分为10个种类（图1）。

图1

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图1   马铃薯枯萎病菌10个不同菌株的菌落及分生孢子形态

A.对应菌株菌落的正面图；B.对应菌株菌落的背面图；C.对应菌株的分生孢子形态。

Fig. 1   Colony and conidia morphologies of 10 different strains of potato Fusarium wilt

A. Colony front side of the corresponding strain; B. Colony back side of the corresponding strain; C. Conidia morphology of the corresponding strain.


第1类：以XH-1为代表的菌株。气生菌丝呈白色，基物表面产生土黄色色素，边缘颜色浅，小型分生孢子呈卵圆形，大小为（5.5～9.8） μm×（1.8～3.8） μm；大型分生孢子呈梭形至月牙形，顶孢钝，2～5个分隔，多为3个分隔，大小为（17.5～41.2） μm×（3.9～7.7） μm；厚垣孢子球形，单生或串生于菌丝间，直径5.0～9.0 μm。将其初步鉴定为茄病镰刀菌（F. solani）。

第2类：以LNC-5为代表的菌株。气生菌丝生长旺盛，呈羊毛状平铺于培养基上，基底表面呈浅紫色，大量产生小型分生孢子，呈卵形或椭圆形，大小为（3.5～8.8） μm×（2.3～3.4） μm；大型分生孢子直而细长，3～5个分隔，大小为（9.9～41.9 μm）×（2.1～3.5） μm；厚垣孢子为串生球形。将其初步鉴定为层出镰刀菌（F. proliferatum）。

第3类：以DP-1为代表的菌株。气生菌丝稀疏，前期为白色，后期变为土黄色，基物表面呈土黄色，基物不变色，小型分生孢子较少，呈椭圆形，大小为（10.3～18.2） μm×（3.3～4.7） μm；大型分生孢子多，呈镰刀形，腹背弯曲，多为3～4个分隔，大小为（18.9～42.8） μm×（3.2～4.7） μm；厚垣孢子球形，单个顶生。将其初步鉴定为接骨木镰刀菌（F. sambucinum）。

第4类：以DDP-6为代表的菌株。菌丝呈白色絮状，基底呈现出淡粉色至紫红色，小型分生孢子数量较少，呈长卵形；大型分生孢子呈新月形，以1～3分隔为主，大小为（28.3～39.4） μm×（3.1～4.6） μm；厚垣孢子单生或串生。将其初步鉴定为三线镰刀菌（F. tricinctum）。

第5类：以DY-2-2为代表的菌株。菌丝呈白色棉絮状，基底呈淡黄色，小型分生孢子呈卵圆形，大小为（4.1～6.2） μm×（2.1～2.3） μm；大型分生孢子较直，基胞足跟不明显，大小为（20.8～55.3） μm×（2.9～5.6） μm；未见有厚垣孢子。将其初步鉴定为芬芳镰刀菌（F. redolens）。

第6类：以LNC-6为代表的菌株。气生菌丝呈绒状，菌丝白色质密，基底呈现出白色至淡青莲色，能够产生淡紫色色素，小型分生孢子数量多，单孢，呈卵圆形，大小为（5.0～7.6） μm×（2.1～3.5） μm；大型分生孢子多孢，数量少，略弯，大小为（13.2～21.0） μm×（2.5～5.0） μm。将其初步鉴定为尖孢镰刀菌（F. oxysporum）。

第7类：以ZQ-2-2为代表的菌株。气生菌丝呈绒状至毡状，菌丝中间致密、周围稀疏，基物表面呈黄色至淡褐色，基物不变色，小型分生孢子相对较少；大型分生孢子呈月牙形，中间粗两端细，基部有足细胞，大小为（22.4～43.3） μm×（3.1～5.1） μm；顶部细胞呈锥状，中部膨大，产生大量的厚垣孢子，呈球形，顶生或间生于菌丝间，直径5.2～9.8 μm。将其初步鉴定为木贼镰刀菌（F. equiseti）。

第8类：以DDP-3为代表的菌株。气生菌丝呈棉絮状，基底呈现黄褐色，分生孢子梗短而直立，单生或单分支，在PDA平板上未产生分生孢子，厚垣孢子丰富，呈链条状或群生（图2）。将其初步鉴定为厚垣镰刀菌（F. chlamydosporum）。

图2

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图2   马铃薯枯萎病分离株的致病力测定

A.对照植株；B.灌根接菌植株；C～E.分离菌株的菌落和分生孢子形态；F～H.病健交界处再分离菌株的菌落和分生孢子形态。

Fig. 2   Pathogenicity determination of isolated strains of potato Fusarium wilt

A. Control plant; B. Irrigation root inoculation plant; C-E. Colony and conidia morphologies of isolated strains; F-H. Colony and conidia morphologies of re-isolated strains at the disease-healthy junction.


第9类：以HD-4为代表的菌株。气生菌丝稀疏，基底呈深紫色放射状，小型分生孢子呈卵形或椭圆形，数量多，大小为（4.1～9.1） μm×（1.5～3.5） μm；大型分生孢子细长，3～5个分隔，大小为（15.5～23.1） μm×（2.2～3.4） μm；很少产生厚垣孢子。将其初步鉴定为轮枝镰刀菌（F. verticillioides）。

第10类：以BYS-2为代表的菌株。气生菌丝生长旺盛，呈毡毛状，菌落正面呈现3层颜色，最外层为浅粉色，中间层为浅黄色，最内层为白色孢子团堆，小型分生孢子呈卵形或梭形，大小为（5.2～8.6） μm×（2.1×3.6） μm；大型分生孢子弯曲，顶胞渐细，大小为（22.5～56.2） μm×（3.3～5.1） μm；厚垣孢子呈球形。将其初步鉴定为锐顶镰刀菌（F. acuminatum）。

2.2 病原菌的回接验证结果

为进一步确定上述分离物是否为马铃薯枯萎病的致病菌。采用灌根接种法对分离物进行回接鉴定，以分离物LNC-6为例。相比于接种水的正常生长的对照植株（图2A），人工接种LNC-6菌株14 d后，处理组植株显症，叶片自下向上逐渐萎蔫，最后整株枯死（图2B）。对发病植株的茎秆侵染物进行再分离，得到分离菌株的菌落和孢子形态与接种菌株LNC-6一致（图2C～H）。因此，确定LNC-6是引起马铃薯枯萎病的病原菌。采用上述同样的方法确定了分离获得的139株菌株都是引起枯萎病的病原菌。

2.3 分子生物学鉴定

通过EF-1H/EF-2T引物对分离获得的139株病原菌纯培养物进行序列测定，获得长度为713～739 bp的序列片段。将获得的DNA序列与GenBank中已知镰刀菌序列进行同源性比对，139株分离物被鉴定为镰刀菌属的10个不同种，其中尖孢镰刀菌64株、木贼镰刀菌30株、轮枝镰刀菌10株、锐顶镰刀菌12株、芬芳镰刀菌4株、茄病镰刀菌6株、三线镰刀菌7株、层出镰刀菌2株、接骨木镰刀菌3株以及厚垣镰刀菌1株（附表2，http://www.zjujournals.com/agr/CN/10.3785/j.issn.1008-9209.2021.12.281）。

为进一步确定分离菌株间的遗传距离，对27个代表分离菌株（层出镰刀菌2株，厚坦镰刀菌1株，其余镰刀菌各3株）与从GenBank中获得的参考序列进行系统发育树的构建。结果显示：LNC-6、YSW-4、ET-12-2与GenBank登录号为MK968948.1、MK968943.1、MK968952.1的菌株聚在一起，同源性为98%，为尖孢镰刀菌；LNC-5、NG-1与GenBank登录号为LT970774.1、MN158137.1、MW402094.1的菌株聚在一起，同源性达100%，为层出镰刀菌；WC-12、WC-11、MNB-6与GenBank登录号为MH496632.1、MK640226.1、KF874614.1的菌株聚在一起，同源性为99%，为轮枝镰刀菌；XH-5、BYS-2、DDP-1与GenBank登录号为MH822068.1、MH822065.1、MK937111.1的菌株聚在一起，同源性为85%，为锐顶镰刀菌；BD-3-1、DDP-6、QJ-A与GenBank登录号为KT213354.1、KT213358.1、KT213321.1的菌株聚在一起，同源性为92%，为三线镰刀菌；SY-1、SY-5、ZQ-2-2与GenBank登录号为KP267427.1、KT213310.1、KT213285.1的菌株聚在一起，同源性为98%，为木贼镰刀菌；DDP-3与GenBank登录号为MN120754.1、KY211036.1、MT344943.1的菌株聚在一起，同源性为89%，为厚垣镰刀菌；BB-5、QN-6、DP-1与GenBank登录号为KP710619.1、MK752459.1、KP710620.1的菌株聚在一起，同源性达100%，为接骨木镰刀菌；DY-2-2、DB-1-1、SJ-5与GenBank登录号为MT533628.1、MT754668.1、MT305220.1的菌株聚在一起，同源性为88%，为芬芳镰刀菌；MNB-23、SDX-2、XH-1与GenBank登录号为MH628130.1、MN329690.1、MK532475.1的菌株聚在一起，同源性为84%，为茄病镰刀菌。其中，锐顶镰刀菌和三线镰刀菌这2个种的同源性最高，以99%的分支支持率聚到一起，亲缘关系最近；而外群菌大丽轮枝菌（Verticillium dahliae）则因较远的亲缘关系处在系统发育树的外围（图3）。

图3

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图3   基于 EF1α 基因序列采用邻接法构建马铃薯枯萎病菌的系统发育树

Fig. 3   Phylogenetic tree of pathogens of potato Fusarium wilt based on EF1α gene sequence by the NJ method


结合形态学和分子生物学的鉴定结果，最终将以BYS-2为代表的12株菌株鉴定为锐顶镰刀菌，占比8.6%；将DDP-3鉴定为厚垣镰刀菌，占比0.7%；将以DP-1为代表的3株菌株鉴定为接骨木镰刀菌，占比2.2%；将以XH-1为代表的6株菌株鉴定为茄病镰刀菌，占比4.3%；将以LNC-5为代表的2株菌株鉴定为层出镰刀菌，占比1.4%；将以ZQ-2-2为代表的30株菌株鉴定为木贼镰刀菌（F. equiseti），占比21.6%；将以DY-2-2为代表的4株菌株鉴定为芬芳镰刀菌，占比2.9%；将以DDP-6为代表的7株菌株鉴定为三线镰刀菌，占比5.0%；将以HD-4为代表的10株菌株鉴定为轮枝镰刀菌，占比7.2%；将以LNC-6为代表的64株菌株鉴定为尖孢镰刀菌，占比46.0%。

2.4 镰刀菌属不同种代表菌株的生物学特性比较

2.4.1 生长速率的比较

培养2 d时，DP-1（接骨木镰刀菌）、HD-4（轮枝镰刀菌）和LNC-6（尖孢镰刀菌）菌株的生长速率较快，分别为15.52、15.44、15.35 mm/d，而XH-1（茄病镰刀菌）菌株的生长速率最慢，仅为10.87 mm/d；培养6 d后，XH-1菌株的生长速率最慢，菌株的菌落直径为69.93 mm，与其他菌株相比差异显著（附表3，http://www.zjujournals.com/agr/CN/10.3785/j.issn.1008-9209.2021.12.281）。由此可见，所有菌株在PDA培养基上均能生长，其中生长速率最快的是接骨木镰刀菌。

2.4.2 产孢量的比较

产孢量测定结果表明：LNC-6菌株的产孢量（15.43×106个/mL）显著大于其他菌株，其分生孢子大多为小型分生孢子，少数为大型分生孢子。此外，产孢量较大的菌株依次为DY-2-2（芬芳镰刀菌）、LNC-5（层出镰刀菌）和XH-1，分生孢子数量分别为5.87×106、4.68×106、3.50×106个/mL；BYS-2（锐顶镰刀菌）的产孢量最少，仅为7×104个/mL（附表3，http://www.zjujournals.com/agr/CN/10.3785/j.issn.1008-9209.2021.12.281）。因此，在PDA培养基上，所有供试菌株均能产孢，其中产孢量最大的是尖孢镰刀菌。

2.4.3 培养温度对代表菌株生长速率的影响

供试菌株在10～35 ℃条件下均能生长，而在5 ℃低温条件下生长缓慢，其中HD-4、DY-2-2、XH-1和LNC-6菌株只能长出少量稀疏的菌丝，而其余菌株能够正常生长。BYS-2和DP-1菌株的最适生长温度为25 ℃；LNC-5和DDP-6（三线镰刀菌）菌株的适宜生长温度为25～30 ℃，其余菌株的最适生长温度为30 ℃；而在30 ℃时，BYS-2的菌落直径仅为41.45 mm，生长速率显著低于其他菌株；在35 ℃时，DP-1菌株停止生长；而XH-1、ZQ-2-2（木贼镰刀菌）和HD-4菌株在40 ℃下也能缓慢生长（附表3，http://www.zjujournals.com/agr/CN/10.3785/j.issn.1008-9209.2021.12.281）。可见25～30 ℃适宜枯萎病菌株生长，其中锐顶镰刀菌、接骨木镰刀菌的最适生长温度为25 ℃，其余镰刀菌种的最适生长温度为30 ℃。

2.4.4 不同pH对代表菌株生长速率的影响

不同pH条件下代表菌株生长速率测定结果显示，所有供试菌株在供试的8种pH培养基上均可生长，LNC-6在pH 5～11时生长速率没有显著差异，在pH 5时生长最快；HD-4和DDP-6在pH 7时生长最快，其次为pH 8、6，三者之间差异不显著；ZQ-2-2、XH-1和DDP-3（厚垣镰刀菌）在pH 6～9时生长没有显著差异，在pH 8时生长最快；而BYS-2、DP-1、LNC-5和DY-2-2的最适生长pH分别为pH 8、5、10、6（附表3，http://www.zjujournals.com/agr/CN/10.3785/j.issn.1008-9209.2021.12.281）。由此可见，强酸和强碱的环境不利于病原菌的生长，尖孢镰刀菌适宜的土壤酸碱值范围为pH 5～11，适应能力最强。

2.4.5 不同种代表菌株的致病力测定

在温室条件下，采用灌根接种法对马铃薯感病品种‘费乌瑞它’进行不同镰刀菌的接种处理，在接种28 d后对其病情指数进行统计，结果（图4）显示：菌株LNC-6、DP-1、DY-2-2和DDP-6致病力最强，受侵染病株平均病情指数分别为60.19、54.40、53.30和50.81，主要表现为菌株侵染快，植株发病早、发病严重；其次为菌株ZQ-2-2，植株接种后的病情指数为45.71；菌株DDP-3、LNC-5和HD-4接种后的植株平均病情指数分别为31.80、38.05和31.19；而BYS-2和XH-1菌株侵染的植株发病最轻，病情指数分别为24.98和23.19，表现为菌株侵染慢，植株仅底层叶片出现褪绿现象。由此可见，不同种的镰刀菌属菌株在马铃薯上存在一定的致病力分化。

图4

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图4   马铃薯幼苗接种不同种的镰刀菌属菌株28 d后的症状

Fig. 4   Symptoms of potato seedlings after 28 d inoculation with different Fusarium strains


3 讨论与结论

随着马铃薯农业现代化的发展，土传病害枯萎病成为严重制约马铃薯产业发展的关键因素。引起不同马铃薯种植产区不同品种马铃薯枯萎病的病原菌也不同。如引起新疆地区马铃薯枯萎病的优势病原菌是茄病镰刀菌[22]。而引起宁夏地区马铃薯枯萎病的优势病原菌是接骨木镰刀菌和茄病镰刀菌[9]。本研究发现，在内蒙古阴山沿麓的13个地区均有不同程度的马铃薯枯萎病害发生，发病率为30%～40%，但不同地区间引起马铃薯枯萎病的病原菌存在差异。锡林郭勒盟地区引起马铃薯枯萎病的主要病原菌为尖孢镰刀菌和轮枝镰刀菌；呼和浩特地区分离获得7种不同的枯萎病菌，锐顶镰刀菌的分离率最高，为25%；乌兰察布地区分离获得9种不同的枯萎病菌，尖孢镰刀菌的分离率最高，为49.1%。以上结果表明，地域环境、生态条件、土壤类型和种植结构等因素会导致马铃薯枯萎病的镰刀菌致病菌群组成和优势致病菌在地理分布上存在差异。

本研究结合形态学特征和分子生物学手段，最终确定了引起内蒙古阴山沿麓地区马铃薯种植区枯萎病的镰刀菌有10种，其中尖孢镰刀菌的分离率最高，本研究在28个采集地点均分离获得了尖孢镰刀菌，相比其他镰刀菌，其对温度、土壤酸碱性的适应能力和自身致病力明显较强，是引起内蒙古阴山沿麓地区马铃薯枯萎病的优势菌株，这与陈慧等[8]报道的内蒙古地区优势致病菌是尖孢镰刀菌的结果一致。本团队除了得到陈慧等[8]分离的尖孢镰刀菌、三线镰刀菌和茄病镰刀菌外，还分离得到了7个新的镰刀菌种，其中木贼镰刀菌、芬芳镰刀菌、锐顶镰刀菌均为引起新疆地区马铃薯枯萎病的病原菌[22]；接骨木镰刀菌作为马铃薯枯萎病病原菌在内蒙古阴山沿麓地区的研究中被首次报道。本研究明确了内蒙古阴山沿麓马铃薯枯萎病的病原菌种类以及优势种，特别是发现了轮枝镰刀菌、层出镰刀菌和厚垣镰刀菌能够引起马铃薯枯萎病，对于丰富我国马铃薯枯萎病病原菌的种类范围具有非常重要的意义，但我们未检测到串珠镰刀菌和燕麦镰刀菌，其原因可能与马铃薯种植区概况及主栽的马铃薯品种不同有关，也可能是病原菌的分离范围与数量有限。

病原菌生物学特性研究可为掌握病害的发生规律及其与环境因素之间的联系、防治药剂的筛选和田间管理提供理论依据。本研究通过对不同马铃薯枯萎病病原菌生物学特性的研究，发现不同的镰刀菌种在PDA平板上的生长速率均超过1 cm/d，但产孢量存在显著差异。其中产孢量最大的LNC-6（尖孢镰刀菌）与产孢量最小的BYS-2（锐顶镰刀菌）在PDA上产生的分生孢子数量相差2个数量级。蓝江林等[29]研究发现，尖孢镰刀菌在PDA和ATCC培养基上的产孢量显著优于其他6种不同的培养基。李健等[30]以狗尾草玉米淀粉培养基对镰刀菌进行培养后，其产孢能力优于普通的PDA培养基。而杨波等[31]研究发现，最适合接骨木镰刀菌产孢的培养基为改良后的WLA培养基。不同镰刀菌株在产孢时需要的营养种类不同，每种镰刀菌的理想培养基还需进一步研究。镰刀菌的不同种对生长温度的需求不同可能与寄主植物与病样采集地域的气候条件有关，如番木瓜上的茄病镰刀菌最适生长温度为25～30 ℃[32]，而引起香荚兰枯萎病的尖孢镰刀菌最适生长温度为28 ℃[33]，这与本研究中引起马铃薯枯萎病的茄病镰刀菌和尖孢镰刀菌的最适生长温度为30 ℃基本一致。串珠镰刀菌引起的向日葵枯萎病多发生在高温高湿地区，这可能是本研究中未分离获得串珠镰刀菌的原因。陈慧等[8]研究发现，引起马铃薯枯萎病的三线镰刀菌最适生长温度为20 ℃，而本研究分离获得的三线镰刀菌在20 ℃时的生长速率明显慢于25～30 ℃下的，推测同种镰刀菌之间最适生长温度也可能存在差异。本研究中不同镰刀菌的代表菌株是确定其致病力后随机挑选的，因此在后续试验中还需对同种镰刀菌之间进一步比较研究。

马铃薯枯萎病病原菌的组成具有多样性，遗传变异性大且分布规律性差，抗逆性较强，各马铃薯种植区栽培品种与环境也存在较大差异，因此明确引起不同地区马铃薯枯萎病的优势菌种具有重要意义。本研究明确了引起马铃薯枯萎病的10种病原菌及其生物学特性，通过对致病菌的分离鉴定，以及对其在不同温度、pH条件下的致病力研究分析，为后续相关工作提供一定的理论参考依据。镰刀菌真菌具有寄主专化性，但在马铃薯上该菌株是否具有寄主专化性还需要进一步研究。同时，前人研究发现，在土传病害中存在多种病原菌协同作用导致病害发生的情况，而镰刀菌真菌在复合侵染中通常占据优势地位[34]。本研究未在同一植株上同时分离获得多种镰刀菌，未来还需在枯萎病致病菌的分离鉴定中对不同镰刀菌之间的相互关系进行深入研究。

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