浙江大学学报（农业与生命科学版）

浙江大学学报（农业与生命科学版）, 2023, 49(1): 117-128 doi: 10.3785/j.issn.1008-9209.2022.01.111

农业工程

铅气溶胶胁迫下茶树叶片生理生化指标变化及光谱快速检测

陈海天,,1, 周学军2, 沙军静1, 李晓丽,,1, 王瑾,,2, 何勇1

1.浙江大学生物系统工程与食品科学学院/农业农村部光谱检测重点实验室, 浙江 杭州 310058

2.浙江省产品质量安全科学研究院, 浙江 杭州 310018

Changes of physiological and biochemical indexes of tea plant leaves under lead aerosol stress and their rapid spectral detection

CHEN Haitian,,1, ZHOU Xuejun2, SHA Junjing1, LI Xiaoli,,1, WANG Jin,,2, HE Yong1

1.College of Biosystems Engineering and Food Science, Zhejiang University/Key Laboratory of Spectroscopy Sensing, Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Hangzhou 310058, Zhejiang, China

2.Zhejiang Institute of Product Quality and Safety Science, Hangzhou 310018, Zhejiang, China

通讯作者: 李晓丽（https://orcid.org/0000-0001-9689-9054），Tel：+86-571-88982824，E-mail：xiaolili@zju.edu.cn李晓丽（https://orcid.org/0000-0001-9689-9054），Tel：+86-571-88982824，E-mail：xiaolili@zju.edu.cn王瑾（https://orcid.org/0000-0002-4302-2475），Tel：+86-571-85129817，E-mail：wjin_920@163.com王瑾（https://orcid.org/0000-0002-4302-2475），Tel：+86-571-85129817，E-mail：wjin_920@163.com

收稿日期: 2022-01-11   接受日期: 2022-03-10  

基金资助: 国家自然科学基金项目.  31771676

Received: 2022-01-11   Accepted: 2022-03-10  

作者简介 About authors

陈海天（https://orcid.org/0000-0002-3538-0870），E-mail：21913053@zju.edu.cn , E-mail：21913053@zju.edu.cn

摘要

茶树作为多年生叶用植物，在铅气溶胶胁迫下的生理生化指标变化和铅累积效应亟待研究。本文以铅气溶胶方式模拟大气污染环境，研究‘乌牛早’与‘迎霜’2个品种茶树在铅气溶胶胁迫下根、茎、叶各器官的铅累积情况以及叶片中光合色素和抗氧化物的变化规律，并结合傅里叶变换红外（Fourier transform infrared, FTIR）光谱技术建立各指标的快速检测模型。结果表明：在正常环境条件下茶树叶片的铅含量极少，符合食品安全国家标准，根的铅含量远高于叶，证明在正常环境条件下土壤-根途径是茶树积累铅的主要途径。随着胁迫时间的延长，高质量浓度铅胁迫组叶片的铅含量显著高于茎和根，证明存在大气-叶面吸收途径，高质量浓度铅胁迫组叶片中铅含量最高可达无铅处理组的14倍；在胁迫试验的42 d中，叶片的光合色素含量与抗坏血酸含量在胁迫的前中期不断增加，而在胁迫的中后期不断减少，谷胱甘肽含量整体处于上升趋势。分别采用支持向量机（support vector machine, SVM）与人工神经网络（artificial neural network, ANN）建立了基于中红外光谱特征波段的生理生化指标定量预测模型，两者均可实现铅气溶胶胁迫下茶树生理生化指标的快速检测，并且ANN模型的效果普遍优于SVM模型。其中，叶绿素a的ANN定量模型得到了最佳预测效果，在预测集中的相关系数可达0.810，均方根误差可达0.032 mg/g。综上所述，铅气溶胶胁迫会导致茶树体内铅的累积以及生理生化指标的显著变化，基于FTIR光谱技术可实现茶树生理生化指标的快速检测，有望构建茶树受铅气溶胶胁迫的快速诊断方法。

关键词： 铅气溶胶 ; 茶树 ; 光合色素 ; 抗氧化物 ; 红外光谱

Abstract

As a perennial foliage plant, the changes of physiological and biochemical indexes of tea plant under lead aerosol stress and the lead accumulation effect need to be studied urgently. In the present study, the lead aerosol was used to simulate atmospheric pollution, and the lead accumulation in roots, stems, and leaves as well as the changes of photosynthetic pigments and antioxidants in leaves of ‘Wuniuzao’ and ‘Yingshuang’ tea plants were evaluated. Then the model for the rapid detection of each index was established based on Fourier transform infrared (FTIR) spectroscopy. The results showed that the lead content of tea plant leaves in the normal environment was very low, which met the national food safety standards. The lead content of roots was much higher than that of leaves, which proved that the soil-root pathway was the main way for tea plants to accumulate lead in the normal environment. With the increase of stress time, the lead content in the leaves of high concentration lead stress group was significantly higher than that in the stems and roots, which proved that there was an air-leaf absorption pathway, and high concentration lead stress group was up to 14 times that of no lead treatment group. In addition, the photosynthetic pigment and ascorbic acid contents increased initially and then decreased, whereas glutathione content basically increased during the entire 42 days. Support vector machine (SVM) and artificial neural network (ANN) were used to establish quantitative prediction models for monitoring the physiological and biochemical indexes based on the characteristic wave-band of the mid-infrared spectrum, proving that the mid-infrared spectrum could be a potential approach for the rapid detection of physiological and biochemical indexes in tea plants under the lead aerosol stress, and the ANN model showed better effects than the SVM model. The ANN quantitative model of chlorophyll a obtained the best prediction effect, of which the best correlation coefficient of prediction set (rp) could reach 0.810, and the root-mean-square error of prediction set (RMSEp) was 0.032 mg/g. The above results indicate that lead aerosol stress could cause the accumulation of lead and result in the significant changes of physiological and biochemical indexes in tea plants, and the FTIR spectroscopy is a reliable method for the rapid detection of physiological and biochemical indexes in tea plants under the lead aerosol stress.

Keywords： lead aerosol ; tea plant ; photosynthetic pigment ; antioxidant ; infrared spectroscopy

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陈海天, 周学军, 沙军静, 李晓丽, 王瑾, 何勇. 铅气溶胶胁迫下茶树叶片生理生化指标变化及光谱快速检测. 浙江大学学报（农业与生命科学版）[J]. 2023, 49(1): 117-128 doi:10.3785/j.issn.1008-9209.2022.01.111

CHEN Haitian, ZHOU Xuejun, SHA Junjing, LI Xiaoli, WANG Jin, HE Yong. Changes of physiological and biochemical indexes of tea plant leaves under lead aerosol stress and their rapid spectral detection. Journal of Zhejiang University （Agriculture & Life Sciences）[J]. 2023, 49(1): 117-128 doi:10.3785/j.issn.1008-9209.2022.01.111

茶是世界上三大无酒精饮料之一，是我国具有丰富文化底蕴和资源优势的特色农产品[1]。近年来，随着我国采矿、交通、工业生产等人类活动加剧，环境中的重金属污染问题越发严重，加之人民生活水平提高，越来越多的人开始关注茶叶中重金属含量超标问题[2]。铅作为一种神经毒性极强的重金属元素，已经被大量研究证明能够被茶树吸收并富集在茶叶中[3-5]，并最终通过食物链进入人体，危害人体健康。另外，铅作为一种植物非必需的元素，在茶树中的过量累积也会对茶树产生巨大的毒害作用，破坏茶多酚、茶氨酸、叶绿素等成分，影响茶叶口感，降低茶叶品质和营养价值[6]。因此，有必要围绕环境中铅污染对茶树的影响展开研究。

大量学者研究报道了土壤重金属超标会对植物的生理生化过程产生显著的影响[7-9]，但同时我们也不能忽视植物从空气中吸收重金属的能力。HU等[10]通过分析同位素比值，最终确定了野生植物钻形紫菀（Aster subulatus）叶片中累积的铅大部分来自空气。SHAHID等[11]也讨论并证实了叶片是植物吸收重金属的另一种重要方式。对于以叶为主要价值部分的茶树而言，研究叶片对空气中重金属的吸收有着更为深远的价值和意义，但目前对该领域的研究报道还比较少。

重金属的累积会导致茶树形态和生化特性的改变，从而影响茶叶的光谱响应。大量的研究报道已证实利用红外光谱检测植物叶片内物质的可行性，如：LI等[12]利用红外光谱检测了茶叶中的茶多酚和咖啡碱，WULANDARI等[13]利用近红外和红外光谱建立了刺果番荔枝（Annona muricata L.）总酚含量的定量预测模型，张惠敏等[14]利用中红外光谱分析了在不同栽培模式下甜樱桃叶片中光合色素的变化情况。但目前在空气中铅颗粒物污染下植物叶片红外光谱的变化以及利用红外光谱评价植物受重金属污染影响程度的应用潜力尚未被深入研究，还有很大的探索空间。

本研究采用盆栽试验，以硝酸铅[Pb（NO3）2]溶液的气溶胶作为铅来源，研究在铅气溶胶胁迫下茶树对铅颗粒物的吸收与累积及其叶片内部光合色素与抗氧化物含量的变化情况，探索茶树抗重金属胁迫的反应机制，并结合傅里叶变换红外（Fourier transform infrared, FTIR）光谱技术对叶片内部生理生化物质含量进行定性与定量测定，探讨将FTIR光谱技术应用于茶叶品质指标快速检测的可行性。

1 材料与方法

1.1 试验材料

本研究选择‘乌牛早’与‘迎霜’2个常见绿茶品种的茶苗（由浙江省丽水市青青茶苗圃提供）作为研究对象。所有茶苗均以10株为单位于2019年9月初被种植于塑料筐中，每筐中预先装入约12 kg的混合土[m（茶园土）∶m（营养土）=3∶1]，其中，茶园土来自浙江省杭州市富阳区的茶园，营养土为HAWITA泥炭。然后将种有茶苗的塑料筐放置在自建的塑料棚中，让茶苗自然生长1个月以适应试验的生长环境，于2019年10月挑选若干筐长势相近的茶苗开始正式试验。

1.2 试验设计

本研究按照铅气溶胶胁迫程度的不同共分成3个处理组，分别为无污染[0 μg/m3 Pb(NO3)2，CK]、轻度污染[100 μg/m3 Pb(NO3)2，LP]及重度污染[500 μg/m3 Pb(NO3)2，HP]。所有处理组均在土壤表面覆盖一层塑料薄膜，以防止气溶胶沉降到土壤中而使茶苗产生根系吸收；LP组与HP组的各筐茶苗被分别放置于2个0.8 m×0.8 m×1.6 m的密闭塑料棚中，利用汇分9302型气溶胶发生器（上海汇分电子科技有限公司）每日定期向密闭棚中喷入Pb（NO3）2溶液的气溶胶，以维持其中的铅气溶胶质量浓度。

整个试验共持续42 d，分别在第0天、第14天、第28天与第42天进行采样。考虑到化学试验需要充足的样本量，采样时将同组的3株茶苗作为一个样本，每次采样时每个品种的每个处理组均采集4个重复样本，其中第0天由于未开始胁迫，只对CK组进行采样，最后共采集到80个样本。具体采样过程为：将茶苗从土中轻轻拔出，用自来水洗净表面的泥土，然后用预冷的25 mmol/L乙二胺四乙酸（EDTA）溶液浸泡15 min以去除表面可能残留的铅颗粒物，之后再用去离子水冲洗茶苗植株并用纸巾擦干，最后将茶苗分成叶、茎和根，用于后续指标的测量。

1.3 试验方法

1.3.1 铅含量测定

样本各器官的铅含量采用电感耦合等离子体质谱法进行测定。将样本的根、茎、叶进行干燥处理并粉碎，然后准确称取0.1g待测样本于聚四氟乙烯管中，加入5 mL硝酸和1 mL过氧化氢后微波消解1 h，之后在160 ℃条件下赶酸至0.5 mL左右，最后加入去离子水定容到30 mL，利用ELAN DRC-e型电感耦合等离子体质谱仪（美国PerkinElmer公司）测定溶液中的铅含量，重复3次，取平均值。

1.3.2 光合色素含量测定

叶绿素a（chlorophyll a, Chl a）、叶绿素b（chlorophyll b, Chl b）和类胡萝卜素（carotenoid, Car）等叶片光合色素含量的测定参考王爱玉等[15]的方法，采用乙醇法进行测定。将鲜叶样本剪碎后，准确称取0.05 g于离心管中，加入9 mL 95%乙醇，避光放置24 h，在12 h时晃匀一次。取上清液，用Epoch 2紫外分光光度计（美国BioTek公司）在665、649、470 nm波长处测定吸光度值，重复3次，取平均值。溶液中光合色素含量的计算公式如下：

Ca=13.95×D（665 nm）－6.88×D（649 nm）；
Cb=24.96×D（649 nm）－7.32×D（665 nm）；
Cc=[1 000×D（470 nm）－2.05×Ca－114.8×Cb]/245.

式中：Ca、Cb、Cc分别表示Chl a、Chl b、Car质量浓度，mg/L；D（470 nm）、D（649 nm）、D（665 nm）分别表示在470、649、665 nm波长处测定的吸光度值。

1.3.3 抗氧化物含量测定

本研究测定了2个品种茶苗体内具有代表性的抗氧化物：抗坏血酸（ascorbic acid, ASA）和谷胱甘肽（glutathione, GSH）。

将0.1 g鲜叶研磨成粉末后放入5 mL离心管，然后加入2.5 mL 10%三氯乙酸溶液，混合均匀后在4 ℃条件下以1×104 r/min离心15 min，取上清液。

抗坏血酸含量测定：参考ZARRILLO等[16]的方法并稍作修改。取20 μL上清液，加入150 mmol/L磷酸盐缓冲液0.1 mL，混匀后依次加入10%三氯乙酸溶液0.6 mL、44%磷酸溶液0.2 mL、4% 2，2-二联吡啶溶液0.2 mL、3%氯化铁溶液0.1 mL，混匀后37 ℃水浴1 h，之后以1×104 r/min离心5 min，取上清液，在525 nm波长处测定其吸光度值，重复3次，取平均值。以相同方法测定不同浓度抗坏血酸标准溶液的吸光度值，绘制标准曲线，通过标准曲线确定样本的抗坏血酸含量。

谷胱甘肽含量测定：参考TIETZE[17]的方法并稍作修改。取200 μL上清液，加入150 mmol/L磷酸盐缓冲液0.5 mL和6 mmol/L 5，5´-二硫代双（2-硝基苯甲酸）50 μL，在室温下摇匀20 min，之后以1×104 r/min离心5 min，取上清液，在412 nm波长处测定吸光度值，重复3次，取平均值。以相同方法测定不同浓度谷胱甘肽标准溶液的吸光度值，绘制标准曲线，通过标准曲线确定样本的谷胱甘肽含量。

1.3.4 FTIR光谱采集

将鲜叶样本磨碎，取0.01 g粉末与0.49 g溴化钾粉末混匀后用研钵仔细研磨至细粉状，称取0.1 g混匀后的粉末并用压片机压成片，压片机的压强为25 MPa，保持20 s，每个样本压3片作为重复。

利用Nicolet iS10型FTIR光谱仪（美国赛默飞世尔科技公司）对样本压片进行光谱测定，光谱范围为400～4 000 cm－1，光谱分辨率为0.5 cm－1，平均次数为32，采集模式为透射，每个压片采集2个点的光谱并取其平均值作为该压片的光谱数据。

1.4 数据处理与统计分析

利用MATLAB 2016a和Unscrambler 10.4软件对光谱数据进行处理和建模分析，利用Origin Pro 9.0软件进行图表绘制，利用SPSS 19.0软件进行显著性分析。

2 结果与分析

2.1 茶树各器官铅累积情况

为了探索茶树对铅气溶胶颗粒物的吸收状况，本研究测定了整个试验过程中茶树各器官的铅含量，结果如图1所示。

图1

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图1   在不同质量浓度铅气溶胶胁迫过程中茶树不同器官的铅含量变化

A.‘乌牛早’；B.‘迎霜’。CK：0 μg/m3铅气溶胶处理组；LP：100 μg/m3铅气溶胶处理组；HP：500 μg/m3铅气溶胶处理组（下同）。

Fig. 1   Changes of lead contents in different organs of tea plants under different concentrations of lead aerosol stress

A. ‘Wuniuzao’; B. ‘Yingshuang’. CK: 0 μg/m3 lead aerosol treatment group; LP: 100 μg/m3 lead aerosol treatment group; HP: 500 μg/m3 lead aerosol treatment group (the same as below).


从叶片的铅含量来看，2个品种茶树CK组的叶片铅含量均未超过食品安全国家标准（GB　2762—2017）中对茶叶的限量要求（5.0 mg/kg），这说明在自然无空气污染情况下生长的茶树叶片符合食品安全国家标准，而存在铅污染胁迫的LP组和HP组的茶树叶片铅含量则严重超标。‘乌牛早’与‘迎霜’的HP组叶片中的含铅量分别达到了39.18、69.49 mg/kg，比对应的CK组高出1个数量级，这说明存在大气-叶面吸收途径。HP组的2个品种的茶树叶片在第14天和第28天时的铅含量差异不大，但在第42天时出现了成倍增长的情况。在茶树品种间的差异方面，‘迎霜’的铅含量所表现出来的规律与‘乌牛早’基本一致，但在第42天时‘迎霜’HP组叶片中的含铅量比同种条件下‘乌牛早’高出大约30 mg/kg。

2.2 茶树叶片光合色素含量变化

叶绿素与植物的光合作用密切相关，其含量变化可直接影响植物的生长状况。而在茶树受到重金属毒害的过程中，类胡萝卜素是保护叶绿素免受破坏的另一种重要的光合色素，它可以对叶绿素捕获光能起到补充作用，又被称作辅助色素[18]。在试验过程中测得的叶绿素a、叶绿素b和类胡萝卜素含量变化如图2所示。

图2

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图2   在不同质量浓度铅气溶胶胁迫过程中茶树叶片叶绿素a、叶绿素b和类胡萝卜素含量的变化

A～C.‘乌牛早’；D～F.‘迎霜’。短栅上不同小写字母表示不同处理间在P＜0.05水平差异有统计学意义（下同）。

Fig. 2   Changes of chlorophyll a, chlorophyll b and carotenoid contents of tea plant leaves under different concentrations of lead aerosol stress

A-C. ‘Wuniuzao’; D-F. ‘Yingshuang’. Different lowercase letters above bars indicate significant differences among different treatments at the 0.05 probability level (the same as below).


对于‘乌牛早’品种，LP组与HP组的叶绿素a、叶绿素b和类胡萝卜素含量变化均表现出相同的趋势，即在胁迫前期（第14天—第28天），光合色素含量增加，在胁迫后期（第28天—第42天），光合色素含量快速下降。

对于‘迎霜’品种，在胁迫的前中期，CK组的3种光合色素含量均出现了减少的情况，且变化量要大于‘乌牛早’品种的CK组。LP组与HP组的叶绿素a、叶绿素b和类胡萝卜素含量变化趋势与‘乌牛早’品种基本一致，呈现先上升再下降的趋势；‘迎霜’品种HP组的叶绿素含量在胁迫的中后期显著低于同时期‘迎霜’品种LP组的叶绿素含量，而‘乌牛早’品种则没有这样的趋势。这可能是由于HP组的‘迎霜’品种在胁迫的中后期比HP组的‘乌牛早’品种累积了更多的铅（图1），叶绿素的合成受到了更大的影响。

2.3 茶树叶片抗氧化物含量变化

抗坏血酸和谷胱甘肽是植物体内常见的抗氧化剂，能维持活性氧平衡，清除在逆境环境中植物体内产生的活性氧自由基，形成完善的防御系统。这2种物质的含量变化能充分反映出茶树受铅毒害的情况。在试验过程中测得的抗坏血酸和谷胱甘肽含量变化如图3所示。

图3

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图3   在不同质量浓度铅气溶胶胁迫过程中茶树叶片抗坏血酸和谷胱甘肽含量的变化

A～B.‘乌牛早’；C～D.‘迎霜’。

Fig. 3   Changes of ASA and GSH contents of tea plant leaves under different concentrations of lead aerosol stress

A-B. ‘Wuniuzao’; C-D. ‘Yingshuang’.


除了‘迎霜’品种的LP组，其他的铅处理组抗坏血酸含量均呈现先上升后下降的趋势。另外，在胁迫结束时（第42天），‘乌牛早’品种3个处理组的抗坏血酸含量无显著差异，而‘迎霜’品种HP组与LP组的抗坏血酸含量仍然显著高于CK组。这可能是由于‘迎霜’品种内部合成抗坏血酸的生理系统仍然在正常发挥作用。

‘乌牛早’品种LP组和HP组以及‘迎霜’品种LP组的谷胱甘肽含量均随着胁迫进行而不断增加，且在胁迫中期（第28天）均显著高于同时期CK组的谷胱甘肽含量。

2.4 FTIR光谱分析

为了更好地揭示在铅气溶胶胁迫下茶树的生理生化变化，采用FTIR光谱技术对铅气溶胶胁迫下茶树鲜叶的光谱响应特征进行研究。选择胁迫后期生理生化指标变化较大的第42天样本进行光谱分析，结果如图4所示。

图4

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图4   在不同质量浓度铅气溶胶胁迫第42天时茶树鲜叶的平均FTIR光谱

A.‘乌牛早’；B.‘迎霜’。

Fig. 4   Average FTIR spectra of tea plant fresh leaves on day 42 under different concentrations of lead aerosol stress

A. ‘Wuniuzao’; B. ‘Yingshuang’.


从中可以看到，FTIR光谱中几个比较明显的吸收峰分别位于1 060、1 146、1 247、1 516、1 546、1 640、1 738、2 920 cm－1处。其中：1 060 cm－1处一般被认为是C—O拉伸，可能与不同的多糖有关[19]；1 146 cm－1处反映的是纤维素的C—O—C拉伸；1 247 cm－1处被认为是N—H和C—N的拉伸，与蛋白质的酰胺Ⅲ带有关[20]；1 516、1 546、1 640 cm－1处对应羧基的C—O不对称振动或N—H振动，是蛋白质红外吸收的典型特征峰[21]；1 738 cm－1处对应酯羰基CO的伸缩振动，可能为果胶酯基；2 920 cm－1附近为—CH3的对称拉伸和—CH2—的不对称拉伸，表明结构中存在脂质[22]。

为了进一步了解铅处理对茶树鲜叶FTIR光谱的影响，对2个品种在不同质量浓度铅气溶胶胁迫第42天时所有鲜叶样本的光谱进行方差分析，各个波数所对应的P值如图5所示。在984～1 069、1 146～1 165、1 699～1 702、1 723～1 739、2 856～2 899、2 984～3 066 cm－1范围内P＜0.05，结合图4中几个明显的特征峰可以发现，1 060、1 146、1738 cm－1位于这个范围中，说明多糖、纤维素和果胶含量的变化与铅气溶胶胁迫显著相关。

图5

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图5   第42天茶树鲜叶的平均FTIR光谱与不同质量浓度铅气溶胶胁迫间的方差分析结果

Fig. 5   Results of analysis of variance between average FTIR spectra of tea plant fresh leaves and different concentrations of lead aerosol stress on day 42


2.5 基于FTIR光谱的茶树叶片生理生化指标回归模型

叶绿素等光合色素在茶树生长和茶叶品质评价中起着重要作用，利用FTIR光谱技术快速定量测定叶片中的叶绿素和类胡萝卜素有助于对重金属污染下茶树鲜叶的质量进行快速判断。本研究采集了2个品种的茶树鲜叶共80个样本，对每个样本制作的3个压片采集FTIR光谱信息，共获得了240条光谱数据，以其中的160条作为建模集、80条作为预测集进行建模。具体的分割方法为：按照各指标的化学测量值大小将样本排序，从每3个中选择1个作为预测集，另外2个作为建模集。

2.5.1 全波段模型

以400～4 000 cm－1的光谱数据作为自变量，以测得的光合色素含量和抗氧化物含量作为因变量，建立偏最小二乘回归（partial least squares regression, PLS）模型。为了消除光谱测量过程中受到的环境、仪器稳定性、光散射等多因素的影响，有必要对原始数据进行预处理[23]。本研究选择3种预处理方法，即标准正态变换（standard normal variate, SNV）、多元散射校正（multiplicative scatter correction, MSC）、SG平滑（Savitzky-Golay smoothing, SG）算法，最终的建模结果如表1所示。从中可以看到，叶绿素a、叶绿素b、类胡萝卜素、抗坏血酸、谷胱甘肽的最优预处理方法分别为MSC、SG、MSC、SG、MSC，所对应的预测集相关系数（rp）分别为0.612、0.638、0.528、0.542、0.457，对各个指标预测准确度的排序为叶绿素b＞叶绿素a＞抗坏血酸＞类胡萝卜素＞谷胱甘肽。

表1   基于不同预处理方法的全波段PLS建模结果

Table 1  Results of full wave-band PLS models built on different pretreatment methods

指标

Index

预处理方法

Pretreatment method

建模结果 Modeling result
rcRMSEcrvRMSEvrpRMSEp

叶绿素a

Chl a

SNV0.8290.1500.7790.1680.5260.240
MSC0.7600.1920.7060.2120.6120.224
SG0.7360.1900.6640.2110.5400.238

叶绿素b

Chl b

SNV0.7620.0850.6980.0940.6350.105
MSC0.7750.0830.7180.0920.5970.109
SG0.6980.0940.5870.1070.6380.105

类胡萝卜素

Car

SNV0.6720.0370.5750.0410.4970.045
MSC0.6770.0360.5820.0410.5280.045
SG0.6470.0380.5750.0400.4060.048

抗坏血酸

ASA

SNV0.6961.1140.6371.2030.5121.460
MSC0.6571.1670.6001.2500.5331.437
SG0.6091.2540.4961.3870.5421.427

谷胱甘肽

GSH

SNV0.6384.1610.5454.5720.4447.905
MSC0.6434.1560.5644.5340.4577.843
SG0.6204.1520.5044.5820.4527.872

rc：建模集相关系数；RMSEc：建模集均方根误差；rv：交互验证相关系数；RMSEv：交互验证均方根误差；rp：预测集相关系数；RMSEp：预测集均方根误差。各指标对应的RMSEc、RMSEv、RMSEp单位：叶绿素a，mg/g；叶绿素b，mg/g；类胡萝卜素，mg/g；抗坏血酸，mmol/g；谷胱甘肽，μmol/g。下同。

rc: Correlation coefficient of calibration set; RMSEc: Root-mean-square error of calibration set; rv: Correlation coefficient of cross validation; RMSEv: Root-mean-square error of cross validation; rP: Correlation coefficient of prediction set; RMSEp: Root-mean-square error of prediction set. The unit of RMSEc, RMSEv and RMSEp corresponding to each index: Chl a, mg/g; Chl b, mg/g; Car, mg/g; ASA, mmol/g; GSH, μmol/g. The same as below.

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2.5.2 特征变量模型

FTIR光谱具有较高的分辨率和较广的检测波段范围，包含大量的冗余变量和多共线性[24]，导致整个建模过程既耗时又低效。本研究中的FTIR光谱有7 468个变量，因此，有必要缩减模型变量数[25]。

在PLS模型建立过程中，样本的变量会经过一次成分提取。根据以往的建模经验与实际的尝试比较，本研究中的PLS模型变量提取数设定为7个，相较于无监督的主成分提取算法，PLS算法所提取出的这7个成分能更大程度地携带对应指标的特征信息。本研究选择预处理后建模效果最好的PLS模型所提取出的7个成分作为FTIR光谱中7 468个变量的代表，并利用支持向量机（support vector machine, SVM）与人工神经网络（artificial neural network, ANN）建立特征变量模型，最终得到的建模结果如表2所示。从中可以看到，相较于全波段PLS模型，特征变量模型的预测性能有了较大幅度的提升：叶绿素a的最优rp由0.612提升到0.810，叶绿素b由0.638提升到0.786，类胡萝卜素由0.528提升到0.628，抗坏血酸由0.542提升到0.768，谷胱甘肽由0.457提升到0.689。

表2   基于PLS所提取成分建立的特征变量模型结果

Table 2  Results of characteristic variable models built on components extracted by PLS

指标

Index

建模方法

Modeling method

建模结果 Modeling result
rcRMSEcrvRMSEvrpRMSEp

叶绿素a

Chl a

MSC+SVM0.7990.1700.7560.1850.7060.189
MSC+ANN0.8200.0250.7910.0280.8100.032

叶绿素b

Chl b

SG+SVM0.7640.0880.6960.0960.7660.085
SG+ANN0.8000.0060.8090.0050.7860.008

类胡萝卜素

Car

MSC+SVM0.6800.0380.5970.0410.5510.041
MSC+ANN0.6460.0010.6130.0020.6280.002

抗坏血酸

ASA

SG+SVM0.7461.0560.6791.1520.6281.086
SG+ANN0.8470.6490.8070.8410.7680.964

谷胱甘肽

GSH

MSC+SVM0.7003.9370.6184.3350.6233.754
MSC+ANN0.76113.3810.71211.6700.68911.970

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3 讨论

本研究结果表明，在正常环境条件下茶树叶片的铅含量极少，符合食品安全国家标准，根的铅含量远高于叶，证明在正常环境条件下土壤-根途径是茶树积累铅的主要途径。随着胁迫时间的延长，高质量浓度铅胁迫组叶片的铅含量显著高于茎和根，且最高可达无铅处理组（CK组）的14倍，证明存在大气-叶面吸收途径。SCHRECK等[26]也研究发现，在大气胁迫的情况下，生菜和黑麦草的叶片可以吸收重金属，并将其大部分储存在叶片中，仅有小部分向其他部位转运。铅气溶胶重度污染（HP）组茶树叶片铅含量成倍增长，这可能是因为在胁迫后期，植物自身抗重金属毒害作用的体系被破坏，导致内部生理系统紊乱，铅离子被大量交换吸收而进到植物体内。另外，HP组‘迎霜’品种的叶片在试验最后一天（第42天）比同处理的‘乌牛早’品种叶片积累了更多的铅，这说明在重度空气污染环境下，相比于‘乌牛早’，在抗重金属毒害体系被破坏的情况下，铅更容易进到‘迎霜’茶树体内。这可能是由于不同品种茶树叶片的防御机制不同。TOMASEVIC等[27]的研究表明，不同品种叶片表皮特征不同，其叶片中重金属残留量也不同。

茶树叶片中的铅过量积累除了会通过食物链进入人体而对人体健康产生危害，也会破坏叶绿体结构[28]，抑制光合作用的进行，并最终导致茶树生长受阻，茶叶产量降低而造成经济损失。因此，在研究铅污染对茶树的影响时，有必要针对茶树叶片光合色素含量的变化展开研究。2个品种CK组叶片的叶绿素含量在试验期间有不同程度的减少，这可能是由于试验时间在冬季，天气逐渐寒冷导致植物叶绿素含量减少。许永安[29]的研究表明，在低温胁迫条件下甜瓜幼苗的叶绿素含量减少。在本研究的整个试验过程中，铅胁迫组光合色素的变化量均比同时期CK组的要大，说明除了气温的影响，铅胁迫也对光合色素含量的变化产生了影响。在胁迫前期，光合色素含量增长的原因可能是茶树应激反应导致光合色素快速合成，而到了胁迫后期，叶片内积累了大量的铅，导致茶树内部生理系统发生紊乱，无法再有效地合成光合色素。NATASHA等[30]的研究也发现了类似现象：低浓度的砷胁迫会促进菠菜叶绿素的合成，而高浓度的砷胁迫则会大幅减少菠菜的叶绿素含量。‘迎霜’CK组的光合色素减少量和减少的时间与‘乌牛早’CK组不同，这可能是由不同品种对气温变化的反应速度与程度不同造成的。

植物在受到重金属的毒害作用时，会产生大量的活性氧物质，导致体内氧化还原平衡状态遭到破坏，因此，植物会倾向于产生更多的抗氧化剂来抵御重金属的毒害作用。抗氧化剂的含量也成了反映植物受重金属胁迫作用的一项重要指标。铅胁迫组抗坏血酸含量均呈现出先上升后下降的趋势，说明在胁迫的前中期茶树产生了更多的抗坏血酸来抵抗铅产生的氧化损伤，在胁迫后期，茶树的抗氧化体系被铅损伤，其体内积累的铅超过了所能承受的上限，导致抗坏血酸的合成量下降。铅胁迫组的谷胱甘肽含量总体上要高于同时期的CK组，说明铅胁迫使茶树合成了更多的谷胱甘肽来抵抗氧化损伤。

从FTIR光谱曲线可以发现，不同处理组鲜叶的光谱曲线形状基本一致，仅吸光度值的大小不同，说明不同处理组以及2个品种茶树鲜叶内部的物质组成基本相同，但铅气溶胶胁迫改变了茶树叶片的内部物质含量。‘迎霜’品种有无铅处理所带来的光谱差异要大于‘乌牛早’品种，这可能是因为‘迎霜’品种茶树在第42天时积累了更多的铅，内部物质的变化程度更大。在一些特征峰位置处FTIR光谱曲线的差异表明，除了光合色素，空气中铅气溶胶胁迫还对叶片中其他物质的含量产生了影响，结合显著性分析的结果，1 060、1 146 cm－1处的光谱变化与铅气溶胶胁迫更相关，对应的物质为多糖与纤维素，说明在受到铅气溶胶胁迫时茶树叶片多糖与纤维素含量会发生显著变化，这需要以后更进一步的研究来进行确认。

对于不同指标，全波段PLS模型预测效果相差较大，并且各个指标取得最优建模效果的预处理方法也不同，说明不同内含物在光谱特征的分布上存在差异。对于叶绿素的建模效果较好的原因可能是叶片中的叶绿素含量较高，光谱特征相较于含量较少的类胡萝卜素、抗坏血酸和谷胱甘肽更为明显。经过特征变量提取后，基于ANN方法和SVM方法建立的特征变量模型的预测性能相比于全波段PLS模型均有了显著的提升，并且大部分指标通过ANN方法建立的模型的效果要优于通过SVM方法建立的模型，但对于谷胱甘肽，用ANN方法建立的模型残差过大，出现了过拟合的情况，因此，对于谷胱甘肽的快速检测，SVM仍然是一种值得考虑的方法。

4 结论

本文通过不同质量浓度的Pb(NO3)2气溶胶环境模拟了不同程度污染的大气环境，进行了以下研究，并得出了相关结论：

1）研究了在铅气溶胶胁迫下生长的茶树各器官的铅累积情况。结果发现，在不存在铅污染时，自然生长的茶树叶片中的铅含量符合食品安全国家标准；而当环境中存在高质量浓度铅气溶胶污染时，存在大气-叶面吸收途径，导致茶树叶片中的铅含量超出安全标准，并且不同品种的茶树对铅的累积量也不相同，在高质量浓度铅气溶胶污染环境下，‘迎霜’会积累更多的铅在叶片中。

2）研究了在铅气溶胶胁迫下茶树在生长过程中叶片光合色素含量与抗氧化物含量的变化，发现随着胁迫时间的延长，光合色素含量与抗坏血酸含量呈现出先升后降的趋势，谷胱甘肽含量呈现出不断上升的趋势，说明叶片中的铅积累会导致茶树鲜叶中的叶绿素a、叶绿素b、类胡萝卜素含量以及抗坏血酸、谷胱甘肽含量发生显著改变，未来可基于叶片这些指标的变化对茶树受铅气溶胶损害的程度进行判断。

3）基于FTIR光谱分别建立了光合色素和抗氧化物的全波段PLS模型，发现不同的指标适合不同的光谱预处理方法，之后利用全波段PLS模型所提取出的主成分建立了特征变量模型。结果表明，特征变量模型的性能普遍优于全波段PLS模型，其中用ANN方法建立的模型相关系数rp最高可达0.810，说明利用FTIR光谱技术对茶树鲜叶的生理生化指标进行预测具有可行性，且特征变量提取能够大幅改善光谱检测模型的性能。

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