浙江大学学报（农业与生命科学版）

浙江大学学报（农业与生命科学版）, 2022, 48(3): 321-335 doi: 10.3785/j.issn.1008-9209.2021.04.282

食品科学

基于两步水解法制备三疣梭子蟹调味品的酶解工艺优化研究

陈瑜,,1,2,3, 马剑锋4, 许丹1,2,3, 张小军,,1,2,3, 何鹏飞1,2,3

1.浙江省海洋水产研究所，浙江 舟山 316021

2.农业农村部重点渔场渔业资源科学观测实验站，浙江 舟山 316021

3.浙江省海洋渔业资源可持续利用技术研究重点实验室，浙江 舟山 316021

4.浙江海洋大学食品与医药学院，浙江 舟山 316022

Optimization of enzymolysis technology for preparing Portunus trituberculatus seasoning based on a two-step hydrolysis method

CHEN Yu,,1,2,3, MA Jianfeng4, XU Dan1,2,3, ZHANG Xiaojun,,1,2,3, HE Pengfei1,2,3

1.Zhejiang Marine Fisheries Research Institute, Zhoushan 316021, Zhejiang, China

2.Scientific Observing and Experimental Station of Fishery Resources for Key Fishing Grounds, Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Zhoushan 316021, Zhejiang, China

3.Key Laboratory of Sustainable Utilization of Technology Research for Fishery Resource of Zhejiang Province, Zhoushan 316021, Zhejiang, China

4.Food and Medicine School, Zhejiang Ocean University, Zhoushan 316022, Zhejiang, China

通讯作者: 张小军（https://orcid.org/0000-0001-8807-5450），E-mail：xiaojun3627@163.com

收稿日期: 2021-04-28   接受日期: 2021-08-11  

基金资助: 浙江省舟山市科技计划项目.  2019C31051

Received: 2021-04-28   Accepted: 2021-08-11  

作者简介 About authors

陈瑜（https://orcid.org/0000-0001-5053-9766），E-mail：chenxiaoyu2141@163.com , E-mail：chenxiaoyu2141@163.com

摘要

本研究旨在建立以三疣梭子蟹蒸煮液为原料制备调味品的最佳酶解工艺。以鲜味氨基酸含量为评价指标，通过响应面实验设计优化确定碱性蛋白酶、风味蛋白酶依次水解的两步酶解工艺，并采用顶空固相微萃取（headspace-solid phase microextraction, HS-SPME）结合气相色谱-质谱联用（gas chromatography-mass spectrometry, GC-MS）技术对三疣梭子蟹二次酶解后产生的挥发性风味物质进行定性与定量分析。结果表明：一次酶解最佳工艺条件为碱性蛋白酶添加量6 825 U/g、初始水解pH 8.45、水解时间2.50 h，得到的酶解液中鲜味氨基酸质量浓度为（7.18±0.09） mg/mL；二次酶解最佳酶解工艺条件为风味蛋白酶添加量3 750 U/g、初始水解pH 6.81、水解时间3.33 h，得到的酶解液中鲜味氨基酸质量浓度为（10.49±0.12） mg/mL，两步酶解优化后酶解液中鲜味氨基酸含量比梭子蟹蒸煮液提高了135.2%。二次酶解液中共定性检测到62种挥发性风味成分，其中己醛、苯甲醛和不饱和醇为挥发性风味主要贡献物质。本研究结果为研发蒸煮液调味产品和三疣梭子蟹加工副产物高值化利用提供了理论依据。

关键词： 三疣梭子蟹蒸煮液 ; 两步水解 ; 鲜味氨基酸 ; 响应面分析 ; 挥发性风味物质

Abstract

The objective of this study was to establish the optimum enzymolysis technology for Portunus trituberculatus seasoning based on the cooking liquor. Taking the flavor amino acid contents as evaluation indicators, a two-step enzymolysis technology with alcalase and flavorzyme was determined by response surface optimization methodology, and volatile flavor compounds in the secondary enzymolysis liquor were qualitatively and quantitatively analyzed by headspace-solid phase microextraction (HS-SPME) with gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS). The results indicated that the optimum technological conditions of the primary enzymolysis were alcalase of 6 825 U/g, primary hydrolysis pH 8.45, hydrolysis time of 2.50 h, and the content of flavor amino acid in the hydrolysate was (7.18±0.09) mg/mL. The optimum technological conditions of the secondary enzymolysis were flavorzyme of 3 750 U/g, primary hydrolysis pH 6.81, hydrolysis time of 3.33 h, and the content of flavor amino acid in flavor precursors of P. trituberculatus seasoning was (10.49±0.12) mg/mL, which was 135.2% higher than that of P. trituberculatus cooking liquor. There were 62 volatile flavor compounds in the secondary hydrolysate; among them, hexanal, benzaldehyde and unsaturated alcohol were the main flavor components.The results provide a theoretical basis for the research of seasoning products of cooking liquor and high value utilization of P. trituberculatus.

Keywords： Portunus trituberculatus cooking liquor ; two-step hydrolysis ; flavor amino acids ; response surface analysis ; volatile flavor compounds

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本文引用格式

陈瑜, 马剑锋, 许丹, 张小军, 何鹏飞. 基于两步水解法制备三疣梭子蟹调味品的酶解工艺优化研究. 浙江大学学报（农业与生命科学版）[J]. 2022, 48(3): 321-335 doi:10.3785/j.issn.1008-9209.2021.04.282

CHEN Yu, MA Jianfeng, XU Dan, ZHANG Xiaojun, HE Pengfei. Optimization of enzymolysis technology for preparing Portunus trituberculatus seasoning based on a two-step hydrolysis method. Journal of Zhejiang University （Agriculture & Life Sciences）[J]. 2022, 48(3): 321-335 doi:10.3785/j.issn.1008-9209.2021.04.282

三疣梭子蟹（Portunus trituberculatus）是浙江省重要的经济海捕蟹，2020年全省捕捞总量达16万t[1]。除鲜销外，三疣梭子蟹主要被加工成蟹肉罐制品和蟹肉糜制品，为浙江省出口水产品的重要支柱。在蟹肉罐制品加工过程中，蟹蒸制阶段会产生大量的蒸煮液，每生产1 t蟹肉将产生1 t左右的蒸煮液[2]。目前蒸煮液大多作为加工废弃物被丢弃，不仅浪费资源，还会污染环境[3-4]；同时，企业还要花费大量精力和资金进行废水处理，以满足环保要求。利用蛋白酶水解技术所获得的酶解液通常富含各种游离氨基酸，可用于增加调味品的鲜香味[5-6]。酶的作用位点具有专一性，利用单一蛋白酶水解原料时，水解度低，风味物质得不到高度释放。将内肽酶与外肽酶联合使用不但可以有效降低酶解液的苦味，还能显著提高水解度，有利于制备出风味浓郁的水产调味品基料[7-8]。目前海产蒸煮液的加工利用多以鱼、虾和贝类[9-12]为原料，对于三疣梭子蟹蒸煮液加工利用的研究基本处于空白阶段。因此，利用目前沿海地区梭子蟹肉罐制品加工过程中产生的大量废弃蒸煮液，通过合适的酶解工艺来制备特殊风味的调味品，既能够实现加工副产物再利用，又可以解决废水排放带来的环境污染等问题。

本研究通过响应面实验设计，以酶解液中鲜味氨基酸含量为评价指标，对三疣梭子蟹蒸煮液的酶解工艺进行优化，筛选最佳的双酶两步酶解组合工艺，从而制备富含氨基酸、多肽等滋味物质的三疣梭子蟹调味品风味前体物质。同时，利用顶空固相微萃取结合气相色谱-质谱联用（headspace-solid phase microextraction-‍gas ‍chromatography-‍mass ‍spectrometry, HS-SPME-GC-MS）技术定性与定量检测酶解液中烃类、醇类、醛类、酮类、酸类、酯类等挥发性物质，以期为三疣梭子蟹加工副产物高值化利用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

三疣梭子蟹规格为200～300 g，于2019年8—9月购自浙江省舟山国际水产交易市场；碱性蛋白酶（2.0×105 U/g）、风味蛋白酶（1.5×104 U/g）、木瓜蛋白酶（1.0×105 U/g）、中性蛋白酶（2.0×105 U/g）、胰蛋白酶（1.0×105 U/g），购自北京索莱宝生物科技有限公司；氢氧化钠、氯化氢、浓硫酸、无水硫酸铜、硫酸钾、磺基水杨酸等常规试剂，购自上海国药集团化学试剂有限公司；氨基酸标准品，购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.2 仪器与设备

DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器，购自邦西仪器科技（上海）有限公司；FE20型pH计，购自梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；L-8900型氨基酸分析仪，购自日本日立高新技术公司；PAL-1折光仪，购自广州市爱宕科学仪器有限公司；T18 basic均质机，购自德国IKA公司；Avanti JXN-30离心机，购自美国贝克曼库尔特公司；7890A-5975C型气相色谱-质谱联用仪，购自美国Agilent公司。

1.3 实验方法

1.3.1 三疣梭子蟹酶解液制备

将三疣梭子蟹开壳去螯足后置于蒸架上，蒸锅内加水，蟹与水的料液体积比为3∶1，蒸煮15～20 min，此时固形物含量约为6%。将蒸煮液浓缩至蒸煮后水体积的1/3，此时固形物含量约为15%。将浓缩后的蒸煮液进行均质，设置均质压力为60 MPa，均质时间为5 min。每次酶解前调节蒸煮液至适宜初始pH和酶解温度，加入蛋白酶优化酶解条件，每次酶解结束后置于沸水中灭酶10 min。将灭酶后的酶解液在20 ℃、8 000 g条件下离心5 min后过滤除去不溶性物质，取上清液冷藏，待测。

1.3.2 pH调节

用5 mol/L HCl或5 mol/L NaOH将蒸煮液或一次酶解后酶解液pH调节至目标值±0.5，进一步用0.5 mol/L HCl或0.5 mol/L NaOH微调至目标pH。

1.3.3 酶的筛选
1.3.3.1 单酶筛选

取300 mL浓缩蒸煮液（含蛋白质9.1%），分别选取碱性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、风味蛋白酶和胰蛋白酶进行酶解，加酶量为1×105 U/g，水解时间2 h，最适初始水解pH和水解温度参考商品化酶试剂的使用说明书（表1），在此条件下以酶解液中游离氨基酸含量为评价指标，从中筛选适合进行复合酶解的三疣梭子蟹酶解的最佳蛋白酶。

表1   各种蛋白酶的酶解反应特性

Table 1  Specialties of several proteases during enzymolysis

蛋白酶编号

Protease number

蛋白酶名称

Protease name

特性

Feature

最适pH

Optimum pH

最适温度

Optimum temperature/℃

①碱性蛋白酶 Alcalase内肽酶8.550
②风味蛋白酶 Flavourzyme内肽酶+外肽酶6.550
③木瓜蛋白酶Papain内肽酶6.050
④中性蛋白酶 Neutrase内肽酶7.050
⑤胰蛋白酶 Trypsin内肽酶7.545

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1.3.3.2　复合酶组合确定

经筛选得到碱性蛋白酶、中性蛋白酶和风味蛋白酶这3种水解产物游离氨基酸含量高且风味好的蛋白酶，以此为研究对象对三疣梭子蟹蒸煮液进行两步酶解，双酶总加酶量为1×105 U/g，添加比例为1∶1，蛋白酶组合及相应酶解条件如表2所示。

表2   复合蛋白酶的酶解条件

Table 2  Enzymolysis conditions of complex proteases

酶解方式

Enzymolysis mode

pH

温度

Temperature/℃

t/h
碱性蛋白酶→风味蛋白酶 Alcalase→Flavourzyme8.5→6.5502+2
中性蛋白酶→风味蛋白酶 Neutrase→Flavourzyme6.0→6.5502+2
碱性蛋白酶→中性蛋白酶 Alcalase→Neutrase8.5→6.0502+2
风味蛋白酶→碱性蛋白酶 Flavourzyme→Alcalase6.5→8.5502+2
风味蛋白酶→中性蛋白酶 Flavourzyme→Neutrase6.5→6.0502+2

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1.3.4 测定指标
1.3.4.1 游离氨基酸含量

参考王虎虎等[13]的测定方法并稍作修改。取1 mL酶解液，加入2 mL 3%磺基水杨酸溶液，充分混匀后沉淀2 h，在1×105g条件下离心15 min，取上清液用0.22 μm滤膜过滤，滤液使用全自动氨基酸分析仪[14]测定游离氨基酸含量。

1.3.4.2　鲜味氨基酸含量

利用全自动氨基酸分析仪测定游离氨基酸种类和含量，计算天冬氨酸（Asp）、谷氨酸（Glu）、甘氨酸（Gly）、丙氨酸（Ala）得到的总和即为鲜味氨基酸含量。

1.3.4.3　感官评分

实验的感官评定由10人组成的专业评定小组完成，采用10分制，总分30分，以色泽、气味和滋味3项指标为评价标准，结果剔除异常数后取平均值[15]，感官评分标准见表3。

表3   感官评分标准

Table 3  Sensory evaluation standards

评价指标

Evaluation indicator

评价等级

Evaluation grade

评价标准

Evaluation criterion

得分

Score

色泽 Color一级红褐色8～10
二级棕褐色4～7
三级发黑1～3
气味 Smell一级蟹香味浓郁，无不良气味8～10
二级蟹香味较淡，稍有腥味4～7
三级蟹香味不明显，重腥味1～3
滋味 Taste一级蟹鲜味浓，无苦味8～10
二级蟹鲜味淡，微苦4～7
三级无蟹味，苦味重1～3

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1.3.5 工艺优化实验 1.3.5.1 单因素实验

蒸煮液一次酶解实验。取300 mL浓缩蒸煮液，参考商品化酶试剂说明书，在碱性蛋白酶最适水解温度（50 ℃）下，以游离氨基酸含量为评价指标，考察加酶量（3 000、4 500、6 000、7 500、9 000 U/g）、初始pH（7.5、8.0、8.5、9.0、9.5）、水解时间（1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 h）对三疣梭子蟹蒸煮液一次酶解工艺的影响。

蒸煮酶解液二次酶解实验。取300 mL一次酶解后灭酶的酶解液，参考商品化酶试剂说明书，在风味蛋白酶最适水解温度（50 ℃）下，以游离氨基酸含量为评价指标，考察加酶量（750、1 500、3 000、4 500、6 000 U/g）、初始pH（5.0、6.0、7.0、8.0、9.0）、水解时间（1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 h）对三疣梭子蟹蒸煮酶解液二次酶解工艺的影响。

1.3.5.2　响应面法优化三疣梭子蟹调味品风味前体物质酶解工艺

游离氨基酸中的鲜味氨基酸包括呈鲜味的Asp、Glu和呈甜味的Gly、Ala，对酶解液的滋味特别是鲜味呈现起到重要作用。为探究各个因素交互作用对鲜味氨基酸含量的影响，以单因素实验为基础，选取酶添加量（A）、初始pH（B）和水解时间（C）3个因素，按照表4和表5因素水平表，以一次酶解鲜味氨基酸含量Y1和二次酶解鲜味氨基酸含量Y2为响应值，采用Box-Behnken的中心组合实验设计原理对三疣梭子蟹蒸煮液两步酶解工艺进行响应面法优化。

表4   碱性蛋白酶响应面法优化实验因素与水平

Table 4  Optimized factors and levels of response surface methodology (RSM) of alcalase

水平

Level

因素Factor

A1酶添加量

Enzyme dosage/(U/g)

B1初始pH

Primary pH

C1水解时间

Hydrolysis time/h

－14 5008.02.0
06 0008.52.5
17 5009.03.0

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表5   风味蛋白酶响应面法优化实验因素与水平

Table 5  Optimized factors and levels of RSM of flavourzyme

水平

Level

因素Factor

A2酶添加量

Enzyme dosage/(U/g)

B2初始pH

Primary pH

C2水解时间

Hydrolysis time/h

－11 5006.02.0
03 0007.03.0
14 5008.04.0

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1.3.6 挥发性风味物质测定

参考乔宇航等[16]的方法并略作调整。

顶空固相微萃取条件：称取2 g三疣梭子蟹酶解液移入15 mL样品瓶，选择50/30 μm PDMS/CAR/DVB（2 cm）萃取纤维头，设定萃取装置温度为70 ℃，顶空萃取50 min，于250 ℃条件下解析5 min，进样分析。

色谱条件：色谱柱为HP-INNOWAX（60.0 m×250 μm，0.25 μm）；升温程序为起始温度40 ℃保持5 min，再以5 ℃/min的速率升至230 ℃并保持10 min；载气为He，载气流量为1.0 mL/min；不分流进样。

质谱条件：电离方式为电轰击电离（EI），电子能量70 eV，离子源温度230 ℃，四极杆温度150 ℃；扫描模式为Scan；扫描质量范围为35～500 amu。

1.3.7 数据统计与分析

单因素实验采用Origin 8.5作图，利用DPS 9.50进行数据分析；采用Design-Expert 8.0.6中Box-Behnken法进行响应面设计[17]，并进行响应面分析。

2 结果与分析

2.1 蛋白酶的筛选结果

内肽酶进行酶解时与疏水基团的结合性较差，易形成小分子量的苦味肽，而外肽酶则可以通过切除此类疏水性多肽分子弱化苦味强度，改善酶解液的滋味[18-19]。碱性蛋白酶和中性蛋白酶是内肽酶，风味蛋白酶是内、外肽酶。为了改善酶解液的苦味并提高游离氨基酸含量，实验中选用双酶两步酶解来制备三疣梭子蟹蒸煮液。由图1A可知，中性蛋白酶+风味蛋白酶组合和碱性蛋白酶+风味蛋白酶组合水解产物中游离氨基酸含量没有显著性差异；而以感官评分作为评价指标时，两个组合感官评价得分有显著性差异，碱性蛋白酶+风味蛋白酶组合得分最高（图1B）。感官代表对风味的直观感受，是产品品质的重要特性，朱广琪等[7]、李芳浩等[20]结合感官评价采用碱性蛋白酶+风味蛋白酶两步酶解法研究了酶解液制备工艺，分别得到了高品质金华火腿风味基料和中国对虾调味料风味前体物质。本研究将碱性蛋白酶作为内肽酶，将疏水性氨基酸和碱性氨基酸水解暴露出来，再进一步利用风味蛋白酶作为外肽酶切除这2类氨基酸，使鲜味物质得到充分释放。综上所述，本研究选择碱性蛋白酶+风味蛋白酶组合进行后续两步酶解条件优化实验。

图1

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图1   蛋白酶种类对游离氨基酸含量（A）和感官评分（B）的影响

图中序号所代表的含义详见表1。短栅上不同小写字母表示在P＜0.05水平差异有统计学意义。

Fig. 1   Effects of protease types on free amino acid contents (A) and sensory scores (B)

Please see the Table 1 for the details of each number. Different lowercase letters above bars indicate significant differences at the 0.05 probability level.


2.2 单因素实验结果

2.2.1 酶添加量对蒸煮液酶解效果的影响

图2A表明，当碱性蛋白酶添加量在3 000～6 500 U/g时，游离氨基酸含量随着蛋白酶添加量的增加而呈增大的趋势，当蛋白酶添加量大于6 500 U/g时，游离氨基酸含量的上升趋于平缓；图2B表明，当风味蛋白酶添加量在750～3 500 U/g时，游离氨基酸含量随着蛋白酶添加量的增加而呈增大的趋势，当蛋白酶添加量大于3 500 U/g时，游离氨基酸含量的上升趋于平缓。这是由于底物逐渐消耗，酶解反应趋于饱和状态，导致游离氨基酸含量不再上升[3]。因此，考虑到经济效益等因素，选择碱性蛋白酶最适添加量为6 500 U/g，风味蛋白酶最适添加量为3 500 U/g。

图2

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图2   蛋白酶添加量对游离氨基酸含量的影响

Fig. 2   Effects of protease addition on free amino acid contents


2.2.2 初始pH对蒸煮液酶解效果的影响

酶对环境的酸碱性敏感，每种酶只能在一定限度的pH范围内具有活性；同时，pH也影响酶分子活性部位上有关基团和底物的解离状态，或使底物不能与酶结合，从而影响酶与底物的结合或催化[21]。图3A表明，在pH 7.5～8.5范围内，碱性蛋白酶水解的酶解液中游离氨基酸含量随着pH升高而增加；当pH＞8.5时，游离氨基酸含量随pH的升高呈逐渐下降趋势；当pH＞9.0时，游离氨基酸含量急剧下降。图3B表明，在pH 5.0～7.0范围内，游离氨基酸含量随着pH的升高逐步上升；当pH＞7.0时，游离氨基酸含量下降趋势明显。因此，经综合考虑，选择在碱性蛋白酶水解工艺中初始水解pH为8.5，风味蛋白酶水解工艺中初始水解pH为7.0。

图3

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图3   初始水解pH对游离氨基酸含量的影响

Fig. 3   Effects of primary hydrolysis pH on free amino acid contents


2.2.3 水解时间对蒸煮液酶解效果的影响

图4A表明，当碱性蛋白酶水解时间在2.5 h内时，酶解液中游离氨基酸含量随着酶解时间的延长而增加，当水解时间超过2.5 h后游离氨基酸含量逐渐下降；图4B表明，当风味蛋白酶水解时间在3.0 h内时，酶解液中游离氨基酸含量随着水解时间的延长而增加，当水解时间在3.0～4.0 h时，游离氨基酸含量缓慢下降，当水解时间超过4 h后，游离氨基酸含量急剧下降。水解时间的延长可能会导致酶失活，从而致使酶活力下降。因此，选择碱性蛋白酶水解时间为2.5 h，风味蛋白酶水解时间为3.0 h。

图4

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图4   水解时间对游离氨基酸含量的影响

Fig. 4   Effects of hydrolysis time on free amino acid contents


2.3 三疣梭子蟹蒸煮液水解条件响应面实验
2.3.1 回归模型的确定及方差分析

利用Design-Expert 8.0.6对响应面实验结果（表6～7）进行分析，对实验数据进行多元回归拟合，得到响应值对自变量编码值的二次多项回归方程：

表6   一次酶解响应面实验设计方案及结果

Table 6  Design program and experimental results of RSM in the primary enzymolysis test

实验号

Test number

A1碱性蛋白酶添加量

Alcalase addition

B1初始pH

Primary pH

C1水解时间

Hydrolysis time

Y1鲜味氨基酸含量

Flavor amino acid content/(mg/mL)

1－1－105.06
21－106.26
3－1104.46
41106.10
5－10－15.86
610－16.80
7－1015.16
81017.00
90－1－16.40
1001－15.26
110－115.80
120115.50
130007.30
140007.24
150007.04
160007.16
170007.24

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表7   二次酶解响应面实验设计方案及结果

Table 7  Design program and experimental results of RSM in the secondary enzymolysis test

实验号

Test number

A2风味蛋白酶添加量

Flavourzyme addition

B2初始pH

Primary pH

C2水解时间

Hydrolysis time

Y2鲜味氨基酸含量

Flavor amino acid content/(mg/mL)

1－1－108.52
21－109.64
3－1108.14
41108.56
5－10－18.28
610－19.28
7－1018.36
810110.56
90－1－18.46
1001－17.72
110－119.50
120118.62
1300010.42
1400010.66
1500010.86
1600010.80
1700010.78

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Y1=7.20+0.70A1－0.27B1－0.054C1+0.11A1B1+0.23A1C1+0.21B1C1－0.63A12－1.10B12－0.36C12.

Y2=10.7+0.59A2－0.39B2+0.41C2－0.17A2B2+0.30A2C2－0.035B2C2－0.72A22－1.27B22－0.86C22.

由表8～9可知，2个模型中响应值Y1和Y2的相关系数（r）分别为0.992 3和0.974 1（P＜0.000 1），说明这2个模型差异极显著；分析这2个模型的一次项、二次项、交互项的P值，发现一次项A1、B1和二次项A12、B12、C12对响应值Y1（一次酶解鲜味氨基酸含量）影响极显著（P＜0.01），A2、B2、C2和A22、B22、C22对响应值Y2（二次酶解鲜味氨基酸含量）影响极显著（P＜0.01）；交互项A1C1、B1C1分别对响应值Y1的影响极显著（P＜0.01）和显著（P＜0.05），A1B1对响应值Y1影响不显著（P＞0.05），A2B2、A2C2、B2C2对响应值Y2影响不显著（P＞0.05），三因素对Y1、Y2的影响顺序均为酶添加量（A）＞初始pH（B）＞水解时间（C）；变异系数（数值越小，模型的可信度越高）分别为1.93%和2.89%；回归模型的失拟项表示模型预测值与实际值的不拟合程度[22]，失拟项P值分别为0.255 4和0.097 6，均大于0.05，差异不显著，进一步说明模型拟合度好，适用于鲜味氨基酸含量的预测和分析。

表8   一次酶解优化实验方差分析

Table 8  Variance analysis of the primary enzymolysis optimization test

来源

Source

平方和

Sum of squares (SS)

自由度

Degree of freedom

均方

Mean square

F值

F value

P值

P value

r=0.992 3，CV=1.93%
模型Model13.0191.45100.15＜0.000 1
A13.9513.95273.57＜0.000 1
B10.6110.6141.920.000 3
C10.09210.0926.410.039 2
A1B10.04810.0483.350.109 7
A1C10.2010.2014.030.007 2
B1C10.1810.1812.220.010 0
A121.6711.67115.98＜0.000 1
B125.0515.05350.15＜0.000 1
C120.5510.5537.920.000 5
残差Residual0.1070.014
失拟项Lack of fit0.06130.0202.010.255 4
纯误差Pure error0.04040.010
总误差Total error13.1116

CV：变异系数，下同。

CV: Coefficient of variation, and the same as below.

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表9   二次酶解优化实验方差分析

Table 9  Variance analysis of the secondary enzymolysis optimization test

来源

Source

平方和

SS

自由度

Degree of freedom

均方

Mean square

F值

F value

P值

P value

r=0.974 1，CV=2.89%
模型Model19.2392.1429.24＜0.000 1
A22.8112.8138.430.000 4
B21.1911.1916.220.005 0
C21.3611.3618.620.003 5
A2B20.1210.121.680.236 5
A2C20.3610.364.930.061 9
B2C20.004 910.004 90.0670.803 1
A222.1912.1930.030.000 9
B226.7616.7692.48＜0.000 1
C223.1313.1342.810.000 3
残差Residual0.5170.073
失拟项Lack of fit0.3930.134.260.097 6
纯误差Pure error0.1240.030
总误差Total error19.7516

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2.3.2 响应曲面分析

各因素交互作用对鲜味氨基酸含量影响的曲面见图5～6。随着各因素值的增加，Y1和Y2呈现不同程度的上升趋势，当各因素达到一定值并继续增加时，Y1和Y2呈现下降趋势，说明鲜味氨基酸含量与蛋白酶添加量、初始pH、水解时间之间呈非线性关系[23]，只有当三者在相互作用的最佳条件下，鲜味氨基酸含量才能达到最大值。交互项蛋白酶添加量（A）和水解时间（C）对鲜味氨基酸含量的响应面图坡度最陡，等高线最密集，且椭圆形程度最大，说明蛋白酶添加量和水解时间对鲜味氨基酸含量影响最大。三因素相互作用对Y1的影响顺序为A1C1＞B1C1＞A1B1，对Y2的影响顺序为A2C2＞A2B2＞B2C2，这与二次回归模型方程的结果一致。

图5

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图5   一次酶解实验各因素交互作用对鲜味氨基酸含量影响的曲面图

Fig. 5   Response surface plots for the interaction of various factors on flavor amino acid contents in the primary enzymolysis test


图6

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图6   二次酶解实验各因素交互作用对鲜味氨基酸含量影响的曲面图

Fig. 6   Response surface plots for the interaction of various factors on flavor amino acid contents in the secondary enzymolysis test


2.4 验证实验

根据响应面实验对得到的回归方程Y1求解，预测得到三疣梭子蟹蒸煮液一次酶解最适条件为碱性蛋白酶加酶量6 825 U/g、初始pH 8.45、水解时间2.50 h，在此条件下进行5次重复验证实验，得到一次酶解后酶解液中鲜味氨基酸质量浓度为（7.18±0.09） mg/mL，与回归方程预测得到的鲜味氨基酸质量浓度7.40 mg/mL的相对误差为2.97%。根据响应面实验对得到的回归方程Y2求解，预测得到三疣梭子蟹蒸煮液二次酶解最适条件为风味蛋白酶加酶量3 750 U/g、初始pH 6.81、水解时间3.33 h，5次重复验证实验得到二次酶解后酶解液中鲜味氨基酸质量浓度为（10.49±0.12） mg/mL，与回归方程预测得到的鲜味氨基酸含量10.96 mg/mL的相对误差为4.29%。以上验证实验说明，通过响应面优化得到的两步酶解工艺条件可靠、有效，能较好地预测酶解液中鲜味氨基酸含量。

2.5 氨基酸组成分析

如表10所示：经两步酶解优化后酶解液中总游离氨基酸质量浓度为（35.99±0.51） mg/mL，必需氨基酸占总游离氨基酸含量的46.10%，高于联合国粮农组织及世界卫生组织（FAO/WHO）提出的标准蛋白必需氨基酸含量标准（35.00%），略低于鸡蛋蛋白标准（49.70%）[24]；二次酶解液中鲜味氨基酸质量浓度提高至（10.49±0.12） mg/mL，比蒸煮液增加了135.2%。说明采用两步酶解方法能有效释放蒸煮液中的鲜味氨基酸，从而提升酶解液滋味和营养价值。

表10   三疣梭子蟹蒸煮液与两步酶解优化酶解液中游离氨基酸含量 (mg/mL)

Table 10  Free amino acid contents in P. Trituberculatus cooking liquor and enzymolysis liquor with two-step optimization

游离氨基酸

Free amino acid

蒸煮液

Cooking liquor

二次酶解液

Secondary enzymolysis liquor

天冬氨酸Asp0.143±0.002b0.732±0.013a
苏氨酸Thr0.876±0.010b2.085±0.025a
丝氨酸Ser0.179±0.008b0.967±0.041a
谷氨酸Glu1.084±0.009b2.955±0.023a
脯氨酸Pro1.336±0.010b2.395±0.025a
甘氨酸Gly1.926±0.014b3.486±0.037a
丙氨酸Ala1.307±0.018b3.318±0.048a
缬氨酸Val1.125±0.015b2.839±0.029a
甲硫氨酸Met0.782±0.014b1.248±0.016a
异亮氨酸lle0.771±0.008b1.853±0.024a
亮氨酸Leu1.384±0.018b3.376±0.064a
酪氨酸Tyr1.110±0.012b1.939±0.011a
苯丙氨酸Phe1.165±0.017b2.850±0.028a
赖氨酸Lys1.279±0.013b2.342±0.018a
组氨酸His0.465±0.008b0.948±0.023a
精氨酸Arg1.891±0.015b2.658±0.031a
总游离氨基酸TFAA16.82±0.17b35.99±0.51a
鲜味氨基酸UAA4.46±0.08b10.49±0.12a
必需氨基酸EAA7.38±0.12b16.59±0.18a
鲜味氨基酸占比UAA/TFAA/%26.5229.15
必需氨基酸占比EAA/TFAA/%43.8846.10

同行数据后不同小写字母表示在P＜0.05水平差异有统计学意义。

TFAA: Total free amino acids; UAA: Umami amino acids; EAA: Essential amino acids. Values within the same row followed by different lowercase letters indicate significant differences at the 0.05 probability level.

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2.6 挥发性风味成分分析

采用HS-SPME-GC-MS定性定量检测上述优化工艺条件下制备的三疣梭子蟹蒸煮液二次酶解后产生的挥发性物质。根据得到的总离子流色谱图，利用NIST11数据库（https://webbook.nist.gov/chemistry/）进行检索，采用面积归一化法进行相对定量，从酶解液中共鉴定出挥发性成分62种，包括烷烃类25种、醇类5种、醛类3种、酮类5种、酸类9种、酯类6种和其他类化合物9种（各化合物及其相对含量见表11），分别占总挥发性物质的21.58%、4.11%、7.76%、2.88%、15.74%、4.76%、2.76%，其中烷烃类、酸类含量均达到15%以上。

表11   酶解液中的挥发性风味物质

Table 11  Volatile flavor compounds in enzymolysis liquor

种类

Type

序号

Number

保留时间

Retention time/min

风味物质

Flavor compound

名称Name

相对含量

Relative content/%

合计 Total15.74

酯类

Esters

4819.514蜡酸甲酯0.49
4928.430环丁酯1.02
5031.083脱氢戊酸内酯0.23
5134.319己二酸二辛酯2.13
5233.929丁二酸二（2-降冰片基）酯0.48
5350.440邻苯二甲酸丁酯0.41
合计 Total4.76

其他类

Other categories

5430.597对乙酰氨基酚0.22
5533.3621-甲基-萘0.90
5635.3251-乙基-萘0.20
5735.6991，5-二甲基-萘0.38
5836.3302，7-二甲基-萘0.22
5936.4962，3-二甲基-萘0.55
6040.6636-异丙基-1，4-二甲基萘0.21
6148.4561-甲基-2-苯基吲哚0.04
6247.193二丁胺0.04
合计 Total2.76

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本实验中检测出的醛类和酮类化合物都属于羰基化合物，其对肉香味的形成具有重要作用，酶解液中属于醛类物质的戊醛和苯甲醛具有坚果香[25-26]，具有脂肪香[27]的己醛占醛类物质的79.5%；酮类的检测阈值比醛类高，酮类具有甲壳类香气，酶解液中共检测出5种酮类化合物，其中含量最高的1，4-环己二酮被报道还具有一定抗癌作用[28]；醇类中的不饱和醇检测阈值相对饱和醇低，其具有一定青草香和蘑菇味，其中1-辛烯-3-醇和苯甲醇是醇类的主要呈味物质；烷烃类化合物广泛存在于鱼类等海鲜生物的挥发性成分中，但其检测阈值较高，对海鲜风味的影响不大[29]，支链烷烃的阈值较直链烷烃低，其具有清香和肉香味，酶解液中支链烷烃占烷烃类的26.6%；有机酸类可以在一定程度上增加酶解液的咸鲜味[30]；酯类化合物可对酶解液整体风味起到重要的柔和作用[31]。

3 讨论

近年来，三疣梭子蟹深加工产业发展迅速，蟹肉罐头等产品出口东南亚和欧美等地，同时也产生了大量加工副产物。许多学者已对梭子蟹壳和足等下脚料进行了初步研究，如范建凤等[32]采用酶法水解梭子蟹下脚料制备抗氧化肽，陶学明等[33]利用蟹壳加工成蟹壳微粉，卢进峰等[34]对蟹壳制取甲壳素和壳聚糖的工艺进行了研究，而对于梭子蟹蒸煮液的加工利用还鲜有相关报道。本研究以加工副产物高值化利用为切入点，参考酶法水解鱼虾贝等原料的技术，深入探讨两步酶解技术在梭子蟹蒸煮液酶解工艺中的应用。陶美洁等[11]、李芳浩等[20]、徐坤华等[35]、孟昌伟等[36]采用碱性蛋白酶和风味蛋白酶进行一步或两步酶解，经优化后碱性蛋白酶酶解pH 7.0～8.5，酶解时间2.0～3.0 h，风味蛋白酶酶解pH 6.4～7.5，酶解时间3.0～3.5 h，本研究结果与此相似。由于商品化酶制剂的酶活力和蒸煮液浓度不尽相同，故酶添加量无法与同类研究作比较。经两步酶解优化后，酶解液中鲜味氨基酸含量比梭子蟹蒸煮液提高了135.2%。

海鲜调味品的鲜味程度是品质评价的重要因素，目前许多研究将水解度作为评定酶解效果的唯一指标[19,37]，这在一味追求水解度的同时忽略了鲜美口感对海鲜调味品的影响。本研究中，经工艺优化后，酶解液鲜味氨基酸质量浓度提高到（10.49±0.12） mg/mL，占氨基酸总量的29.15%，说明Asp、Glu、Gly、Ala 4种氨基酸影响着酶解液的鲜味和甜味，对酶解液呈味起着主要作用。因此，将呈味氨基酸作为评价指标，通过响应面法优化各酶解参数有助于建立高品质调味品风味前体物质制备工艺。通过分析酶解液营养成分，得出其必需氨基酸占总氨基酸的46.10%，据研究显示梭子蟹必需氨基酸/总氨基酸的比值为36%[38]，由此可见酶解液营养丰富，其营养价值不低于直接食用梭子蟹。酶解液经过造粒、冷冻干燥、发酵、调配等工序后可被生产成不同类型的调味品，后续研究将以酶解液为调味品基料，通过物理或化学包埋和干燥工艺优化，开发高附加值的海产调味品，实现海洋生物资源的高效综合利用。

4 结论

本研究建立了三疣梭子蟹蒸煮液碱性蛋白酶和风味蛋白酶两步酶解工艺，在碱性蛋白酶添加量6 825 U/g、初始水解pH 8.45、水解时间2.50 h和风味蛋白酶添加量3 750 U/g、初始水解pH 6.81、水解时间3.33 h的酶解条件下，二次酶解液中鲜味氨基酸含量比梭子蟹蒸煮液提高了135.2%。经GC-MS检测发现62种风味物质，其中己醛、苯甲醛和不饱和醇为风味主要贡献物质。采用两步酶解工艺有效提高了水解产物风味，增加了酶解液鲜味强度，得到了具有梭子蟹风味的调味品前体物质，为研发蒸煮液调味产品及其工厂化生产提供了理论依据和技术支持。

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李芳浩,朱广琪,郭小旬,等.

风味蛋白酶酶解制备中国对虾调味料风味前体物质工艺优化

[J].食品工业科技,2018,39(24):164-169, 176. DOI:10.13386/j.issn1002-0306.2018.24.029

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LI F H, ZHU G Q, GUO X X, et al.

Optimization on the preparation of flavor precursor of Penaeus chinensis seasoning by flavour protease hydrolysis technology

[J]. Science and Technology of Food Industry, 2018, 39(24):164-169, 176. (in Chinese with English abstract)

DOI:10.13386/j.issn1002-0306.2018.24.029      [本文引用: 2]

朱秀清,李美莹,孙冰玉,等.

复合酶分步水解法制备汉麻多肽及其抗氧化特性研究

[J].食品工业科技,2021,42(2):161-169. DOI:10.13386/j.issn1002-0306.2020080101

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ZHU X Q, LI M Y, SUN B Y, et al.

Preparation of polypeptides from hemp by two-step enzymatic hydrolysis with complex enzymes and its antioxidant properties

[J]. Science and Technology of Food Industry, 2021, 42(2): 161-169. (in Chinese with English abstract)

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罗春艳,方旭波,孙海燕,等.

南太平洋鱿鱼船上蒸煮加工工艺优化与品质特性

[J].食品科学,2017,38(20):176-184. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201720025

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LUO C Y, FANG X B, SUN H Y, et al.

Optimization of onboard cooking and quality characteristics of Dosidicus gigas

[J]. Food Science, 2017, 38(20):176-184. (in Chinese with English abstract)

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戴志远,杨莹,王宏海,等.

响应面法优化新型鱿鱼肉肠的加工工艺

[J].中国食品学报,2011,11(3):111-117. DOI:10.16429/j.1009-7848.2011.03.023

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DAI Z Y, YANG Y, WANG H H, et al.

Optimization of processing technology for recombined product from fish flesh and squid by response surface method

[J]. Journal of Chinese Institute of Food Science and Technology, 2011, 11(3): 111-117. (in Chinese with English abstract)

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许丹,朱剑,严忠雍,等.

加工方式对金枪鱼鱼糜制品氨基酸组成和营养价值影响研究

[J].中国调味品,2020,45(11):74-80. DOI:10.3969/j.issn.1000-9973.2020.11.016

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XU D, ZHU J, YAN Z Y, et al.

Amino acid composition and nutritional value of tuna surimi products prepared by different processing methods

[J]. China Condiment, 2020, 45(11): 74-80. (in Chinese with English abstract)

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卜俊芝,戴志远,李燕,等.

细点圆趾蟹加工水煮液的营养成分及风味物质分析

[J].中国食品学报,2013,13(9):207-216. DOI:10.16429/j.1009-7848.2013.09.037

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BU J Z, DAI Z Y, LI Y, et al.

Analysis of nutritional and flavor compounds in crab boiled liquid

[J]. Journal of Chinese Institute of Food Science and Technology, 2013, 13(9): 207-216. (in Chinese with English abstract)

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于亚辉,方婷.

鲍鱼蒸煮液制备海鲜风味基料及其风味成分的分析

[J].中国调味品,2020,45(1): 40-45. DOI:10.3969/j.issn.1000-9973.2020.01.009

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YU Y H, FANG T.

Preparation of seafood flavor basic material from abalone cooking liquid and analysis of its flavor components

[J]. China Condiment, 2020, 45(1): 40-45. (in Chinese with English abstract)

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周慧敏,张顺亮,郝艳芳,等.

HS-SPME-GC-MS-O结合电子鼻对坨坨猪肉主体风味评价分析

[J].食品科学,2021,42(2):218-226. DOI:10.7506/spkx1002-6630-20191024-263

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ZHOU H M, ZHANG S L, HAO Y F, et al.

Analysis of major flavor components of tuotuo pork, a traditional meat product in Liangshan, Southwest China's Sichuan, by HS-SPME-GC-MS-O combined with electronic nose

[J]. Food Science, 2021, 42(2): 218-226. (in Chinese with English abstract)

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吴兴春,卢顺玉,周幸,等.

杨桃根中2-十二烷基-6-甲氧基-2,5-二烯-1,4-环己二酮抗肝癌作用及机制的研究

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WU X C, LU S Y, ZHOU X, et al.

Anti-hepatocarcinoma effect and its mechanism of 2-dodecyl-6-methoxy-2, 5-diene-1, 4-cyclohexane-dione in carambola roots

[J]. Chinese Journal of Hospital Pharmacy, 2020, 40(1): 42-47. (in Chinese with English abstract)

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HERLAND H, ESAIASSEN M, COOPER M, et al.

Changes in trimethylamine oxide and trimethylamine in muscle of wild and farmed cod (Gadus morhua) during iced storage

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FUJIMOTO A, ITO K, NARUSHIMA N, et al.

Identification of lactic acid bacteria and yeasts, and characterization of food components of sourdoughs used in Japanese bakeries

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LIU C J, YANG N, YANG Q, et al.

Enhancing robusta coffee aroma by modifying flavour precursors in the green coffee bean

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范建凤,王泽南,杨柯,等.

梭子蟹下脚料酶解制备抗氧化肽的工艺研究

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FAN J F, WANG Z N, YANG K, et al.

Preparation of antioxidant peptides from swimming crab waste through enzymatic hydrolysis

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陶学明,王泽南,余顺火,等.

梭子蟹壳酶解余料的微粉加工及其营养分析

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TAO X M, WANG Z N, YU S H, et al.

Process of micro-powder of swimming crab shell enzymatic-hydrolysis waste and analysis of nutritive

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卢进峰,王泽南,余顺火,等.

梭子蟹壳酶解余料制取甲壳素和壳聚糖的工艺研究

[J].食品科学,2008,29(11):206-209. DOI:10.3321/j.issn:1002-6630.2008.11.045

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LU J F, WANG Z N, YU S H, et al.

Study on extration technology of chitin from enzymolysis residue of Portunus trituberculatus shell and preparation technology of chitosan from chitin

[J]. Food Science, 2008, 29(11): 206-209. (in Chinese with English abstract)

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徐坤华,张燕平,戴志远,等.

碱性蛋白酶水解中华管鞭虾虾头的工艺优化

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XU K H, ZHANG Y P, DAI Z Y, et al.

Enzymatic hydrolysis of Solenocera crassicornis heads by alcalase

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孟昌伟,陆剑锋,宫子慧,等.

鮰鱼骨胶原多肽的制备工艺研究

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MENG C W, LU J F, GONG Z H, et al.

Study on preparation technique of collagen polypeptide from bone of bullhead catfishes

[J]. Meat Industry, 2011(9): 35-39. (in Chinese with English abstract)

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姚芳,祁兴普,刘萍.

淡水鱼下脚料酶解酿制风味调味汁

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YAO F, QI X P, LIU P.

Preparation of flavorful sauce from freshwater fish by-products by enzymatic hydrolysis and then fermentation

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郭亚男.

不同产地三疣梭子蟹肌肉营养成分和风味物质差异研究

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Study on the differences in nutritional and flavor compounds of in muscles of Portunus trituberculatus from diverse producing area

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