浙江大学学报(工学版)

浙江大学学报(工学版), 2020, 54(7): 1411-1417 doi: 10.3785/j.issn.1008-973X.2020.07.020

交通工程、水利工程、土木工程

超声波提高微生物固化砂土效果的试验研究

刘志明,, 彭劼,, 李杰, 宋恩润

Experimental study on improving effect of microorganism solidifying sand by ultrasonic

LIU Zhi-ming,, PENG Jie,, LI Jie, SONG En-run

通讯作者: 彭劼，男，教授，博导. orcid.org/0000-0003-4747-568X. E-mail： peng-jie@hhu.edu.cn

收稿日期: 2019-06-5  

Received: 2019-06-5  

作者简介 About authors

刘志明（1994—），男，硕士生，从事微生物岩土工程的研究.orcid.org/0000-0002-7223-5744.E-mail：lzm@hhu.edu.cn , E-mail：lzm@hhu.edu.cn

摘要

为了研究超声波对巴氏生孢八叠球菌及其诱导碳酸钙沉积能力的影响，利用超声（20 kHz）开展超声辐照时间（0~30 min）和超声功率强度（0~0.8 W/cm3）的正交试验，用超声处理后的菌液进行水溶液试验和砂柱加固试验. 测定菌液脲酶活性、OD600、细菌颗粒分布参数、碳酸钙的产量和加固后砂柱无侧限抗压强度. 分析超声辐照时间、超声功率强度、超声能量强度对碳酸钙产量的影响. 结果表明，超声辐照能够引发细菌产生生理强化反应，提高菌液脲酶活性. 当超声能量强度约为8 W·min/cm3时，超声辐照能够有效地提高菌液诱导生成碳酸钙的能力. 经优化的辐照策略（超声功率强度为0.4 W/cm3，处理时间为20 min）进行超声辐照处理后，水溶液中和砂柱中的碳酸钙产量分别提高了28.5%和35.6%，加固后砂样无侧限抗压强度为1.25 MPa，较对照组提高了91.6%.

关键词： 微生物诱导碳酸钙沉积（MICP） ; 超声波 ; 脲酶活性 ; 碳酸钙产量 ; 辐照时间 ; 超声能量强度

Abstract

Orthogonal experiments of ultrasonic irradiation time (0-30 min) and ultrasonic power intensity (0-0.8 W/cm3) were conducted using ultrasound (20 kHz) in order to analyze ultrasonic effect on Sporosarcina pasteurii and its ability to induce calcium carbonate. Aqueous solution tests and sand column tests based on microbially induced carbonate precipitation were conducted using ultrasound-treated bacteria solution. Urease activity, OD600, distribution parameters of bacterial cells, amount of microbially induced CaCO3 and unconfined compressive strength of treated sand columns were measured. Effects of ultrasonic irradiation time, ultrasonic power intensity and ultrasonic energy intensity on CaCO3 amount were analyzed. Results show that ultrasonic irradiation can trigger physiological enhancement reaction of bacteria and improve the urease activity of bacterial liquid. Ultrasonic irradiation can effectively improve the ability of bacteria to induce CaCO3 with ultrasonic energy intensity of about 8 W·min/cm3. After bacterial solution was irradiated by ultrasound with the optimal irradiation strategy (ultrasonic power intensity of 0.4 W/cm3, treatment time of 20 minutes), CaCO3 amount in aqueous solution tests and sand column tests can be increased by 28.5% and 35.6% respectively. Unconfined compressive strength of MICP-treated sand sample was 1.25 MPa, which was increased by 91.6% than control samples.

Keywords： microbially induced carbonate precipitation (MICP) ; ultrasound ; urease activity ; precipitation amount of CaCO3 ; irradiation time ; ultrasonic energy intensity

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本文引用格式

刘志明, 彭劼, 李杰, 宋恩润. 超声波提高微生物固化砂土效果的试验研究. 浙江大学学报(工学版)[J], 2020, 54(7): 1411-1417 doi:10.3785/j.issn.1008-973X.2020.07.020

LIU Zhi-ming, PENG Jie, LI Jie, SONG En-run. Experimental study on improving effect of microorganism solidifying sand by ultrasonic. Journal of Zhejiang University(Engineering Science)[J], 2020, 54(7): 1411-1417 doi:10.3785/j.issn.1008-973X.2020.07.020

微生物诱导碳酸钙沉积（MICP）是一种在自然界普遍存在的生物过程[1]，现已发展成微生物岩土领域一个重要的技术手段[2-3]. MICP技术的基本原理是利用产脲酶菌的新陈代谢作用，分解尿素，析出并沉积碳酸钙，达到填充和胶结颗粒材料的效果，现已在土体加固[4]、防风固砂[5]、混凝土裂缝修复[6]等诸多领域受到关注. 将MICP技术运用到实际工程中面临着诸多挑战，其中造价高是MICP技术所有潜在应用都必须面对的问题[7]. 根据处理程度的不同，MICP加固土体的造价为100~400 $/m3[7-8]. 为了更好地投入实际应用，MICP技术需要进一步的改进.

目前，关于改进MICP以降低造价的研究主要集中在2个方面：降低胶结液的造价和降低菌液的造价. 前者主要是寻找钙源和碳源[9-10]的廉价替代物，后者主要是降低菌液的培养成本，如采用敞开式富集培养[11]. 许多超声学领域的研究表明，超声波诱导产生的稳定空化效应能够增加细胞膜的通透性[12]，可以加速细胞内外的物质运输，加速细菌的生长，提高微生物的活性[13]. 由于成本低、操作简单[13-14]，超声辐照已被用于化工、环境等领域，如提高啤酒酵母细菌的生长和新陈代谢速率[15]，提高乳酸菌β葡糖苷酶活性和大豆异黄酮的生物活性[16]，促进污泥中活性细菌的生长[17]. 超声对很多微生物和酶有提高活性和代谢产物产量的作用，但目前尚没有将超声波应用到MICP中以提高碳酸钙产量. 对于不同的微生物，最佳的处理参数差别可能很大[18]. 更重要的是，其他利用微生物代谢过程进行生产的技术一般只关注酶活性和产物量[13, 16]，MICP技术主要关心处理效果（加固后土体强度）[19-20].

为了研究超声辐照对提高微生物诱导碳酸钙产量提高的可行性及获得最优超声辐照参数，本文利用超声对巴氏生孢八叠球菌进行辐照处理，开展超声功率强度和超声辐照时间2个参数的正交试验. 进行菌液超声处理试验，研究超声处理前、后的细菌活性、OD600和细菌颗粒分布的变化. 使用经超声处理前、后的菌液分别进行MICP水溶液试验，测定水溶液试验的最终碳酸钙产量. 开展砂柱加固试验，测定砂柱中的碳酸钙产量及砂柱无侧限抗压强度. 本文分析超声功率强度、超声辐照时间和超声能量强度对菌液活性、浓度、诱导生成碳酸钙的产量及砂柱加固效果的影响，确定最佳的超声处理参数，为降低MICP造价提供了一种简单有效的方法，对MICP未来的研究和应用具有重要意义.

1. 材料和方法

1.1. 细菌和砂样

试验用菌为巴氏生孢八叠球菌（Sporosarcina pasteurii，DSM 33），购自中国科学院微生物研究所. 在每升细菌培养液中，含20 g酵母浸粉、10 g NH4Cl，并用1 mol/L的NaOH溶液调节pH至8.5. 将菌种按1%体积比例接种到培养液中，置于30 °C恒温震荡培养箱中培养12 h后收获. 菌液收获后采用电导率法[21]测定脲酶活性，使用可见光分光光度计测定菌液的OD600，并以此表征细菌的浓度[19].

采用中国ISO标准砂进行砂柱加固试验，标准砂的主要成分为石英，颗粒级配如图1所示，粒径参数为d50=0.7 mm，d90=2 mm. 图中，d为粒径，wB为小于某粒径的颗粒质量分数. 砂样尺寸如下：直径为5 cm，高度为8 cm，孔隙比为0.6.

图 1

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图 1   标准砂级配曲线

Fig.1   Particle size distribution of standard sand


1.2. 菌液超声辐照处理

利用频率为20 kHz的超声波，对巴氏生孢八叠球菌进行辐照处理. 处理方法如下：使用上超牌FS-150N型超声发声仪对80 mL菌液进行超声辐照，超声处理模式为间隔模式（间隔为5 s）. 各组试验的超声功率强度PI及辐照时间t如表1所示. 测定菌液超声前、后的脲酶活性、OD600和经灭菌滤嘴过滤后溶液的脲酶活性.

表 1   超声辐照处理试验设计

Tab.1  Design of ultrasonic irradiation treatment tests

PI/
（W·cm−3） 		t/min
0 10 20 30
0 O − − −
0.2 − A1 A2 A3
0.4 − B1 B2 B3
0.6 − C1 C2 C3
0.8 − D1 D2 D3

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1.3. 处理前后菌液的水溶液碳酸钙产量试验

为了测试超声辐照对巴氏生孢八叠球菌诱导生成碳酸钙沉淀能力的影响，开展MICP水溶试验，胶结液为氯化钙和尿素混合溶液（浓度均0.5 mol/L），胶结液和菌液的体积比为500∶10，且置于磁力搅拌器上进行搅拌反应，试验温度为（25±1）°C. MICP水溶液的试验编号如表1所示，每组试样设置2个平行样.

1.4. MICP处理砂柱试验

基于水溶液试验结果，选取O、A2、B1、B2、D1和C3 6组超声参数（具体见表1），对另一批菌液进行超声辐照处理，测定处理前、后的菌液脲酶活性后，将菌液用于砂柱加固试验. 在砂柱处理试验中，每组砂样设置2个平行样，试验温度为（25±1）°C. 将40 mL菌液和40 mL固定液（浓度为0.05 mol/L的氯化钙溶液）混合后立即注入砂样中，利用蠕动泵控制注入速率为6 mL/min. 每隔12 h注入60 mL（一孔隙体积）胶结液，共处理12次，注浆结束后将砂柱取出烘干，开展无侧限抗压强度试验及碳酸钙产量测试.

1.5. 超声处理后细菌活性及浓度测定

在超声处理之后，采用1.1节的方法测定菌液的脲酶活性及OD600. 当超声的功率强度和超声辐照时间达到一定程度时，超声辐照会对菌体造成损伤[22]. 为了研究超声处理对细菌脲酶活性的影响，测定菌液滤掉细菌后的脲酶活性. 用灭菌滤嘴过滤菌液，测定滤后溶液（OD600接近0）的脲酶活性.

1.6. 细菌体颗粒分布和碳酸钙产量测定

为了研究超声对巴氏芽孢杆菌细胞的损伤程度，采用BT-9300H型激光粒度分布仪对对照组、B2组和D1组菌液进行测试，得到细菌体粒径参数.

在水溶液试验结束后，采用ISO 6058-1984《水质钙含量的测定EDTA滴定法》测定混合液中的钙离子浓度，计算得到水溶液碳酸钙产量[3]. 砂柱试样中的碳酸钙产量采用酸洗法进行测定[23]，从砂柱取样烘干后称重，用足量浓度为1.0 mol/L的盐酸冲洗，再用去离子水冲洗后烘干称重，前、后的质量差除以加固前的质量即为砂样中的碳酸钙产量.

2. 结果与讨论

2.1. 超声对细菌细胞的影响

超声波通过机械机制和空化机制，对细菌和酶产生复杂的生物效应[24]. 为了研究超声辐照对细菌细胞体的影响，对比分析超声处理前、后细菌的颗粒分布参数和细菌浓度的变化. 如图2所示为对照组（处理前）、B2和D1 3组菌液的颗粒粒径参数，包括D10、D25、D75和D98. 在超声处理后，各颗粒粒径参数都有不同程度的减小，其中B2和D1组菌液的D98相较于对照组分别减小了9.9%和10.8%，说明超声损伤了细菌的表面结构，使得菌体破损和解体[25]，导致细菌体尺寸减小.

图 2

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图 2   菌液颗粒分布参数

Fig.2   Particle distribution parameters of bacterial solution


超声波的机械效应会使得细菌产生局部损伤，当超声强度低、辐照时间短时，局部损伤容易被修复，细菌产生应激生理强化效应，酶的分泌增多，新陈代谢增强[14]. 超声处理前、后的菌液OD600如图3所示. 结果表明，菌液的细胞浓度随超声辐照时间和超声功率强度的增加而呈下降趋势. 这可能是因为部分细菌在超声作用下破损，胞内脲酶释放到溶液中[12, 16]，造成OD600下降.

图 3

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图 3   菌液OD600与超声功率强度的关系

Fig.3   Relationship between OD600 of bacterial solution and ultrasonic power intensity


2.2. 超声处理后菌液的脲酶活性

超声处理前菌液颗粒分布参数和OD600的变化，反映了超声对巴氏生孢八叠球菌细胞的损伤程度. 除了对细菌细胞的损伤，超声会影响菌液的脲酶活性. 在超声处理后细菌细胞部分受损，菌液提供的尿素水解能力来源于2部分：1）细菌体内脲酶水解尿素和ATP生成的耦合过程[21]；2）由于菌体破损导致脲酶流出菌体，直接在溶液环境中分解尿素的过程[16]. 菌液经超声辐照处理前脲酶活性为6.1 mmol/（L·min），OD600为0.933. 如图4所示为不同超声功率强度条件下（A、B、C和D分别对应超声功率强度为0.2、0.4、0.6和0.8 W/cm3），菌液总活性 U、游离脲酶活性Uf和菌液中细菌体脲酶活性（前两者之差）Ub以及细菌体脲酶活性占总活性的比例Ur与超声辐照时间t的关系.

图 4

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图 4   脲酶活性参数与辐照时间的关系

Fig.4   Relationship between urease activity parameters and irradiation time


如图4（a）、（b）所示，菌液总脲酶活性和游离脲酶活性均随着超声辐照时间和超声功率强度的增加而增加. 尤其是D3组中游离脲酶活性为5.0 mmol/（L·min），达到处理后菌液脲酶活性的60%，说明在D3组的超声条件下较多细菌菌体受到损伤. 结合图3、4（c）可知，在细胞浓度降低后，各实验组菌液细菌体保持较高的脲酶活性. 这一现象的出现可能有2个原因：1）在本文超声处理参数范围内，超声的机械效应没有破坏细菌的正常代谢，细菌因局部受损排出部分脲酶后，能够继续在细菌体内产生新的脲酶[16]；2）由于空化作用，提高了细胞膜的通透性和单体细菌细胞的脲酶活性[14]. 由图4（a）、（d）可知，随着超声强度和辐照时间的增加，超声辐照不仅能够提高菌液的总脲酶活性，而且改变了总脲酶活性的组成比例. 结合超声处理后菌液的OD600和脲酶活性的变化，可知：超声辐照使得菌体内部脲酶外排，但不影响细菌体正常的新陈代谢，菌体内脲酶增生，提高了菌液总脲酶活性.

2.3. 优化超声辐照策略

如图5所示为经超声处理前、后的菌液在MICP水溶液试验中诱导生成碳酸钙的产量. 图中，Cw为水溶液中碳酸钙产量平均值. 可以看出，碳酸钙产量在B2、B3和D1处分别较对照组提高了28.5%、34.23%和43.6%，说明在适宜的超声处理条件下，超声处理菌液可以有效地提高诱导生成碳酸钙的能力.

图 5

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图 5   水溶液试验碳酸钙产量

Fig.5   CaCO3 production in aqueous solution tests


从图5可以看出，对于超声功率强度为0.8 W/cm3的D组来说，超声辐照时间较短有利于提高碳酸钙产量；对于功率强度较低的B组（0.4 W/cm3）来说，较长的超声辐照时间更利于碳酸钙产量的提高. 类似地，最优的超声功率强度随着超声辐照时间的变化而变化，即超声处理的效果受超声辐照时间和超声功率强度的交叉影响.

超声功率强度和超声辐照时间的乘积为超声能量强度，如表2所示为各试验组超声能量强度EI. 如图6所示为菌液活性和OD600与超声能量强度的关系. 由于存在2组试验的超声能量强度相同的情况（见表2），对应点处的脲酶活性和OD600为这两组试验数据的平均值. 超声处理后，菌液的脲酶活性和OD600随超声能量强度的增加分别呈上升和下降趋势.

表 2   各组试验的超声能量强度

Tab.2  Ultrasonic energy intensity of each test

EI/（W·min·cm−3） 试验组别 EI/（W·min·cm−3） 试验组别
2 A1 12 B3，C2
4 A2，B1 16 D2
6 A3，C1 18 C3
8 B2，D1 24 D3

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图 6

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图 6   脲酶活性及OD600随超声能量强度的变化

Fig.6   Urease activity and OD600 varied with ultrasonic energy intensity


菌液脲酶活性体现了当下菌液提供的分解尿素的能力，菌液浓度决定微生物提供的碳酸钙成核位点的数量. 当碳酸钙以细菌体为成核位点时，随着碳酸钙不断地包裹细菌，细菌与外界的物质交换逐渐受限，细菌能够表达出来的脲酶活性逐渐减少. 当细菌浓度较低时，微生物诱导生成碳酸钙的产量将更容易因细菌被包裹而受限[26]，因此细菌诱导生成碳酸钙的产量取决于菌液活性和细菌浓度2个参数.

如图7所示为碳酸钙产量平均值随超声能量强度变化的情况. 碳酸钙产量随超声能量强度的增加先增加后减小，在超声能量强度为8 W·min/cm3时出现碳酸钙产量的峰值. Keris-Sen等[12]利用超声波分解微生物并萃取其代谢产物，研究超声对微生物细胞分解及细胞所析出蛋白质和碳水化合物浓度的影响，确定最佳超声能量强度为24 W·min/cm3. 本文的最优超声能量强度明显更低，这是因为目的不是分解细胞，而是利用生理强化效应提高巴氏生孢八叠球菌的活性和诱导生成碳酸钙的能力. 在超声能量强度约为8 W·min/cm3的条件下菌液的活性提高明显，且菌液浓度未明显降低，MICP过程不会因为细菌大量被碳酸钙包裹而受限，最终表现为碳酸钙产量提高较多.

图 7

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图 7   碳酸钙产量与超声能量强度的关系

Fig.7   Relationship between CaCO3 content and ultrasonic energy intensity


2.4. 砂柱试验结果分析

其他利用微生物进行生产的技术一般关注酶活性和产物量[13, 16]，MICP技术更关心处理效果（加固后土体强度）. 为了验证在超声能量强度为8 W·min/cm3的条件下，超声辐照提高细菌在砂柱环境中诱导碳酸钙产量的有效性，分析超声能量强度相同、但处理时间及功率强度不同的超声处理策略的区别. 选取6组超声处理参数，对菌液进行超声辐照处理，并将处理后的菌液用于砂柱加固试验. 如图8所示为砂柱加固试验所选取的6组超声参数对应的超声能量强度和水溶液试验中测得的菌液经超声辐照处理后细菌活性占总脲酶活性的比例.

图 8

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图 8   砂柱加固试验中所选取各组超声参数

Fig.8   Ultrasonic power intensity and proportion of bacterial activity of bacteaial liquid used in sand column treatment tests


砂柱加固试验中所用菌液初始脲酶活性为6.16 mmol/(L·min)，OD600=1.0. 如图9所示为试验编号为O、A2、B1、B2、D1和C3对应的水溶液试验中菌液经超声处理后的OD600，砂柱加固试验中菌液经处理后活性，砂柱中碳酸钙产量平均值Cs和无侧限抗压强度平均值pUCS. 菌液活性随超声能量强度的增加呈上升趋势. 砂柱中碳酸钙产量及砂柱无侧限抗压强度随超声能量强度先增加后降低，并在B2组达到最优. 和对照组相比，B2组砂样中的碳酸钙产量提高了35.6%，无侧限抗压强度提高了91.6%.

图 9

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图 9   砂柱加固试验结果

Fig.9   Results of sand column tests


从图8、9（a）可知，D1与B2的超声能量强度相同，但处理时间及功率强度不同，D1组和B2组菌液处理后OD600和脲酶活性都较接近，但其中细菌体所提供的活性差异明显，分别占总活性的71.8%和87.1%. 在砂柱环境中游离脲酶活性衰减明显[26]，细菌吸附在砂颗粒表面能够提供更稳定的脲酶活性，导致在砂柱环境中D1组碳酸钙产量和砂样无侧限抗压强度比B2低. 一般来说，砂柱中碳酸钙产量越高，无侧限抗压强度越高. 与对照组相比，C3组砂样中的碳酸钙产量提高了20%，砂样无侧限抗压强度没有提高. 这可能是因为细菌体除了提供脲酶之外，细菌体还提供了碳酸钙的成核点[26]，细菌诱导生成的碳酸钙对砂样强度的提高贡献更大. C3组细菌浓度较低，所以C3组在砂样中生成的碳酸钙对强度的贡献可能略低. 细菌体脲酶活性占比越大，单位总脲酶活性对砂柱加固更有效. 为了取得较好的MICP处理效果，在处理砂土时建议采取超声功率强度和辐照时间都适中的超声处理策略，如B2组.

3. 结　论

（1）经超声辐照后，细菌体数量和体积均减小，超声导致了细菌细胞膜通透性提高及细胞的生理强化效应，使得菌体内部脲酶外排，但不影响细菌体正常的新陈代谢，菌体内脲酶增生，提高了菌液总脲酶活性.

（2）超声功率强度和超声辐照时间对超声处理效果存在交叉影响，当超声能量强度约为8 W·min/cm3时菌液诱导生成碳酸钙的产量较高. 对于使用处理后菌液用于加固砂样，推荐超声处理策略如下：超声功率强度为0.4 W/cm3，辐照时间为20 min.

（3）经推荐的超声策略条件下超声辐照处理后，巴氏生孢八叠球菌在水溶液环境和砂柱加固中诱导生成的碳酸钙产量分别提高了28.5%和35.6%，砂柱无侧限抗压强度达到1.25 MPa，较对照组提高了91.6%，超声处理菌液后可以提高菌液诱导产生碳酸钙进行加固砂土的处理效果.

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