浙江大学学报(工学版)

浙江大学学报(工学版), 2019, 53(3): 598-604 doi: 10.3785/j.issn.1008-973X.2019.03.022

化学工程、能源工程

聚酰基硫脲基因输送体系的构建与评价

王玥,, 周珠贤, 申有青,

Construction and evaluation of gene delivery system based on polyacylthiourea

WANG Yue,, ZHOU Zhu-xian, SHEN You-qing,

通讯作者: 申有青，男，教授. orcid.org/0000-0003-1837-7976. E-mail： shenyq@zju.edu.cn

收稿日期: 2018-07-24  

Received: 2018-07-24  

作者简介 About authors

王玥(1989—)，女，博士生，从事基因药物输送载体设计研究.orcid.org/0000-0002-0275-2113.E-mail：wangyue_sunshine@163.com , E-mail：wangyue_sunshine@163.com

摘要

基于新型树枝状大分子聚酰基硫脲(PATU)，通过巯基-烯Michael加成反应得到表面N, N-二甲基半胱胺修饰的聚酰基硫脲(PATU-DMCA). 核磁结果表明：PATU-DMCA树枝状结构正确且完整. 琼脂糖凝胶电泳及动态光散射粒径测定结果表明：PATU-DMCA在低代数、低氮磷摩尔比条件下可以有效包载DNA，形成粒径为60~100 nm、Zeta电位为10~20 mV的纳米复合物. 在人宫颈癌细胞HeLa和人肺癌细胞A549上，低氮磷摩尔比的PATU-DMCA的无血清转染效率优于经典的树枝状大分子基因载体聚酰胺胺，而两者细胞毒性相当. HeLa上的亚细胞分布结果表明：纳米复合物在细胞水平的转运过程基本包括黏附细胞膜、内吞入胞、进入溶酶体，通过“质子海绵”效应从溶酶体逃逸后进入细胞质及细胞核进行转染. PATU-DMCA以及PATU本身在基因输送中均具有很大的潜力.

关键词： 聚酰基硫脲 ; 基因输送 ; 高效合成 ; 转染效率

Abstract

N, N-dimethylcysteamine modified PATU (PATU-DMCA) was synthesized through thiol-ene Michael addition reaction based on a novel dendrimer of polyacylthiourea (PATU). NMR results show that the dendrimer structure of PATU-DMCA is correct and integrated. Agarose gel electrophoresis assay and dynamic light scattering results demonstrate that PATU-DMCA of low generations with low molar ratios of N and P can package DNA to form nanoparticles with size of 60~100 nm and Zeta potential of 10~20 mV. In human cervical carcinoma cell HeLa and human lung cancer cell A549, the formed polyplexes with low molar ratios of N and P show higher transfection efficiency in serum-free medium than the classical dendrimer poly (amidoamine), while the cytotoxicity is equal to each other. The subcellular distribution study in HeLa indicate that the intracellular trafficking of the polyplexes include cell membrane adhesion, endocytosis into cell, entering into lysosome, and lysosomal escape via ‘proton sponge effect’ for transfection in cytoplasm and nucleus. Both PATU-DMCA and PATU itself have enormous potential for gene delivery.

Keywords： polyacylthiourea ; gene delivery ; facile synthesis ; transfection efficiency

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本文引用格式

王玥, 周珠贤, 申有青. 聚酰基硫脲基因输送体系的构建与评价. 浙江大学学报(工学版)[J], 2019, 53(3): 598-604 doi:10.3785/j.issn.1008-973X.2019.03.022

WANG Yue, ZHOU Zhu-xian, SHEN You-qing. Construction and evaluation of gene delivery system based on polyacylthiourea. Journal of Zhejiang University(Engineering Science)[J], 2019, 53(3): 598-604 doi:10.3785/j.issn.1008-973X.2019.03.022

基因治疗作为一种有效低副作用的治疗手段而受到广泛关注[1-3]，其临床应用的关键在于构建安全高效的基因输送体系[4]. 用于基因输送的载体包括病毒载体和非病毒载体，而非病毒载体主要有脂质体和阳离子聚合物[5-6]. 树枝状大分子具有明确的化学结构及大量可用于表面修饰的末端基团，是一种很有前途的阳离子聚合物型基因载体[7-9]. 其中，聚酰胺胺(PAMAM)、聚丙烯亚胺(PPI)、三嗪类等树枝状大分子已被广泛应用于体内外基因输送[10-11].

树枝状大分子的合成是重复单元迭代反应的过程，通常复杂耗时，制备难度随着代数增加而增大[12-14]. 作为基因载体，树枝状大分子的转染效率和毒性大小主要取决于代数、功能性表面及内核结构等因素. 研究表明，树枝状大分子的转染效率随代数呈先增大后减小的趋势，而毒性随代数增加持续增大[15]. 树枝状大分子表面经过脂质体、氨基酸、氟化物、糖类、蛋白质、多肽修饰后可以有效提高转染效率，并降低毒性[16-17]. 然而，树枝状大分子及其优化后的基因输送载体仍然存在转染效率低、毒性大的问题[16]. 因此，有待构建和探索新型树枝状大分子基因载体.

点击化学反应是一类高效快速、高度立体选择性、易纯化分离的反应，为树枝状大分子的高效合成提供了有利条件[18-19]. 基于点击化学策略，本实验室自主设计、高效合成一种以三(2-氨基乙基)胺为核，表面具有大量不饱和双键的聚酰基硫脲树枝状大分子[12]. 本研究通过巯基-烯Michael加成反应得到不同代数的表面N, N-二甲基半胱胺修饰的聚酰基硫脲，用于基因输送；其包载负电性DNA后可以形成粒径良好的纳米复合物. 在此基础上，进一步考察第3代~第5代(Generation3~Generation5, G3~G5)纳米复合物在人宫颈癌细胞HeLa、人肺癌细胞A549中的转染效率，载体本身的细胞毒性以及最优条件下的纳米复合物在HeLa上的亚细胞分布情况.

1. 实验部分

1.1. 试剂

甲基丙烯酰氯、2, 2-二羟甲基丙酸、二氯亚砜、硫氰酸钾、三(2-氨基乙基)胺、半胱胺、三丁基膦(tributyl phosphine, TBP)、N, N-二甲基半胱胺盐酸盐(N, N-dimethylcysteamine hydrochloride, DMCA·HCl)、支化聚乙烯亚胺(polyethyleneimine, PEI, Mw=25 000)购自阿拉丁试剂有限公司，等级为分析纯；二甲亚砜(dimethylsulfoxide, DMSO)、甲醇等溶剂由国药集团化学试剂有限公司提供，等级为分析纯；聚酰胺胺(polyamidoamine, PAMAM)购自威海晨源分子新材料有限公司；人宫颈癌细胞HeLa，人肺癌细胞A549(ATCC, Manassas, USA)；RPMI 1640培养基和胎牛血清(Gibco, USA)；荧光素酶报告质粒pGL4.13(Promega, USA).

1.2. N, N-二甲基半胱胺修饰的聚酰基硫脲(PATU-DMCA)的合成

聚酰基硫脲(PATU)的合成过程参考文献[12]，在此基础上通过巯基-烯Michael加成反应得到表面三级胺修饰的聚酰基硫脲. 以第4代N, N二甲基半胱胺修饰的聚酰基硫脲(G4 PATU-DMCA)为例，具体地，将0.1 g G4 PATU溶于2 mL DMSO中，加入0.078 g DMCA·HCl以及2~3滴TBP，在30 °C条件下反应24 h. 过量的DMCA·HCl和TBP通过甲醇透析3次除去，最后将甲醇旋干即得到油状产物.

1.3. PATU-DMCA/DNA纳米复合物的制备

按照不同的PATU-DMCA中氮元素与DNA中磷元素的物质的量之比n(N)/n(P)将不同质量各个代数的PATU-DMCA溶于4-羟乙基哌嗪乙磺酸(4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid, HEPES)缓冲溶液，得到一定浓度梯度的聚合物溶液，用HEPES缓冲溶液将提取的荧光素酶报告质粒母液稀释成40 μg/mL，将聚合物溶液与质粒溶液等体积混合，涡旋振荡10 s，室温静置30 min，即得各个代数的一系列不同氮磷摩尔比的纳米复合物溶液.

1.4. 纳米复合物的粒径分布和Zeta电位测定

在25 °C条件下，利用动态光散射仪(dynamic light scattering, DLS)测定纳米复合物粒径分布和Zeta电位，实验数据经软件计算获得. 每个样品测量3次，取平均值.

1.5. 纳米复合物的凝胶阻滞电泳实验

制备质量浓度为0.008 g/mL的琼脂糖溶液，加入溴化乙锭，使其质量浓度为0.5 mg/mL，室温冷却至凝胶状，取20 μL各个代数不同氮磷摩尔比的纳米复合物溶液或者纯质粒DNA溶液上样，在100 mV电压条件下，于缓冲液中电泳30 min. 电泳结束后，将其置于紫外凝胶成像系统进行拍摄.

1.6. 透射电子显微镜观察纳米复合物形态

取制备好的n(N)/n(P)=10的G3、G4纳米复合物少许于400目铜网上，用磷钨酸负染，滤纸吸除多余液体，室温条件下自然干燥. 用透射电子显微镜(transmission electron microscope, TEM) (日立H-7000)观察样品形态.

1.7. 纳米复合物的体外细胞转染

以荧光素酶报告质粒的转染效率为标准对G3~G5的PATU-DMCA、PAMAM以及PEI的体外转染情况进行评价. 将HeLa、A549以3×104个/孔细胞密度种于48孔板中，在CO2 体积分数为5%、湿度为95%的37 °C恒温培养箱中培养24 h. 之后将培养基替换为0.4 mL新鲜无血清培养基，加入一系列不同氮磷摩尔比的纳米复合物溶液50 μL(含luciferase pGL4.13质粒DNA 1 μg)，培养4 h. 将转染液替换为含10%血清的新鲜培养基继续培养44 h. 然后弃去培养基，每孔加入100 μL细胞裂解液，充分裂解后取20 μL，加入5 μL荧光素酶底物，用化学发光检测仪测定化学发光强度. 蛋白浓度用Bradford蛋白检测试剂盒测定. 以单位质量蛋白的发光强度表征转染效率，每个样品进行3组独立平行实验，取平均值.

1.8. 细胞毒性实验

采用3-(4, 5-二甲基噻唑-2)-2, 5-二苯基四氮唑溴(3-(4, 5-dimethyl-2-thiazolyl)-2, 5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide, MTT)法检测各个代数PATU-DMCA、PAMAM以及PEI在HeLa、A549上的细胞毒性. 将HeLa或者A549按4×103个/孔的细胞密度种于96孔板中，在CO2体积分数为5%、湿度为95%的37 °C恒温培养箱中培养24 h. 将隔夜培养基替换为不同质量浓度聚合物溶液，继续培养48 h. 每孔加入20 μL的MTT溶液(5 mg/mL)，培养4 h，在3×103 r/min条件下离心5 min，弃尽上清，加入100 μL的DMSO溶液，震荡使结晶全部溶解. 用酶标仪测定样品在562 nm和620 nm处的吸光度. 细胞存活率为实验组的吸光度值与无处理组吸光度值的比值. 每个样品进行3组独立平行实验，取平均值.

1.9. 采用激光共聚焦显微镜(CLSM)观察纳米复合物亚细胞分布

用Label IT Tracker Cy5核酸标记试剂盒标记质粒DNA得到Cy5DNA. 按照8×104个/孔的细胞密度将HeLa细胞培养于半径15 mm玻璃底培养皿中，加入1.5 mL培养基，在CO2体积分数为5%、湿度为95%的37 °C恒温培养箱中培养24 h. 之后将每孔的培养基替换为1.5 mL无血清培养基，并加入制备好的n(N)/n(P)=10的G4 PATU-DMCA/DNA纳米复合物溶液50 μL (含1 μg Cy5DNA)，培养不同时间后 (4 h后将培养基更换为含10%血清的培养基)，利用激光共聚焦显微镜(confocal laser scanning microscope, CLSM)观察. 观察前，培养基中加入溶酶体染料LysoTracker Green (200 nM)培养1 h，再按每毫升培养基2滴的量将核染料Hoechst 33342加入培养基中，培养20 min，随后将培养基倒掉，用PBS溶液清洗3次，用CLSM (Nikon A1)进行观察. Lyso Tracker Green的激发、发射波长分别为488 nm、500~550 nm；Hoechst 33342的激发、发射波长分别为405 nm、425~475 nm；Cy5DNA的激发、发射波长分别为640 nm、662~737 nm.

2. 结果与讨论

2.1. PATU-DMCA的高效合成

G2~G5 PATU、PATU-DMCA合成示意图及核磁图谱分别如图1和2所示. 核磁结果表明：PATU外围双键与DMCA·HCl反应后，5.66×10−6和6.19×10−6化学位移处双键氢的核磁峰完全消失，而在0.75×10−6处出现了DMCA甲基氢的核磁峰. 0.75×10−6甲基氢与4.30×10−6酯键氢的峰面积比表明外围双键反应比例为100%.

图 1

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图 1   单体对(BMAITC，CA)和表面修饰剂(DMCA)合成PATU-DMCA的过程示意图

Fig.1   Synthesis schematic of PATU-DMCA from monomer pairs (BMAITC, CA) and surface modification agent (DMCA)


图 2

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图 2   G2~G5 PATU与PATU-DMCA的1H-NMR图谱

Fig.2   1H-NMR spectra of G2~G5 PATUs and PATU-DMCAs


以G4 PATU与G4 PATU-DMCA为例，核磁峰归属情况如下：1) G4 PATU的1H-NMR(400 MHz, CDCl3, δppm)：10.59 (s, 45H, -CNHC-), 9.15 (s, 45H, -CH2NHC-), 6.19 (s, 48H, HCH=C-), 5.66 (s, 48H, HCH=C-), 4.37 (m, 180H, -CH2O-), 3.84 (m, 90H, -NHCH2-), 3.00-2.69 (m, 216H, -CCH- & -CH 2SCH2-& -NCH2CH2N-), 1.98 (s, 144H, CH3C=CH2), 1.36 (s, 135H, CH3C-), 1.28 (m, 126H, -CH(CH3)CH2-)

G4 PATU-DMCA的1H-NMR(400 MHz, D2O，δppm)：4.30 (m, 180H, -CH2O-), 3.74 (m, 90H, -NHCH2-), 3.00-2.00 (m, 552H, -CCH- & -CH 2SCH2- & -NCH 2CH2N-& -CH2CH2N(CH3)2), 1.36 (s, 135H, CH3C-), 1.28 (m, 270H, -CH(CH3)CH2-)，0.75(s, 288H, -N(CH3)2)

与传统树枝状大分子合成过程相比，基于点击化学策略的PATU合成过程高效且条件温和. 一旦得到单体对2, 2-二(甲基丙烯酰氧基甲基)丙酰异硫氰酸酯(2, 2-bis (methacryloyloxymethyl) propyl isothiocyanate, BMAITC)和半胱胺(cysteamine, CA)，增长1代需要4 h，且产率在90%以上，因此仅需1天时间便可以合成第5代树枝状大分子. 在此基础上通过巯基-Michael加成反应便得到表面三级胺修饰的基因载体PATU-DMCA. 因此该树枝状大分子基因载体合成过程条件温和、易于纯化、高效快速.

2.2. 纳米复合物的凝胶阻滞电泳结果以及粒径分布和Zeta电位

凝胶电泳结果（见图3（a））表明，各个代数的PATU-DMCA在n(N)/n(P)=4~20时均可以有效包裹DNA，阻滞DNA迁移. 粒径D和电势P表征结果（见图3（b））表明，G2 PATU-DMCA在n(N)/n(P)=4时便可以有效压缩DNA，形成均一稳定的纳米颗粒，且分散系数为0.1. 各个代数PATU-DMCA/DNA复合物粒径在60~100 nm，Zeta电位在10~20 mV. 这些结果表明，在低代数、低氮磷摩尔比条件下，PATU-DMCA可以有效包裹负电性DNA，形成粒径良好的纳米颗粒.PATU-DMCA的高包载效率有利于纳米复合物在低毒性下发挥高基因转染作用.

图 3

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图 3   各个代数不同N/P的PATU-DMCA/DNA复合物表征

Fig.3   Characterization of the PATU-DMCA/DNA polyplexes of various generations at different N/P ratios


2.3. 纳米复合物的形态表征

如图4所示，在n(N)/n(P)=10 的条件下，G3、G4 PATU-DMCA包载DNA后形成的纳米复合物呈类球形，粒径接近100 nm，跟动态光散射仪所测的结果基本一致.

图 4

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图 4   G3、G4纳米复合物的TEM图

Fig.4   TEM images of G3, G4 polyplexes


2.4. 纳米复合物细胞水平转染效率

各个代数不同氮磷摩尔比的纳米复合物在HeLa、A549细胞系无血清条件下荧光素酶基因转染效率如图5所示，图中，L为单位蛋白质量的发光强度. 结果表明，对于HeLa细胞系（见图5（a）），G3~G5 PATU-DMCA/DNA复合物的转染效率随氮磷摩尔比均呈先增大后减小的变化趋势，且当n(N)/n(P)=8~12时，转染效率达到最大，其值与转染标准PEI相当. 与相同代数相同氮磷摩尔比的PAMAM相比，转染值均高出一个数量级. 对 于A549细胞系（见图5（b）），当n(N)/n(P)=4时，PATU-DMCA的转染效率高出PAMAM一个数量级，而随着氮磷摩尔比增大，PAMAM转染值增大，n(N)/n(P)=8~20时，两者转染值基本相当，且小于PEI转染值. 这些结果表明，对于HeLa和A549细胞系，与经典树枝状大分子PAMAM相比，PATU-DMCA在低氮磷摩尔比条件下的转染效率具有明显优势，这可能是由于PATU-DMCA的高包载效率使其在低氮磷摩尔比条件下能够具有高转染效率.

图 5

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图 5   PATU-DMCA/DNA复合物在无血清条件下的荧光素酶基因转染效率（对照组：PEI、G3~G5 PAMAM）

Fig.5   Luciferase gene transfection of PATU-DMCA/DNA polyplexes in serum-free medium (control group: PEI, G3~G5 PAMAM)


2.5. 纳米复合物细胞毒性考察

MTT结果(见图6)表明：对于HeLa和A549细胞系，在5~80 μg/mL，G3、G4 PATU-DMCA的毒性明显低于PEI，而与相同代数的PAMAM基本相当(图中，R为相对细胞成活率). 通过软件计算得到，在HeLa细胞系，G3、G4 PATU-DMCA的IC50剂量. 分别为50.18、36.39 μg/mL，G3、G4 PAMAM的IC50剂量分别为54.14、38.91 μg/mL，PEI的 IC50剂量为12.53 μg/mL. 在A549细胞系，G3、G4 PATU-DMCA的IC50剂量分别为59.27、51.09 μg/mL，G3、G4 PAMAM的IC50剂量分别为63.56、67.43 μg/mL，PEI的 IC50剂量为10.49 μg/mL. 这些结果表明，与经典树枝状大分子PAMAM相同，PATU-DMCA具有无法忽略的细胞毒性，这可能是表面N, N-二甲基半胱胺的正电性所致.

图 6

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图 6   不同质量浓度的PATU-DMCA, PEI, PAMAM 有血清条件下的细胞毒性

Fig.6   Cytotoxicity of PATU-DMCA, PEI, PAMAM at various mass concentrations in medium with serum


2.6. 纳米复合物的亚细胞分布

n(N)/n(P)=10的G4 PATU-DMCA/DNA纳米复合物在HeLa细胞系的亚细胞分布情况如图7所示. 其中红色为Cy5标记的DNA，绿色为LysoTracker Green标记的溶酶体，蓝色为Hoechst 33342标记的细胞核. 当孵育1 h时，大部分红色荧光出现在细胞膜表面，表明正电性纳米复合物正在与负电性细胞膜发生相互作用. 当孵育2 h时，纳米复合物开始通过内吞作用进入到细胞内部，当孵育4 h时，观察到大量纳米颗粒与溶酶体重合(黄色部分)，随着孵育时间进一步延长，一些红色荧光以游离状态分散在细胞质甚至细胞核中，表明PATU-DMCA具有一定破溶酶体能力，这可能是由于表面三级胺在酸性条件下质子化程度增加，导致溶酶体质子泵持续泵入大量质子，氯离子内流，最终渗透性膨胀破裂，即“质子海绵”效应[20-22]. 概括而言，G4 PATU-DMCA/DNA纳米复合物在HeLa细胞系的转运过程基本包括与细胞膜正负电荷相互作用、通过内吞作用进入细胞、大量进入溶酶体、“质子海绵”效应逃离溶酶体. 这个过程与大多数的阳离子聚合物/DNA复合物细胞转运路径是一致的[23-25]. 这些结果表明：PATU-DMCA/DNA纳米复合物具有较高的细胞摄取率，进入细胞后能够通过“质子海绵”效应有效逃离溶酶体，为高效转染提供有利条件.

图 7

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图 7   G4 PATU-DMCA / Cy5DNA纳米复合物无血清条件下孵育HeLa细胞的亚细胞分布图

Fig.7   Subcellular distribution images of HeLa cells cultured with G4 PATU-DMCA / Cy5DNA polyplexes in serum-free medium


3. 结　语

本研究讨论了本实验室自主设计的PATU树枝状大分子在基因输送中的应用. 在低氮磷摩尔比条件下，表面经过三级胺修饰的G2~G5 PATU均可以有效包载DNA，形成粒径100 nm以下的正电性纳米复合物. 与经典树枝状大分子PAMAM相比，PATU-DMCA/DNA无血清转染效率表现出较大的优势. 就细胞毒性而言，PATU-DMCA与PAMAM相当. 因此，简单三级胺修饰的PATU是一种有效的新型树枝状大分子基因载体，值得进一步优化以提高转染效率和改善细胞毒性.

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