甜瓜瓜类蚜传黄化病毒侵染响应基因鉴定
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Identification of genes in response to cucurbit aphid-borne yellows virus infection in melon
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通讯作者:
收稿日期: 2023-05-12 接受日期: 2023-05-29
基金资助: |
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Received: 2023-05-12 Accepted: 2023-05-29
作者简介 About authors
杨思语(https://orcid.org/0000-0002-6394-4530),E-mail:
关键词:
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本文引用格式
杨思语, 宫子惠, 胡仲远, 张明方, 杨景华.
YANG Siyu, GONG Zihui, HU Zhongyuan, ZHANG Mingfang, YANG Jinghua.
甜瓜(Cucumis melo)是我国重要的葫芦科经济作物之一,在我国有着3 000多年的栽培历史。据国家统计局(
目前对于甜瓜抗CABYV的遗传规律和侵染后响应基因的研究较少,影响了甜瓜抗CABYV育种进程。早在1997年,DOGIMONT等[3]对印度甜瓜抗病品系‘PI124112’和感病品系‘Védrantais’杂交群体进行研究时发现,‘PI124112’中对CABYV的抗性由2个互补隐性基因(命名为cab-1和cab-2T)共同调控。KASSEM等[4]利用‘TGR-1551’抗性甜瓜品系与西班牙易感品系‘Bola de Oro’构建遗传群体,发现‘TGR-1551’对CABYV的抗性至少由3个基因控制,其中一个为显性基因。由此可见,甜瓜抗CABYV的遗传机制较为复杂,在不同的品种中表现出不同的遗传规律。在作物抗病机制研究中,转录组测序技术如RNA测序(RNA sequencing, RNA-Seq)被广泛应用于研究各类植物与病原菌互作机制。2021年,张欢[5]从转录组水平比较分析了花生抗青枯病品种‘远杂9102’及感病亲本‘徐州68-4’对青枯菌的响应差异,鉴定到一个新的花生抗青枯病基因Arahy.5D95TJ。贺苗苗[6]对‘青薯9号’在晚疫病不同侵染时间点进行了转录组测序,通过差异表达基因(differentially expressed genes, DEGs)k均值聚类算法分析,发现侵染24 h后亚聚类1(subcluster_1)及亚聚类4(subcluster_4)有大量的差异基因上调表达,推测侵染24 h为晚疫病菌与‘青薯9号’互作的关键阶段。
侵染性克隆载体已经在多种作物抗病机制研究中广泛应用,是植物虫传病毒响应基因挖掘和遗传定位中常用的手段。蚜虫是传播CABYV的重要媒介,同时,蚜虫取食植物叶片也是一种生物胁迫,可能对甜瓜抗CABYV遗传定位研究造成干扰。构建侵染性克隆载体接种甜瓜可以模拟CABYV的侵染,并排除蚜虫伤害对植株可能造成的影响。本研究采用pCB301-CABYV侵染性克隆载体接种甜瓜‘西州蜜’(XZM),对接种0 dpi(days post inoculation,感染后时间)、5 dpi、10 dpi、15 dpi、20 dpi的甜瓜叶片进行转录组测序,挖掘CABYV侵染后的响应基因,为进一步解析甜瓜抗CABYV分子机制和抗病育种提供依据。
1 材料与方法
1.1 试验材料与试剂
本研究所采用的甜瓜品种为‘西州蜜’(XZM),甜瓜原始病叶由新疆农业科学院张学军研究员馈赠。侵染性克隆载体pCB301-CABYV由本实验室构建并保存,农杆菌菌株为GV3101。
实验相关试剂:利福平(rifampicin, Rif)、卡那霉素(kanamycin, Kana)、乙酰丁香酮(acetosyringone, AS)、酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immuno-sorbent assay, ELISA)试剂盒(上海酶计生物科技有限公司)、RNA提取试剂盒(浙江易思得生物科技有限公司)、cDNA反转录试剂盒(日本TOYOBO公司)、实时荧光定量反转录聚合酶链反应(real time quantitative reverse polymerase chain reaction, RT-qPCR)试剂盒(SYBR Green Master Mix,南京诺唯赞生物科技股份有限公司)、Gibson Assembly无缝连接试剂盒(美国New England Biolabs公司)、PCR酶试剂盒(KOD One Master Mix,日本TOYOBO公司)。
1.2 pCB301-CABYV侵染性克隆载体构建
将带有CABYV的甜瓜病叶进行RNA提取,反转录后分段扩增CABYV DNA片段,并利用无缝克隆技术拼接获得全长CABYV DNA(GenBank登录号:OQ980415),与pCB301载体重组构建得到pCB301-CABYV侵染性克隆载体。将以上侵染性克隆载体分别接种甜瓜与本氏烟,经病情调查发现甜瓜与本氏烟叶片分别于20 dpi、60 dpi时发病明显,结果如附图1~2(
1.3 农杆菌活化培养
取含有pCB301-CABYV质粒的农杆菌甘油菌液500 μL,加入含有25 µg/mL Kana和25 µg/mL Rif的抗性液体培养基,于28 ℃、250 r/min下活化约24 h;取活化好的菌液50~200 µL,置于10 mL含有抗性的Luria-Bertani(LB)液体培养基(50 µg/mL Kana、50 µg/mL Rif、10 mmol/L 2-吗啉乙磺酸生物缓冲液、25 µmol/L乙酰丁香酮)中,于28 ℃下过夜并摇菌至菌液D(600 nm)=1.5;常温下以6 000 r/min离心10 min后弃上清液,加入5 mL诱导缓冲重悬液。将接种液和植物在室温下避光静置4 h。
1.4 甜瓜接种
取‘西州蜜’甜瓜种子浸泡于1.5%硝酸钾溶液中,并在65 ℃下加热30 min,再于温水中浸泡3 h后用流水清洗。种子播种后,于温室中黑暗培养4 d,待发芽后,选择长势相对一致的甜瓜苗移栽于正常光照周期(16 h光照/8 h黑暗)环境中培养。待甜瓜长至一叶一心时,进行黑暗处理24 h,随后对子叶注射1 mL pCB301-CABYV侵染性克隆载体菌液,同时设置阴性对照叶片处理组(注射空载体菌液),接种完成后再次进行黑暗处理24 h,之后恢复正常光照周期。对侵染0 dpi、5 dpi、10 dpi、15 dpi、20 dpi的甜瓜叶片分别取样并调查叶片发病症状。
1.5 感病鉴定
1.5.1 CABYV包被蛋白基因的RT-qPCR扩增
提取侵染20 dpi的甜瓜发病叶片RNA,并反转录成cDNA。根据CABYV的病毒包被蛋白(coat protein, CP)基因保守区域,设计上、下游特异性引物(CP-F/R),由浙江有康生物科技有限公司合成。RT-qPCR在不含核糖核酸酶的反应管中进行:加入cDNA模板200 ng,CP-F/R各1 µL,PCR酶25 µL,加水补足至50 µL。扩增程序如下:98 ℃预变性5 min;98 ℃变性10 s,60 ℃退火5 s,68 ℃延伸5 s,35个循环;72 ℃延伸7 min。所用引物序列:CP-F,5
1.5.2 ELISA反应
对侵染20 dpi的甜瓜发病叶片取样,参照ELISA试剂盒说明书检测甜瓜植株叶片中CABYV的含量,通过标准曲线计算样品中CABYV含量。实验结果判定的临界值(cut off)为病毒载量0.58 ng/g,超过该阈值即判定为阳性。
1.6 转录组测序
1.6.1 甜瓜叶片取样与测序
结合植株发病情况、ELISA和RT-qPCR分析结果,分别选取CABYV接种0 dpi、5 dpi、10 dpi、15 dpi、20 dpi后鉴定为阳性的9株植株混合,每个处理取3个生物学重复,转录组测序由北京诺禾致源科技股份有限公司完成。
1.6.2 差异表达基因富集分析
1.6.3 基因共表达与互作分析
对处理组差异表达基因数量进行共表达统计,并找到对应的富集通路以进行互作分析。蛋白质-蛋白质互作(protein-protein interaction, PPI)网络分析可视化基于蛋白质互作数据库STRING(
1.7 RT-qPCR扩增
根据MELO3C021057(RIN4)基因的编码序列,利用qPrimerDB网站(
采用2-ΔΔCT法[9]计算基因相对表达量,采用SPSS 23.0软件中的独立样本t检验对数据进行差异显著性分析,以P<0.05和P<0.01表示差异有统计学和高度统计学意义。
2 结果与分析
2.1 pCB301-CABYV侵染后甜瓜病情鉴定
2.1.1 接种pCB301-CABYV后甜瓜叶片症状
对接种pCB301-CABYV后的‘西州蜜’进行病情鉴定,如图1所示:在接种后0~20 dpi内,叶片病征逐渐变化,5 dpi时甜瓜叶片出现小部分叶片增厚和不规则褪绿黄斑,10 dpi时叶片局部略微褪绿,15 dpi时叶片边缘逐步黄化、出现明黄色,20 dpi时整个叶面明显褪绿但叶脉仍为绿色,且叶片明显增厚。
图1
图1
甜瓜‘西州蜜’接种pCB301-CABYV后在5个时间点的叶片病征
A.叶片正面;B.叶片背面。
Fig. 1
Disease symptoms of melon XZM leaves inoculated with pCB301-CABYV at five time points
A. Front of the leaf; B. Back of the leaf.
2.1.2 叶片中CABYV的CP基因表达与鉴定
由2.1.1节可知,pCB301-CABYV侵染甜瓜20 dpi时叶片发病明显,为进一步确定pCB301-CABYV侵染情况,分别取0 dpi、5 dpi、10 dpi、15 dpi、20 dpi的发病叶片与阴性对照叶片,以其cDNA为模板,用CP-F/R引物进行RT-qPCR扩增。琼脂糖凝胶电泳分析结果显示:阴性对照组未显示条带,20 dpi处理组中大部分可见750 bp左右的目的条带,说明在接种病毒后的植株中存在CABYV的CP基因(图2)。
图2
图2
20 dpi时甜瓜叶片中CABYV的 CP 基因扩增情况
M:DL2000 DNA分子质量标志物。1~18:接种pCB301-CABYV的甜瓜发病叶片;19:阴性对照叶片。
Fig. 2
Amplification of CP gene of CABYV in melon leaves at 20 dpi
M: DL2000 DNA marker. 1-18: Melon leaves inoculated with pCB301-CABYV; 19: Negative control leaves.
2.1.3 叶片中CABYV含量测定
ELISA结果发现,接种pCB301-CABYV的甜瓜发病叶片中CABYV含量超过阈值的植株与RT-qPCR检测的结果基本一致(图3)。
图3
图3
被侵染甜瓜叶片中CABYV含量的ELISA结果
1~18:接种pCB301-CABYV的甜瓜发病叶片;19:阴性对照叶片。
Fig. 3
ELISA results of CABYV
1-18: Melon leaves inoculated with pCB301-CABYV; 19: Negative control leaves.
2.2 差异表达基因鉴定结果
利用Illumina高通量测序技术对以上样品进行转录组测序,结果显示:平均每个样本产生42 900万个读长,转录组比对率为94.96%~96.52%,
图4
图4
各转录组样本的相关性分析与主成分分析
Fig.4
Correlation and PCA analyses of samples for transcriptome
通过比对和统计分析发现,相比0 dpi处理组,pCB301-CABYV侵染甜瓜后5 dpi、10 dpi、15 dpi、20 dpi时的差异表达基因分别有4 548、5 702、5 422、5 959个。其中,在5 dpi、10 dpi、15 dpi、20 dpi时下调的差异表达基因分别有2 666、2 642、3 045、3 391个,上调的差异表达基因分别有1 882、3 060、2 377、2 568个(图5)。
图5
图5
pCB301-CABYV侵染甜瓜后各组间的差异表达基因数
Fig. 5
Numbers of DEGs in melon inoculated with pCB301-CABYV between groups
2.3 20 dpi时差异表达基因富集分析
图6
图6
0 dpi与20 dpi处理组差异表达基因GO功能注释(A)和KEGG富集分析(B)
Fig. 6
GO function annotation (A) and KEGG enrichment analysis (B) of DEGs between 0 dip and 20 dpi treatment groups
2.4 接种后不同时间点共有差异表达基因分析
由维恩图可知,5 dpi vs 0 dpi、10 dpi vs 0 dpi、15 dpi vs 0 dpi、20 dpi vs 0 dpi 4组间共有显著差异表达基因1 654个(图7A),其中上调基因677个,下调基因977个。对4组共有差异表达基因进行富集分析,GO功能注释显示这些基因多富集于胺代谢过程、激素水平调节、激素代谢过程、类囊体、类囊体部分、类囊体膜、光合膜、膜的外在成分、钙离子结合、辅酶结合等通路(图7B);KEGG富集分析显示这些基因主要集中在植物-病原互作、淀粉和蔗糖代谢、光合作用、类胡萝卜素生物合成和光合作用-天线蛋白等通路(图7C)。这些差异表达基因通路与植物受到病原体侵染及植物免疫机制有着密切联系,推测甜瓜接种pCB301-CABYV后激活了植物-病原互作通路,从而影响钙离子调节。除此之外,所涉及的光合作用和类胡萝卜素生物合成通路可能与甜瓜被CABYV侵染后的叶片黄化症状有关。
图7
图7
不同处理组间共有显著差异表达基因分析
A.维恩图;B. GO功能注释;C. KEGG富集分析。
Fig. 7
Analysis of significantly shared DEGs between groups
A. Venn diagram; B. GO function annotation; C. KEGG enrichment analysis.
利用Cytoscape软件对组间共有显著差异表达基因进行蛋白质互作(PPI)网络可视化分析,建立互作网络并进行k均值聚类算法分析,发现富集在植物-病原互作通路中的蛋白有13个(图8)。其中,KCS2和KSC11均为酮酰辅酶A合成酶2(keto-acyl CoA synthase 2, KCS)家族成员,参与超长链脂肪酸(very long chain fatty acids, VLCFA)的生物合成,与逆境胁迫和抗病有关[10]。CAM7、CML41、AT1G18210、CML42、ATCP1、CNGC18与AT1G24620可调节各种钙离子通道活性及酶调节活性,主要参与对病原的防御反应,另外CNBT1参与脱落酸与茉莉酸的反应。RIN4是与植物免疫受体蛋白RPM1(resistance to Psudomonas syringae pv. maculicola 1)相互作用的关键基因,已有研究显示该基因编码的蛋白复合体可能为来自病原体Ⅲ型效应子(毒力因子)的毒力靶点,RIN4的过表达抑制了与效应蛋白AvrRpt2功能相关的多种表型,也抑制了病原体相关分子模式(pathogen-associated molecular pattern, PAMP)诱导的防御信号[11]。CPK2、CPK6与脱落酸激活信号通路有关,且负责气孔开放的调控[12]。
图8
图8
共有显著差异表达基因植物-病原互作网络
Fig. 8
Plant-pathogen interaction network of significantly shared DEGs
本研究发现,在pCB301-CABYV侵染过程中,KCS家族基因表达下调,参与各种钙离子通道与病原防御反应的关键基因在整个过程中表达量呈下调趋势,推测‘西州蜜’受到CABYV侵染后使KCS家族基因的表达整体下调。此外,RIN4作为病原防御反应的关键基因,编码毒力靶点蛋白复合体,可激活免疫反应使植物抗病,其可能与甜瓜响应pCB301-CABYV侵染有关。
2.5 RIN4 的RT-qPCR分析结果
根据PPI网络推测MELO3C021057(RIN4)是植物-病原互作通路中的重要基因,因此对样本接种后在5个时间节点(0 dpi、5 dpi、10 dpi、15 dpi、20 dpi)进行取样,检测MELO3C021057(RIN4)在叶片中的表达情况。
RT-qPCR结果显示,接种前(0 dpi)MELO3C021057表达量最高,随着侵染时间的推移,MELO3C021057相对表达量显著降低(图9)。结合差异表达基因富集在植物-病原互作通路上的结论与该基因的RT-qPCR分析结果,推测MELO3C021057(RIN4)可能是参与响应pCB301-CABYV侵染的基因,且负调控CABYV侵染的响应。
图9
图9
CABYV侵染后甜瓜 MELO3C021057 基因在5个时间点的相对表达量
箱线图上不同大写字母表示在P<0.01水平差异有统计学意义。
Fig. 9
Relative expression levels of MELO3C021057 in melon
Different uppercase letters above box plots indicate significant differences at the 0.01 probability level.
3 讨论与结论
甜瓜抗病毒病机制涉及通路较多,尤其是虫传病毒病的免疫响应受多方面调控。利用侵染性克隆载体pCB301-CABYV接种甜瓜以模拟CABYV侵入甜瓜幼苗,可排除昆虫取食的潜在干扰,更加准确地解析甜瓜对CABYV侵染的响应机制。本研究对接种pCB301-CABYV后5个时间点(0 dpi、5 dpi、10 dpi、15 dpi、20 dpi)的甜瓜植株进行转录组分析,鉴定出1 654个共有显著差异表达基因,其中上调基因677个,下调基因977个。
为抵抗病原微生物的侵害,植物在长期的进化中形成了一系列复杂而有效的保护机制。本研究对甜瓜接种pCB301-CABYV后的叶片进行差异表达基因富集分析,发现在GO分析中差异表达基因多富集于钙离子结合与胺代谢过程通路。植物在感知病原入侵后,启动并协调免疫反应,而细胞质钙离子浓度升高是植物免疫中早期反应之一,同时也是触发下游免疫信号传导的关键因子[13]。有研究表明,钙离子信号可激活植物免疫通路,同时钙离子受体也可作为免疫抑制的核心[14]。胺代谢过程通路中,金属结合分子烟草胺在锌离子运输过程中起关键作用,烟草胺对于根到叶的金属离子的转运至关重要[15]。有研究表明,锌元素可以参与植物的免疫反应,通过调节植物内源性抗生物素或激素的水平,以此来提高植物对病原微生物的抵抗力[16]。在钙离子通路与胺代谢通路中,可能存在与甜瓜抗CABYV性状密切相关的基因,未来还需要进一步验证。
植物天然免疫是模式识别受体对保守的病原体相关分子模式的识别,以及抗病蛋白对效应蛋白的识别。植物与病原体互作时普遍存在多种信号通路,其中信号分子起着关键的调节作用,并决定着植物与病原体之间的竞争[17]
本研究鉴定到多个响应pCB301-CABYV侵染的重要差异表达基因,并分析了这些基因的主要富集通路(如植物-病原互作),其中在植物-病原互作通路中发现与植物抗病、免疫相关的基因表达量呈下调趋势,这可能与甜瓜对CABYV的感病有关,后续工作中可进一步进行关键基因验证,探究相关基因调控甜瓜响应CABYV的分子机制,也可利用基因编辑技术靶向病毒侵染或复制所需的植物内源基因,以创制新的抗病毒种质资源[20]。
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