阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease, AD）是一种最常见的以认知能力丧失为特征的中枢神经系统退行性疾病^[1]。国际阿尔茨海默病协会在2018年度报告中指出，全球有5 000多万人患有痴呆症，估计到2050年受影响的人数将突破1.52亿^[2]。AD已成为仅次于心血管疾病、脑卒中和癌症的第4大致人死亡的疾病。到2050年可能造成的直接经济负担为7 453亿元^[3]。虽然研究人员对AD的发病机制进行了许多研究，但是至今尚无特效药物问世。近年来，中国大量实验研究和临床应用结果表明，某些天然产物在针对AD的调节神经递质及脑内蛋白质含量、抗神经炎症和氧化应激反应、改善脑能量代谢、减少神经元丢失、抑制细胞凋亡等神经生物机制方面有一定的促进作用。使用天然物质治疗AD的研究正在不断增多。最近的流行病学研究已经证实，富含黄酮类化合物的中草药和果蔬可以减轻人认知能力的下降；同时，这类物质对人类的健康也有许多有益的作用，如抗癌^[4]、抗炎^[5]和抗氧化应激^[6]等。因此，了解AD的多种发病机制并研发相应的AD药物显得非常迫切。

铁观音是闻名全国的乌龙茶，原产于福建省安溪县西坪镇。目前，以安溪县的西坪镇、祥华乡和感德镇3个产地的铁观音品质最为上乘，是闽南乌龙茶中的上品，素有“绿叶红镶边，七泡有余香”的美誉^[7]，受到国内外爱茶者的追捧。乌龙茶中富含多种生物活性成分，主要包括生物碱类、茶氨酸、茶多酚、茶黄素、芳香类物质等，这些成分通过协同作用对人体健康带来益处。相关研究发现，铁观音茶具有抗氧化、抗肿瘤、降脂、抗炎等功效^[8]。铁观音由新鲜且完整度好的茶叶经晒青、做青、杀青、包揉、干燥等多道工艺制作而成。清香、浓香和陈香型铁观音的加工工艺参数有显著不同，其活性物质也有显著性差异，因此，其功效也会有所不同。

脑内过氧化环境会导致神经元细胞损伤，引起AD发生。作为健康饮品的茶叶含有丰富的抗氧化成分，如果能够预防AD的发生，将会很好改善老年人的生存质量。至今，AD的治疗方案仍旧是全世界的一大难题。目前，国内外以茶叶活性成分单体对AD保护作用的研究居多，而关于茶叶提取物对AD保护作用的研究甚少，且尚未见铁观音提取物对AD保护作用的研究报道。所以，本文将采用不同加工工艺制备而成的3种不同香型铁观音进行AD小鼠的预防作用和机制研究，探讨不同香型铁观音对AD小鼠的行为影响及作用机制。

用相同鲜叶加工而成的清香型铁观音（Tgy-Q）、浓香型铁观音（Tgy-N）、陈香型铁观音（Tgy-C），由福建安溪岐山魏荫名茶有限公司魏月德大师亲自制作，并且友情提供。福林酚、三氯化铝、黄酮、茚三酮、考马斯亮蓝G-250、浓硫酸、无水乙醇、无水甲醇和乙酸（均为分析纯），乙腈（色谱纯），均购自国药集团化学试剂有限公司；多奈哌齐（规格为每片 5 mg，批号130821A）购自卫材（中国）药业有限公司；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase, SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase, GSH-Px）、丙二醛（malondialdehyde, MDA）测定试剂盒购自南京建成生物工程研究所；二喹啉甲酸（bicinchoninic acid, BCA）蛋白浓度测定试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司。免疫组化试剂一抗胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein, GFAP）和离子钙接头蛋白1（ionized calcium-binding adaptor molecule-1, Iba-1）以及二抗辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase, HRP）-标记的山羊抗鼠/兔购自美国ProteinTech公司。

Alpha1-4 LD plus真空冷冻干燥机（德国Christ公司）、UV759S紫外-可见分光光度计（上海精密科学仪器有限公司）、Infinite M200 PRO酶标仪（上海帝肯贸易有限公司）、5804R低温高速离心机（德国Eppendorf公司）、RM2016病理切片机（上海徕卡仪器有限公司）、Eclipse CI正置光学显微镜（日本尼康公司）、J-12J脱水机（武汉俊杰电子有限公司）、JB-P5包埋机（武汉俊杰电子有限公司）、DHG-9140A烤箱（上海慧泰仪器制造有限公司）、JB-L5冻台（武汉俊杰电子有限公司）、KD-P组织摊片机（浙江省金华市科迪仪器设备有限公司）。

将Tgy-Q、Tgy-N和Tgy-C茶样利用粉碎机磨成粉状，各称取3 g放入三角锥形瓶，用30倍体积的沸水搅拌后放入100 ℃水浴锅浸提30 min，每隔10 min用玻璃棒搅拌1次，浸提结束后使用真空过滤。滤渣则继续加入20倍体积的沸水，在100 ℃水浴锅中浸提20 min，同样间隔10 min用玻璃棒搅拌1次，结束后再次过滤。剩下的滤渣再加入20倍体积的沸蒸馏水，按同样的方法浸提后合并全部滤液。最后使用旋转蒸发仪浓缩至约1/10，将制成的浓缩液放入－20 ℃冰箱冷冻，再利用冷冻干燥技术制成铁观音提取物冻干粉，密封包装，于－20 ℃冰箱中保存，备用。经检测，清香型、浓香型和陈香型铁观音（Tgy-Q、Tgy-N和Tgy-C）的浸提率分别是31.75%、32.24%和30.59%。

茶多酚含量的测定采用福林酚法^[9]，游离氨基酸含量的测定采用茚三酮法^[10]，可溶性蛋白质含量的测定采用考马斯亮蓝法^[10]，可溶性糖和茶多糖含量的测定采用蒽酮-硫酸法^[9]，总黄酮含量的测定采用三氯化铝比色法^[11]，咖啡碱和儿茶素含量的测定采用高效液相色谱法^[12]。经检测，3种香型铁观音提取物均含有较高浓度的茶多酚、黄酮、游离氨基酸及咖啡碱等活性成分，其中茶多酚质量分数均在300 mg/g以上。此外，Tgy-Q提取物中茶多酚（43.72%）、游离氨基酸（6.41%）和可溶性糖（18.1%）含量最高，而可溶性蛋白质（8.86%）、茶多糖（4.86%）、黄酮（2.41%）、咖啡碱（7.13%）含量最低；Tgy-C提取物中可溶性蛋白质（10.47%）、茶多糖（5.74%）、黄酮（3.21%）与咖啡碱（7.49%）含量最高，茶多酚（36.82%）、游离氨基酸（4.79%）和可溶性糖（13.9%）含量最低；Tgy-N的各成分含量均在两者之间。

剂量设置：按照人体每日饮茶推荐剂量0.15 g/kg^[13]乘以铁观音浸提率的20倍的高剂量作为小鼠灌胃给药剂量。

实验动物及分组：本研究采用的无特定病原（specific pathogen free, SPF）级6月龄雌性APP/PS1（APPswe/PSEN1dE9）小鼠40只及其同窝野生型小鼠（C57BL/6J）10只购于上海南方模式生物科技股份有限公司（源自美国Jackson实验室），并饲养于浙江中医药大学SPF级实验动物中心。所有小鼠常规分笼饲养，饲养环境干净卫生，采用独立通风系统，实验动物房温度控制在（24±2） ℃，空气相对湿度保持在50%～60%之间，采用12 h/12 h昼夜交替（每天晚8：00熄灯，早8：00开灯）模式饲养，实验过程中所有小鼠自由摄食和饮水。供试小鼠实验分组情况如表1所示。

给药处理：每日给药1次，各铁观音处理组小鼠按体质量分别灌胃不同香型的铁观音提取物，正常组和模型组小鼠给予按体质量换算的无菌水，药物组小鼠给予1 g/（kg•d）多奈哌齐，灌胃70 d。具体的灌胃给药方案如表1所示。

利用Y迷宫实验评估小鼠的自发交替行为的正确率来反映小鼠短暂学习的记忆能力^[14]。Y迷宫由3等分向外呈辐射状的3个臂组成，单臂长40 cm、宽8 cm、高15 cm，在Y迷宫上方安装红外线摄像追踪系统，并连接到含配套软件的计算机上，各臂之间的夹角呈120°。将3个臂分别设定为A、B和C。将Y迷宫置于较为安静的房间内，在实验开始时将小鼠置于Y迷宫的中点，打开摄像头记录小鼠在8 min内的运动情况，然后将小鼠放回笼内。每只检测结束后，都使用70%乙醇清洁实验装置以消除小鼠气味。分析并记录小鼠进入各臂的次数，每相邻3次进入不同的臂记为正确，否则记为错误。通过Smart 3.0软件记录进臂顺序及总次数以计算自发交替行为的正确率（自发交替反应率）。自发交替反应率=正确进入次数/（进臂总次数－2）×100%。

旷场实验（open field test, OFT）是一种在社会探索基础上检测小鼠焦虑行为学的经典方法^[15]。小鼠常喜欢挨墙行走，空旷范围内活动较少，但其对新环境的探索欲望，又驱使小鼠进入中央区域。当进入中央区域次数、运动距离及时间发生变化时，都是其行为改变的表现。小鼠在中央区域活动次数越多，说明其焦虑越少，以此作为小鼠情绪评价的指标^[16]。旷场实验装置为正方形开放场检测箱（长50 cm、宽50 cm、高40 cm），将安装在检测箱上方的红外线摄像追踪系统连接到装有配套软件的计算机上，并将检测箱置于安静的房间内。将小鼠轻放于旷场中央区后立即开启录像设备，记录小鼠在箱中5 min内的活动情况。检测结束后将小鼠取出放回笼内。每只小鼠检测结束后，均使用70%乙醇清理旷场内部，消除小鼠气味，以防干扰下一只实验小鼠测试行为的结果。

行为学实验测试结束后，所有实验小鼠均禁食12 h，不禁水，次日进入收集血浆和组织取材阶段。各组小鼠经腹腔注射10%水合氯醛，进行全身麻醉，通过眼球取血并断头处死后，迅速取出大脑皮层和脑内双侧海马组织并置于液氮中，然后迅速转置于－80 ℃冰箱中保存，用以进行血浆抗氧化指标的测定和脑组织免疫组化染色等。实验动物的饲养和处理均严格遵循浙江中医药大学实验动物使用和伦理相关章程，伦理审查批号为IACUC-20190729-12。

小鼠血浆氧化应激指标SOD、GSH-Px、MDA的测定方法参考试剂盒说明书。

将供试脑组织置于20 mL预冷的4%多聚甲醛溶液中固定48 h，经常规石蜡组织包埋、切片。将切片放置于60 ℃恒温箱内烘30 min，然后放入二甲苯Ⅰ和二甲苯Ⅱ溶液中各15 min，取出切片，用磷酸盐缓冲液（phosphate buffer solution, PBS）清洗，然后依次在无水乙醇及95%、85%和70%乙醇中各浸泡5 min，再用PBS漂洗3次，每次5 min。接着用0.025% Triton X-10的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐（TRIS hydrochloride, Tris-HCI）缓冲液漂洗2次，每次5 min；0.3%的H₂O₂-Tris缓冲生理盐水（Tris-buffered saline, TBS）溶液漂洗15 min；TBS漂洗3次，每次5 min。用含10%正常血清加1%牛血清白蛋白（bovine albumin, BSA）的TBS室温封闭2 h后，滴加含1% BSA的一抗TBS稀释液（GFAP、Iba-1）将组织完全覆盖，于4 ℃冰箱内孵育过夜。取出切片并放入37 ℃恒温箱复温30 min，用含0.025% Triton X100的TBS漂洗3次，每次5 min。轻轻甩干切片，滴加酶标二抗（HRP标记羊抗兔IgG），孵育10 min，用TBS漂洗3次，每次5 min，然后滴加酶标生物素，孵育10 min，用PBS漂洗3次。用二氨基联苯胺（diaminobenzidine, DAB）工作液对切片进行显色，在显微镜下观察，当出现棕黄色阳性表达时，及时将切片放入自来水终止显色。然后将切片依次放入70%、85%、95%和无水乙醇中各浸泡5 min，最后将切片放入二甲苯Ⅰ和二甲苯Ⅱ溶液中各10 min至透明，擦干切片，在其中央滴加1～2滴中性树胶，加盖玻片进行封片。晾干后在显微镜下观察小胶质细胞和星形胶质细胞形态，并拍照。

所有实验至少重复3次，实验数据用平均值±标准差表示。采用Origin Pro软件进行绘图，用Excel 2019和SPSS 22.0软件进行统计分析，并采用单因素方差分析和Turkey法进行差异显著性检验。

用药物和铁观音提取物处理后，各组小鼠工作记忆能力变化实验结果如图1所示。模型组小鼠的自发交替反应率比正常组降低了16.0%，具有统计学意义（P＜0.001），说明建模成功。多奈哌齐组小鼠的自发交替反应率比模型组增加了13.4%（P＜0.01）。Tgy-Q组、Tgy-N组和Tgy-C组小鼠的自发交替反应率分别比模型组增加17.3%、17.6%、19.8%，呈显著性差异（P＜0.001），即用3种铁观音提取物处理后APP/PS1小鼠工作记忆能力较模型组显著提高，说明铁观音提取物有改善小鼠工作记忆能力的效果。这与研究报道的茶叶中茶多酚、咖啡碱等活性成分对大脑具有神经保护作用，可以有效地缓解或降低AD的发病率结论^[17]相一致。

对小鼠运动总距离、空间探索能力及焦虑行为的评估结果如图2所示。与正常组相比，模型组小鼠运动的总距离显著增加了42.28%（P＜0.001）。与模型组相比，多奈哌齐组和Tgy-C组小鼠运动的总距离显著减少，分别为19.22%和19.93%（P＜0.01）；虽然Tgy-Q组和Tgy-N组小鼠运动的总距离也分别减少了10.65%和9.87%，但两者之间无显著性差异（P＞0.05）。

评估小鼠在中央区域的运动距离及时间（图3）发现：与正常组相比，模型组小鼠在旷场中央区域的运动距离及停留时间分别显著减少了50.1%和67.4%（P＜0.001）。与模型组小鼠相比，多奈哌齐组小鼠在旷场中央区域的运动距离和停留时间分别增加了32.7%和37.7%，但无统计学差异（P＞0.05），而3种类型铁观音提取物处理组小鼠在中央区域的运动距离和停留时间显著增加。其中：运动距离以Tgy-C组的效果最佳，增加93.0%（P＜0.001），其次是Tgy-N组，增加82.0%（P＜0.001），而Tgy-Q组增加49.2%（P＜0.01）；Tgy-C组小鼠在中央区域停留时间最长，增加105.0%（P＜0.01），Tgy-N组小鼠增加84.1% （P＜0.01），Tgy-Q组小鼠增加66.8%（P＜0.05）。

经过不同处理后，小鼠在旷场中5 min活动时间的运动轨迹如图4所示。正常组小鼠在中央区域的穿越次数比其他组多。模型组小鼠穿越中央区域的次数减少，在边缘区域带的时间增长。与模型组相比，多奈哌齐组小鼠和3种类型铁观音提取物组小鼠穿越次数增加，在中央区域的运动距离增长，尤其是Tgy-C组小鼠穿越中央区域的次数及时间明显增加。

通过测定各组小鼠血浆的MDA含量、SOD和GSH-Px活性，研究不同类型铁观音提取物对APP/PS1小鼠血浆抗氧化水平的影响，结果如图5所示。与正常组相比，模型组小鼠MDA含量显著上升19.4%，GSH-Px活性下降2.5%，SOD活性极显著降低21.2%，表明模型组小鼠血浆内氧化水平过高且抗氧化能力下降，出现了较严重的氧化应激反应。与模型组相比，多奈哌齐组和Tgy-Q、Tgy-N、Tgy-C组MDA含量分别显著降低18.40%、18.44%、12.97%、15.11%，SOD活性分别升高15.87%、15.31%、13.69%、18.80%；其中，Tgy-C组极显著升高了小鼠SOD活性（P＜0.01），Tgy-Q组极显著降低了血浆MDA含量（P＜0.001）。Tgy-Q、Tgy-N、Tgy-C组的GSH-Px活性较模型组分别升高了1.33%、1.06%、1.12%，但组间无明显差异。综上可知，3种铁观音提取物和多奈哌齐都能通过降低膜脂质过氧化物MDA含量、升高抗氧化酶SOD和GSH-Px活性来改善AD小鼠血浆的氧化应激水平。

通过免疫组化实验对APP/PS1小鼠脑部皮层区、海马区星形胶质细胞GFAP蛋白进行观察，结果如图6所示。正常组小鼠皮层区和海马区的星形胶质细胞数量少且分布均匀，细胞呈分枝状，分枝纤细均匀；模型组小鼠皮层区和海马区的星形胶质细胞活化变形，呈阿米巴状聚集，面积增大，细胞质紧密，细胞形态皱缩；阳性对照多奈哌齐组小鼠星形胶质细胞形态明显改善；3种铁观音提取物组小鼠活化星形胶质细胞数量和面积明显减少，四周星形胶质细胞形态明显恢复，细胞形态和面积变小，其中Tgy-C组改善最为显著。

通过免疫组化实验观察APP/PS1小鼠脑部皮层区、海马区小胶质细胞表面标志物Iba-1蛋白形态，结果如图7所示。在正常组小鼠皮层区和海马区，小胶质细胞数量少且分布均匀，细胞呈圆形，分枝较少；在模型组小鼠皮层区和海马区，小胶质细胞活化变形，面积增大，分枝增多，细胞形态皱缩；阳性对照多奈哌齐组小鼠小胶质细胞形态有明显改善，变形细胞面积和数量减少；3种铁观音提取物组小鼠小胶质细胞数量、面积下降，周围活化的小胶质细胞形态有明显恢复，呈圆形的细胞居多，细胞分枝变少，正常细胞数量增多，其中Tgy-C组细胞形态相对更好。

茶叶被认为具有抗氧化、保护神经、抗衰老等作用，而衰老、氧化应激和由多种原因导致的神经损伤甚至神经元凋亡等都是AD发生的关键因素，因此，茶成分在AD中的研究利用日益增多。有研究发现，给12月龄的老年雄性Wistar大鼠饮用绿茶提取物水溶液后能有效改善其学习记忆能力，并且能降低乙酰胆碱酯酶活性^[18]。LI等^[19]发现，在冈田酸诱导的AD模型大鼠中，冈田酸能引起Tau蛋白高度磷酸化，而经过茶多酚预处理后，Tau蛋白磷酸化程度明显降低，并可改善AD模型大鼠空间记忆能力。黄酮类化合物也已经被证实可以通过血脑屏障进入大脑，并且能够减少神经胶质细胞介导的炎症因子的释放^[20]。近年来的研究表明，茶对改善AD动物学习记忆能力有一定的作用^[21]。AD典型的行为学病理特征包括认知功能出现问题、行为性格突变、学习记忆能力下降。本研究主要采用Y迷宫和旷场实验观察不同类型铁观音提取物对8月龄APP/PS1小鼠的学习及认知功能的影响。Y迷宫实验结果表明，铁观音提取物处理的各组小鼠学习记忆能力与模型组相比明显改善，与多奈哌齐组小鼠比较有改善效果。旷场实验结果发现，Tgy-C组小鼠的运动总距离呈明显下降趋势，Tgy-Q组和Tgy-N组小鼠比模型组相比运动的总距离减少，但无显著性差异。3种类型铁观音提取物组小鼠在中央区域的运动距离和停留时间显著增加，其中，Tgy-C组小鼠的效果最佳，其次为Tgy-N组小鼠。

AD的标志性特征病变是Aβ蛋白堆积导致的老年斑和Tau蛋白异常聚集形成的神经元纤维缠结^[22]。神经元细胞死亡与Aβ联合其他机制产生的作用相关。如：通过各种情况产生活性氧（reactive oxygen species, ROS），呈现过氧化环境，线粒体膜系统被破坏，其自身代谢和功能都会受到损伤，并有细胞凋亡情况的出现；还有小胶质细胞受到刺激活化后释放促炎因子，加速脑组织的神经炎症反应，使神经细胞一直处在连续凋亡的状态下。

脑内的过氧化环境被认为是导致神经元细胞损伤的重要因素。当氧化产物ROS过多而不能完全消耗时，就会出现氧化应激状态^[23]。多年来的研究表明，茶叶有超强抗氧化能力，可有效防止氧化应激反应。茶叶多酚类成分对AD相关动物及细胞模型抗氧化效果显著，可以明显提高认知能力。LI等^[24]对老年小鼠进行儿茶素处理后发现，儿茶素使小鼠血清中的SOD和GSH-Px活性上升。CHEN等^[25]发现，带有没食子酰基的儿茶素对PC12细胞活性有明显的提高效果，并显著减少ROS的生成。AD患者大脑中Aβ大量沉积为斑块，导致氧化应激反应加强，经一系列反应之后，MDA含量增加，SOD、GSH-Px活性下降，老年斑更多，神经元被损伤，最终认知障碍加剧^[26]。因此，MDA、GSH-Px和SOD已成为判断氧化应激的重要指标。本文通过检测APP/PS1小鼠上述3个指标来反映其体内氧化应激水平。与模型组相比，3种铁观音提取物组与多奈哌齐组均可显著减少APP/PS1小鼠血浆内MDA含量，提高SOD和GSH-Px活性，表现出对APP/PS1小鼠氧化应激水平的显著改善效果。以上结果表明，3种铁观音提取物和多奈哌齐在APP/PS1小鼠血浆内均可通过提高内源性抗氧化能力和降低过氧化水平来释放氧化应激因子，但不同类型铁观音提取物作用效果存在一定差异。阳性对照药物多奈哌齐是有效延缓AD症状的一种胆碱酯酶抑制剂。研究证明，多奈哌齐能够防止Aβ毒性^[27]，表现为Aβ诱导小鼠模型氧化应激和认知水平降低^[28]，另外，还抑制APP/PS1小鼠小胶质细胞激活及炎症因子的释放^[29]。陈香型铁观音在黄酮、茶多糖、咖啡碱和可溶性蛋白质含量上较其他2组多，浓香型其次，清香型最少。陈香型香气组分以醛类和酮类为主，浓香型以醇类和酮类为主，清香型以醇类和氢类为主。这可能与不同铁观音提取物中生化和香气成分的差异而协同效果不同相关。

GFAP是星形胶质细胞的骨架蛋白，充满于星形胶质细胞的胞体和突起内。GFAP和Iba-1分别是星形胶质细胞和小胶质细胞特有的表面标志物^[30-31]。本文通过观察GFAP、Iba-1的形态发现，3种铁观音提取物组小鼠脑内小胶质细胞和星型胶质有明显的改善。这说明铁观音提取物在一定程度上可以调控脑内炎症反应相关的神经细胞的形态功能。

综上所述，3种不同香型的铁观音均可以抑制APP/PS1小鼠脑内氧化应激水平，改善8月龄APP/PS1小鼠的学习记忆能力和焦虑行为，修复小胶质细胞和星形胶质细胞形态。由此可推测，铁观音提取物对AD小鼠脑内炎症反应有一定改善作用。未来拟进一步探究铁观音提取物中的主要成分在AD动物模型中的改善功效差异以及铁观音提取物和茶叶单体成分的协同改善效果，阐明与其他活性成分联用是否会增强改善AD的作用。