乙烯是一种重要的植物激素，在植物花的发育[1-2]、果实的成熟[3-5]、遭受机械损伤[6-7]和生物与非生物胁迫[8-10]等过程中具有重要的调控作用。而1-氨基环丙烷-1-羧酸（1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid, ACC）合成酶（ACC synthase, ACS）是植物体内调节乙烯形成的关键酶和限速酶。ACC合成酶（ACS）是以磷酸吡哆醛（pyridoxal phosphate, PLP）为辅酶的酶家族，在高等植物中由多基因家族编码[11]。已在多种植物中发现了编码ACC合成酶的ACS基因，其中：拟南芥中存在12个ACS基因[12]，番茄中至少存在9个[7]，水稻中存在5个[11,13]，西葫芦中至少有2个[11]，枇杷中至少有2个[14]等；并且在牵牛花[2]、猕猴桃[15]、香蕉[16]、西瓜[17]、葡萄[18]、桃[3]、番木瓜[19]、荔枝[20]、李[21]、甘蔗[22-24]、茶树[25]和树莓[26]等作物中也有ACS基因的相关研究报道。
茄子是生长在热带和温带地区的一种重要的蔬菜作物，而目前关于茄子中与乙烯生物合成相关的ACS基因的研究报道相对较少。因此，基于本课题组前期得到的茄子低温转录组数据，筛选到1个显著差异表达基因，并根据该基因编码的氨基酸序列，经NCBI数据库（
1 材料与方法
1.1 生物信息学分析
使用MEGA X软件，通过最大似然法（maximum likelihood, ML）构建基于茄子SmACS与拟南芥、番茄和烟草等10个物种同源蛋白的系统进化树；利用Jalview软件对10个物种同源蛋白多重序列进行比对分析；使用在线工具MEME（
1.2 茄子SmACS基因响应逆境胁迫时的表达特性分析
以温室（27 ℃条件下光照处理16 h/19 ℃条件下黑暗处理8 h）中盆栽生长60 d左右且大小一致的三月茄为实验材料，分别对其进行低温（4 ℃）、高温（40 ℃）、干旱和盐（200 mmol/L NaCl）胁迫处理，以未进行任何胁迫处理的叶片组织为对照组。在低温和高温胁迫组分别处理1、3、6、12和24 h，干旱胁迫组处理3、6和12 h，盐胁迫组处理6 h后，摘取各处理叶片，迅速用液氮冷冻，之后置于－80 ℃冰箱中保存，备用。参照植物RNA提取试剂盒（HiPure HP Plant RNA Kit）说明书，提取经低温、高温、干旱和盐胁迫处理不同时间后的三月茄叶片RNA；利用莫纳生物反转录酶试剂盒（MonScriptTM RTⅢ All-in-One Mix with dsDNase）反转录不同处理样品的RNA，得到cDNA；将反转录得到的cDNA稀释一定倍数，作为qRT-PCR的模板。以腺嘌呤磷酸核糖转移酶（adenine phosphoribosyl transferase, APRT）为内参基因并设计其引物；以SmACS-F、SmACS-R引物来检测SmACS基因在不同逆境胁迫下的表达水平。引物序列见表1，委托北京擎科生物科技有限公司合成。在罗氏Cobaz480实时荧光定量PCR仪上进行qRT-PCR试验，每个样品设置3个生物学重复，采用2－△△CT法进行相对表达量的分析。
表1 引物序列
Table 1
基因名称 Gene name | 引物序列（5´→3´） Primer sequence (5´→3´) |
|---|---|
| SmACS | F: TGTCTTCTCCTATGGTCCAAGC |
| R: TGGATGTATCCATGAACGCCT | |
| APRT | F: GAGATGCATGTAGGTGCTGTGCAA |
| R: GGCCCTTCAATTCTGGCAACTCAA |
2 结果与分析
2.1 茄子SmACS蛋白的同源性比对与分析
基于本课题组前期得到的茄子高通量转录组数据，筛选到1个低温胁迫后显著差异表达的基因SmACS。根据该基因编码的蛋白质序列，利用NCBI数据库的Blast搜索功能，发现该蛋白与1-氨基环丙烷-1-羧酸合成酶（ACC）的同源性最高。同时，筛选出20个与该蛋白同源性较高物种的蛋白质序列，运用MEGA X软件的最大似然法构建系统发育进化树。结果表明，SmACS蛋白与大豆的相似性最高，为69.98%；与同属茄科的番茄ACS的同源性为69.65%；与拟南芥、烟草和番茄等10个物种的相似性均在52%以上（图1），说明该基因在生物进化过程中相对保守。进一步对SmACS蛋白进行多重比对发现，11个物种的ACS同工酶均含有7个保守结构域，并含有转氨酶中保守的氨基酸，且含有与底物特异性有关的保守谷氨酸残基（图2）。这说明茄子SmACS蛋白具有高度保守的结构域和转氨酶位点。
图1
图1
茄子SmACS蛋白的氨基酸序列与其他物种同源序列的系统发育进化树
Fig. 1
Phylogenetic tree of the amino acid sequence of SmACS protein from eggplant and homologous sequences from other species
图2
图2
茄子SmACS蛋白与其他物种ACS蛋白序列多重比对结果
红色箭头指示转氨酶中保守的氨基酸，紫色圆点指示保守谷氨酸残基与底物特异性有关，红色框表示ACS同工酶的7个保守结构域（Box1～Box7）。
Fig. 2
Results of multiple alignment among SmACS protein from eggplant and ACS proteins from other species
Red arrows indicate the conserved amino acids in transaminase; the conserved glutamate residues marked by the purple dots are related to the substrate specificity; and the seven conserved domains of the ACS isozyme are marked by the red boxes (Box1-Box7).
2.2 茄子SmACS蛋白的保守基序（motif）及其基因结构分析
图3
图3
茄子SmACS蛋白的保守基序分析
Fig. 3
Conserved motif analysis of SmACS protein from eggplant
图4
2.3 茄子SmACS蛋白的理化性质分析
利用在线工具ProtParam分析茄子SmACS蛋白的理化性质。结果表明：SmACS蛋白主要由478个氨基酸组成，具体包括亮氨酸（leucine, Leu）43个，丝氨酸（serine, Ser）和缬氨酸（valine, Val）各33个，苯丙氨酸（phenylalanine, Phe）32个，天冬氨酸（aspartic acid, Asp）和赖氨酸（lysine, Lys）各31个，丙氨酸（alanine, Ala）30个，甘氨酸（glycine, Gly）和异亮氨酸（isoleucine, Ile）各29个，天冬酰胺（asparagine, Asn）和谷氨酸（glutamic acid, Glu）各28个，精氨酸（arginine, Arg）25个，苏氨酸（threonine, Thr）22个，脯氨酸（proline, Pro）19个，谷氨酰胺（glutamine, Gln）和甲硫氨酸（methionine, Met）各14个，组氨酸（histidine, His）12个，半胱氨酸（cysteine, Cys）10个，酪氨酸（tyrosine, Tyr）9个和色氨酸（tryptophane, Trp）6个。其中，亮氨酸（Leu）的含量占比最大（9%），丝氨酸（Ser）和缬氨酸（Val）的含量占比次之（各占6.9%），色氨酸（Trp）的含量占比最小（仅为1.3%）。茄子SmACS蛋白的分子质量为54.03 kDa，等电点为6.48，带负电荷的Asp和Glu残基总数为59，带正电荷的Arg和Lys残基总数为56；茄子SmACS蛋白的不稳定系数为41.39，表明该蛋白为不稳定蛋白；脂肪指数为85.04，亲水系数为 －0.206，表明该蛋白为亲水性蛋白。进一步分析发现，该蛋白无信号肽，属非分泌性蛋白，且不含跨膜结构，表明其不属于膜蛋白。亚细胞定位预测结果表明，该蛋白主要定位于细胞质中。
2.4 茄子SmACS蛋白二级和三级结构分析
蛋白质的二级结构主要是指蛋白质的多肽链中有规则重复的构象。通过在线SOPMA软件预测茄子SmACS蛋白的二级结构，如图5所示：茄子SmACS蛋白二级结构含有α-螺旋、β-转角、无规则卷曲和延伸链；其中，213个氨基酸构成α-螺旋，所占比例最大（44.56%），158个氨基酸构成无规则卷曲，占33.05%，70个氨基酸构成延伸链，所占比例为14.64%，而37个氨基酸构成β-转角，占7.74%。由此可见，茄子SmACS蛋白的主要构成元件为α-螺旋，其功能主要为连接其他二级结构元件，而无规则卷曲为次要构成元件。
图5
图5
茄子SmACS蛋白二级结构的预测结果
A. SmACS蛋白二级结构柱状图；B. SmACS蛋白二级结构线型变化曲线图。蓝色：α-螺旋；红色：延伸链；绿色：β-转角；紫色：无规则卷曲。
Fig. 5
Predicted results of secondary structure of SmACS protein from eggplant
A. Histogram of secondary structure of SmACS protein; B. Linear change curve of SmACS protein. Blue: α-helix; Red: Extended chain; Green: β-turn; Purple: Random curl.
蛋白质三级结构的形成使肽链中所有的原子都达到空间上的重新排布，它是建立在二级结构、超二级结构和结构域上的球状蛋白质的高级空间结构。SmACS基因编码的蛋白质三级结构同源建模的参考模板为1iay.1.A，提交的SmACS基因编码的蛋白序列与模板覆盖率为88%，序列一致性为73.87%，推测SmACS编码的蛋白质可能具备与参考模板相同的催化活性。通过Swiss-Model在线程序同源建模，预测SmACS蛋白的三级结构。结果显示，茄子SmACS蛋白的三级结构主要由α-螺旋和无规则卷曲构成（图6），这与二级结构的预测结果一致。
图6
图6
茄子SmACS蛋白三级结构的预测结果
Fig. 6
Predicted result of tertiary structure of SmACS protein from eggplant
2.5 茄子SmACS蛋白的结构域与磷酸化位点分析
图7
图8
图8
茄子SmACS蛋白的磷酸化位点
Fig. 8
Phosphorylation sites of SmACS protein from eggplant
2.6 茄子SmACS蛋白的互作网络分析
由于茄子未被收集在STRING蛋白互作数据库中，通过在线工具STRING将茄子SmACS蛋白与同属茄科作物番茄的ACS1A蛋白进行比对，利用其蛋白互作关系构建互作网络。如图9所示：ACS1A蛋白与4个ACC氧化酶（100125909、ACO1、ACO2和aco5）、1个S-腺苷甲硫氨酸合酶（101245012）、2个S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶（101260400和101262142）、2个抗坏血酸依赖性氧化还原酶（101266529和543506）和1个未被注释到的蛋白（101265343）互作。推测茄子SmACS蛋白主要与ACC氧化酶、S-腺苷甲硫氨酸合酶、S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶和抗坏血酸依赖性氧化还原酶发生相互作用。
图9
2.7 茄子SmACS基因的顺式作用元件分析
利用在线工具PlantCARE对SmACS基因起始密码子上游2 000 bp的序列进行顺式作用元件分析。结果表明：SmACS基因包含TATA框（TATA-box）和CACA框（CACA-box）顺式作用元件，表明SmACS基因能正常进行转录，且SmACS基因启动子区含有脱落酸、乙烯、冷胁迫、水杨酸及伤口响应等有关的元件，其中乙烯响应元件最多，脱落酸和冷胁迫涉及的顺式作用元件相对较多（表2）。表明茄子SmACS基因可能主要参与果实发育、低温胁迫和脱落酸响应的信号转导过程。
表2 SmACS基因启动子区域主要顺式作用元件
Table 2
位点名称 Site name | 数量 Number | 功能 Function |
|---|---|---|
| ABRE | 1 | 脱落酸响应顺式作用元件 Cis-acting element involved in the abscisic acid response |
| circadian | 1 | 光周期响应有关的顺式作用元件 Cis-acting element related to photoperiod response |
| ERE | 8 | 乙烯响应元件 Ethylene-responsive element |
| MRE | 1 | MYB光反应结合位点 MYB photoreactive binding site |
| MYC | 5 | 脱落酸响应和冷胁迫中涉及的顺式作用元件 Cis-acting elements involved in abscisic acid response and cold stress |
| O2-site | 2 | 玉米醇溶蛋白代谢有关的顺式作用元件 Cis-acting elements related to zein metabolism |
| TCA | 1 | 水杨酸响应顺式作用元件 Cis-acting element involved in salicylic acid response |
| WUN-motif | 1 | 伤口响应元件 Wound-responsive element |
2.8 茄子SmACS基因响应非生物胁迫的表达分析
为了进一步明确茄子SmACS基因的潜在功能，我们通过qRT-PCR分析其在非生物胁迫处理后的表达情况。在4 ℃条件下处理不同时间时，SmACS基因受诱导表达，尤以4 ℃条件下处理12 h时，其表达量上调幅度最大，约为对照（0 h）的281.8倍（图10A）。在高温（40 ℃）胁迫下，SmACS基因表达量呈先上升后降低的趋势，其中，在1和3 h时表达量分别为对照（0 h）的7.5倍和4.6倍，而在6、12和24 h时，其表达受到抑制（图10B）。在干旱胁迫下时，SmACS基因的表达量在3 h时上调幅度最大，约为对照（0 h）的32.2倍；在6 h时，其表达量约为对照组的1.3倍；而处理12 h时，其表达受到抑制（图10C）。受盐（NaCl）胁迫6 h时，SmACS基因的表达上调，而该基因受NaCl胁迫后在不同时间的表达情况还有待于进一步的试验分析（图10D）。由以上结果可知，SmACS基因可受低温、高温、干旱和盐胁迫的诱导而表达，其中低温（4 ℃）处理对SmACS基因表达的上调作用最为显著。
图10
图10
茄子SmACS基因响应逆境胁迫的表达分析
Fig. 10
Expression analysis of SmACS gene from eggplant in response to adversity stresses
3 讨论
ACC合成酶（ACS）是植物内源乙烯合成途径中的限速酶和关键酶，由多基因家族编码。目前，在拟南芥、番茄、水稻和枇杷等作物中均有关于ACS基因的研究报道，而在茄子中至今未有相关的ACS基因的研究报道。本研究中，对推测的茄子SmACS基因编码的氨基酸序列在NCBI数据库中进行Blastp比对，发现SmACS蛋白与其他物种的ACS蛋白同源性很高，其中与大豆的同源性最高（69.98%），与同属茄科的番茄ACS的同源性为69.65%，略低于大豆的，可能是由于ACC合成酶是由多基因家族编码，而SmACS氨基酸序列与番茄的ACS氨基酸序列差异较大，导致2个物种的同源性较低，这与吴建阳等[20]对荔枝的研究结果类似。进一步的同源比对分析显示，SmACS编码的氨基酸序列比较保守，含有7个保守结构域、11个转氨酶中保守的氨基酸以及与底物特异性有关的保守谷氨酸残基，这与荔枝ACS1基因的研究结果[20]一致。
对启动子元件的分析发现，茄子SmACS基因主要含有乙烯、脱落酸和冷胁迫相关的顺式作用元件。ACS基因可受脱落酸、乙烯、细胞分裂素和赤霉素等激素的诱导而表达，如乙烯能够诱导甘蔗基因Sc2ACS1、Sc2ACS2、Sc2ACS3的上调表达，并且甘蔗基因Sc2ACS1还可受冷胁迫的诱导而上调表达[23]。推测茄子SmACS基因可能在果实发育、冷胁迫和脱落酸响应中具有重要的调控作用。qRT-PCR结果证实，茄子SmACS基因可受不同逆境胁迫诱导而表达，其中低温胁迫时诱导表达上调最显著。而有关SmACS基因在果实发育和脱落酸处理时的表达情况还有待进一步研究分析。
4 结论
研究发现，茄子ACC合成酶基因SmACS位于第8号染色体上，基因全长3 550 bp，编码序列长 1 437 bp，含有3个内含子和4个外显子，属典型的ACS基因结构。其编码的蛋白质由478个氨基酸组成，是一种定位于细胞质的不稳定的非分泌型亲水蛋白，主要构成元件为α-螺旋和无规则卷曲，具有保守的Aminotran_1_2结构域，含有39个磷酸化位点，其中以丝氨酸和苏氨酸为主。茄子ACC合成酶与ACC氧化酶、S-腺苷甲硫氨酸合酶、S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶和抗坏血酸依赖性氧化还原酶发生相互作用。该基因启动子中含有与乙烯、脱落酸和非生物胁迫等有关的顺式作用元件；qRT-PCR结果表明，SmACS基因可受非生物胁迫（低温、高温、干旱和盐）诱导而表达，其中低温处理时诱导表达上调最显著，但有关SmACS基因在乙烯和脱落酸处理时的表达情况还有待进一步研究分析。
参考文献
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1-甲基环丙烯处理对红富士苹果贮藏品质的影响
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Identification of a novel multiple environmental factor-responsive 1-aminocyclo-propane-1-carboxylate synthase gene, NT-ACS2, from tobacco
The GUS reporter-aided analysis of the promoter activities of Arabidopsis ACC synthase genes AtACS4, AtACS5, and AtACS7 induced by hormones and stresses
高等植物ACS基因家族及其功能研究进展
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A review of ACS gene family and its function in higher plant
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高等植物ACC合成酶基因研究进展
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Review on researching advance in ACC synthase genes in higher plants
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Cloning and bioinformatics analysis of two ACS genes from embryonic cultures in Eriobotrya japonica
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Molecular cloning of four members of ACC synthase gene family from kiwifruit (Actinidia chinensis Planch
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Genomic organization of a diverse ACC synthase gene family in banana and expression characteristics of the gene member involved in ripening of banana fruits
西瓜1-氨基环丙烷-1-羧酸合成酶基因及启动子的克隆与分析
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Cloning and analysis of 1-aminocyclopropane-1-carboxylate synthase gene and promoter in watermelon
葡萄1-氨基环丙烷-1-羧酸合酶基因的克隆和表达分析
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Hybrid ‘Sinta’ papaya exhibits unique ACC synthase 1 cDNA isoforms
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Differential regulation of four members of the ACC synthase gene family in plum
甘蔗乙烯合成酶基因家族三个成员的克隆与序列分析
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环境胁迫和激素诱导甘蔗ACC合成酶基因家族三个成员的表达
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Expression of three members of ACC synthase gene family in sugarcane induced by hormones and environmental stress
甘蔗ACC氧化酶基因片段的克隆与序列分析
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Cloning and sequencing of ACC oxidase gene from sugarcane
茶树ACC合成酶基因全长cDNA的克隆及其生物信息学分析
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Full-length cDNA cloning and bioinformatic analysis of ACC synthase gene from the tea plant (Camellia sinensis)
树莓1-氨基环丙烷-1-羧酸合酶基因(RiACS)家族成员的克隆及生物信息学分析
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Cloning and bioinformatics analysis of members of the raspberry 1-aminocyclopropane-1-carboxylate synthase gene (RiACS) family
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TBtools-an integrative toolkit developed for interactive analyses of big biological data
牡丹ACS基因克隆及序列分析
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