浙江大学学报(农业与生命科学版), 2021, 47(3): 284-294 doi: 10.3785/j.issn.1008-9209.2020.08.051

综述

甲壳动物过氧化物还原酶基因的研究进展

李辉,,1,2, 冯伟2,3, 于俊杰2,3, 张明胤2,3, 周春妙2,3, 唐永凯,,1,2,3

1.水产科学国家级实验教学示范中心(上海海洋大学),上海 201306

2.中国水产科学研究院淡水渔业研究中心,农业农村部淡水渔业与种质资源利用重点实验室,江苏 无锡 214081

3.南京农业大学无锡渔业学院,江苏 无锡 214128

Research progress of peroxiredoxingene in crustaceans

LI Hui,,1,2, FENG Wei2,3, YU Junjie2,3, ZHANG Mingyin2,3, ZHOU Chunmiao2,3, TANG Yongkai,,1,2,3

1.National Demonstration Center for Experimental Fisheries Science Education (Shanghai Ocean University), Shanghai 201306, China

2.Ministry of Agriculture and Rural Affairs Key Laboratory of Freshwater Aquatic Germplasm Resources, Freshwater Fisheries Research Center, Chinese Academy of Fishery Sciences, Wuxi 214081, Jiangsu, China

3.Wuxi Fisheries College, Nanjing Agricultural University, Wuxi 214128, Jiangsu, China

通讯作者: 唐永凯(https://orcid.org/0000-0002-5643-2844),E-mail:tangyk@ffrc.cn

收稿日期: 2020-08-05   接受日期: 2020-10-16   网络出版日期: 2021-07-05

基金资助: 江苏省农业重大新品种创制项目.  PZCZ201749
江苏省现代农业产业技术体系.  JATS〔2019〕385
江苏省渔业科技类项目.  D2018-4

Received: 2020-08-05   Accepted: 2020-10-16   Online: 2021-07-05

作者简介 About authors

李辉(https://orcid.org/0000-0003-2207-9090),E-mail:1147067174@qq.com , E-mail:1147067174@qq.com

摘要

过氧化物还原酶(peroxiredoxin, Prx)属于抗氧化蛋白超家族,广泛存在于真核生物和原核生物中,在先天免疫中发挥着重要作用。目前,有关甲壳动物Prx基因及其在先天免疫中的作用研究较少且不够深入,仅克隆出部分甲壳动物Prx基因的部分亚型,在生物学功能方面仅仅研究了其抗氧化作用。本文综述了近年来甲壳动物Prx基因的克隆、系统进化、组织表达以及生物学功能,对Prx基因在甲壳动物中的研究前景作出展望,以期为甲壳动物Prx基因结构和生物学功能研究提供参考。

关键词: 甲壳动物 ; 过氧化物还原酶 ; 基因克隆 ; 组织表达 ; 生物学功能

Abstract

Peroxiredoxin (Prx) belongs to the superfamily of antioxidant proteins, which widely exists in eukaryotes and prokaryotes, and plays an important role in innate immunity. At present, there are a few researches on the Prx genes in crustaceans, and only partial subtypes of the Prx genes are cloned, and the antioxidant effect is studied only in terms of biological function. In this study, the cloning, phylogeny, tissue expression and biological functions of crustacean Prx genes in recent years were reviewed. Furthermore, researches on Prx genes in crustaceans were prospected, which would provide references for the researches on the structures and biological functions of Prx genes in crustaceans.

Keywords: crustacean ; peroxiredoxin ; gene cloning ; tissue expression ; biological function

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本文引用格式

李辉, 冯伟, 于俊杰, 张明胤, 周春妙, 唐永凯. 甲壳动物过氧化物还原酶基因的研究进展. 浙江大学学报(农业与生命科学版)[J]. 2021, 47(3): 284-294 doi:10.3785/j.issn.1008-9209.2020.08.051

LI Hui, FENG Wei, YU Junjie, ZHANG Mingyin, ZHOU Chunmiao, TANG Yongkai. Research progress of peroxiredoxingene in crustaceans. Journal of Zhejiang University(Agriculture & Life Sciences)[J]. 2021, 47(3): 284-294 doi:10.3785/j.issn.1008-9209.2020.08.051

生物代谢在有氧条件下会产生一种副产 物——活性氧(reactive oxygen species, ROS),其主要包括过氧化氢(H2O2)、超氧阴离子自由基(·O2)、羟基自由基(·OH)、臭氧(O3)和一氧化氮(NO)等[1-2]。低浓度的活性氧可促进细胞有丝分裂、增殖和分化,参与细胞内信号转导过程,并进一步调节多种生物学活动,如宿主防御、抑制细菌和病毒产生等。高浓度活性氧会破坏生物膜、核酸和蛋白质等,从而引起细胞凋亡和损伤[3-7]。当ROS的产生超出其清除能力时,就会出现所谓的“氧化应激状态”[8]。生物在进化过程中,逐渐形成各种高效和准确的抗氧化系统,以此来抵御高浓度ROS造成的损伤,主要包括过氧化氢酶(catalase, CAT)、硫氧还原蛋白(thioredoxin, TRX)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)和过氧化物还原酶(peroxiredoxin, Prx)等[9]。在正常生理状态下,ROS和抗氧化酶呈现出一种动态平衡状态。在无脊椎动物中,氧化还原平衡是疾病与生理学变化相互作用的结果,是先天性免疫不可缺少的部分[10]。外界生物和非生物胁迫诱导体内产生并积累大量的ROS,氧化还原平衡就会被打破,这些抗氧化酶的表达量会增加以抵御ROS带来的危害[11]

过氧化物还原酶(Prx)属于进化保守的抗氧化分子家族,在清除过氧化物、传导信号等方面发挥着重要作用,一直受到研究者的关注。近年来,Prx基因在细菌、真菌、哺乳动物、植物中相继被发现,同时,在甲壳动物中也逐渐被发现。为丰富甲壳动物Prx基因的研究数据,深入了解Prx基因在甲壳动物中的免疫防御机制,本文就近年来Prx基因在甲壳动物中的研究进行了综述,旨在为以后更好地研究甲壳动物Prx基因的生物学功能提供参考。

1 Prx概述

Prx属于抗氧化蛋白超家族,通过硫氧还蛋白作为氢供体来消除氢过氧化物,有效调节体内ROS水平,起到抗氧化作用[12-13]。在酿酒酵母中首次发现了Prx蛋白,分子质量约为25 kDa。后续研究发现,该蛋白广泛存在于动植物中,如小麦(Triticum aestivum L.[14]、发状念珠藻(Nostoc flagelliforme[15]、七鳃鳗(Lampetra japonicum[16]、小鼠(Mus musculus[17]、褶纹冠蚌(Cristaria plicata[18]等。Prx主要定位在细胞质和线粒体中,同时,细胞质和线粒体也是细胞中ROS的主要产生部位,因此,Prx被认为在防止ROS引起的氧化损伤中起重要作用[19-20]

在哺乳动物中,相关研究已经鉴定了6种不同的Prx亚型,包括Prx1、Prx2、Prx3、Prx4、Prx5和Prx6[13]。根据在清除ROS反应中起催化作用的半胱氨酸(cysteine, Cys)残基的数目和位置,Prx可分为3个亚家族:典型2-Cys Prx、非典型2-Cys Prx和 1-Cys Prx[21]。Prx1~Prx4属于典型2-Cys Prx亚家族,且这4个亚型的N端和C端各含有1个保守的半胱氨酸(Cys)残基。Prx5的N端和C端也各含有1个保守的Cys残基,但是C端的Cys残基保守性较低,属于非典型2-Cys Prx亚家族;Prx6属于1-Cys Prx亚家族,其仅在N端含有1个保守的Cys残基[22]。通过比对这6个成员的同源性发现,Prx1~Prx4之间具有较高的同源性,Prx6与Prx1~Prx4之间的同源性为40%,而Prx5和Prx1~Prx4的同源性仅为10%[23]

植物中的Prx可分为4类:1-Cys Prx、2-Cys Prx、PrxⅡ和PrxQ。PrxⅡ类成员较多,包含PrxⅡA、PrxⅡB、PrxⅡC、PrxⅡD、PrxⅡE和PrxⅡF[24]。其中,植物中只有1-Cys Prx包含1个保守的Cys残基,其他类别均包含2个保守的Cys残基。这些Prx大多可以在哺乳动物中被发现,但PrxQ只存在于低等真核生物和细菌中。同时,根据序列同源性和结构相似性,Prx又可分为6个亚家族(表1)。

表1   基于序列同源性和结构相似性的Prx分类

Table 1  Prx classification based on sequence homology and structural similarity

分类

Classification

代表性物种

Representative species

分布

Distribution

AhpC/Prx1

哺乳动物Prx1~Prx4;甲壳动物Prx1/2、Prx3、Prx4;鼠伤寒沙门

菌AhpC

古细菌、细菌、植物、单细胞和多细胞真核生物
Prx5哺乳动物Prx5、甲壳动物Prx5细菌、真核生物
Prx6哺乳动物Prx6、甲壳动物Prx6古细菌、细菌、植物、单细胞和多细胞真核生物
BCP/PrxQ植物PrxQ细菌、植物
Tpx大肠埃希菌Tpx细菌
AhpE结核分枝杆菌AhpE细菌

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大多数Prx都是膜内蛋白酶,只有Prx4可以依靠其典型的N端分泌性信号肽分泌至细胞膜外来发挥功能。哺乳动物的Prxl、Prx2和Prx6主要定位于细胞质中[24-25],Prx3定位于线粒体上,Prx4定位于内质网和细胞外间隙中[26],Prx5定位于过氧化物酶体中[27-28]。Prx家族位置的分布同时也决定了其特定的功能。

1.1 典型2-Cys Prx

典型2-Cys Prx为Prx家族中最大的一类,在肽链N端和C端Cys残基周围的序列都具有高度的保守性[29],其N端的保守序列是“FYPLDFTFVCPTE”,C端的保守序列是“GEVCPA”。在发挥抗氧化作用的过程中,首先,典型2-Cys Prx的N端Cys残基被氧化成次磺酸基团(Cys-SOH)[30],然后,该基团与另一个C端Cys残基发生反应,通过二硫键形成首尾连接的同源二聚体[31],最后,形成的二硫键被硫氧还蛋白还原,典型2-Cys Prx重新恢复活性。

1.2 非典型2-Cys Prx

作为Prx家族最后被发现和研究的一个亚型,Prx5肽链N端和C端的Cys残基周围也具有保守序列,其中N端的保守序列是“VPGAFTPGCSKTHLPG”,C端的保守序列是“DGTGLTCSL”。非典型2-Cys Prx的反应机制与典型2-Cys Prx具有相似之处,其N端保守的Cys残基也被氧化成次磺酸基团(Cys-SOH),不同的是,生成的次磺酸基团(Cys-SOH)将会与自身C端的Cys残基形成分子内二硫键[32]

1.3 1-Cys Prx

Prx6的N端保守序列为“PVCTTE”,其初始部分的反应机制与典型2-Cys Prx和非典型2-Cys Prx相同,都是N端保守的Cys残基被氧化成次磺酸基团(Cys-SOH),不同之处在于,由于附近没有可以参与反应的Cys残基,故无法形成二硫键。因此,需要依赖其他(非硫氧还蛋白)作为氢供体将次磺酸还原为初始状态。有报道还发现,在π型谷胱甘肽S-转移酶(π glutathione S-transferase, πGST)的介导下,Prx6与谷胱甘肽(glutathione, GSH)形成二硫键,并重新恢复活性[33]

2 甲壳动物的Prx基因

在甲壳动物中,TU等[34]首次系统化地对拟穴青蟹(Scylla paramamosainPrx基因进行了分析。与哺乳动物略有不同的是,甲壳动物Prx亚型分为Prx1/2、Prx3、Prx4、Prx5和Prx6。拟穴青蟹Prx1/2比对结果符合典型2-Cys Prx的结构特征,但在系统进化树中,却是和其他具有密切遗传关系的甲壳动物Prx先聚为一个新支后,再与Prx1~Prx4聚集。因此,伴随着这种情况的Prx基因被命名为Prx1/2,无脊椎动物中的Prx1/2基因被推测是Prx1Prx2的祖先基因,即未分化的Prx基因。卜瑞倩[35]在对斑节对虾(Penaeus monodon)的研究中发现了1个PmPrxn基因,多重序列比对分析显示,PmPrxn的保守性很低,与印度明对虾(Fenneropenaeusindicus)和三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)PmPrxn的同源性分别为45%和44%;且系统进化树显示,PmPrxn单独为一支,不与Prxl~Prx4聚集,属于典型2-Cys Prx。这表明PmPrxn是从Prx超家族中新发现的2-Cys Prx的成员。

2.1 甲壳动物Prx家族基因序列特征

目前,国内外的一些研究得到了多种甲壳动物Prx基因的全长序列,但许多研究只发现了Prx基因中的一种或几种亚型。表2显示了NCBI数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中甲壳动物Prx基因的开放阅读框及其编码的氨基酸长度。从中可知,大部分的甲壳动物都只是研究了Prx基因,即未分化的基因,而对于其他亚型的研究较少。同时还发现,不同甲壳动物各自Prx、Prx4Prx6基因的开放阅读框及其编码的氨基酸长度相同,而各自Prx3Prx5基因的开放阅读框及其编码的氨基酸长度略有不同。其中:拟穴青蟹Prx3基因的开放阅读框最长,为690 bp,中华绒螯蟹和日本对虾Prx3基因的开放阅读框长度相同,为681 bp;脊尾白虾Prx5基因的开放阅读框最长,为585 bp,而斑节对虾与中华绒螯蟹的分别为570和552 bp。

表2   甲壳动物Prx基因及其编码的氨基酸序列

Table 2  Prx genes and their coding amino acid sequences of crustacean

物种

Species

Prx亚型

Prx subtype

基因登录号

Accession No.

开放阅读框长度

Open reading frame length/bp

编码的氨基酸数目

Encoded amino acid number

脊尾白虾 Exopalaemon carinicaudaPrx5AGJ03548585194
中国对虾 Fenneropenaeus chinensisPrxABB05538594198
日本沼虾 Macrobrachium nipponensePrxAHJ80827594198
三疣梭子蟹 Portunus trituberculatusPrxACI46625597198
斑节对虾 Penaeus monodonPrx1AQW41372594198
Prx4ABZ80828738245
Prx5AQW41374570189
PrxnAQW41376636211
中华绒螯蟹 Eriocheir sinensisPrxQIX12309597198
Prx3QIX12308681226
Prx4QIX12307738245
Prx5QIX12306552183
Prx6ACF35639660219
日本对虾 Penaeus japonicusPrxBAF91446597198
Prx3QBC73602681227
Prx4AGV39321738245
Prx6ANH11475660219
印度明对虾 Fenneropenaeus indicusPrxACS91344597198
平背泥蟹 Eurypanopeus depressusPrxACD68589594198
南美白对虾 Penaeus vannameiPrxACX53642597198
Prx4AET36895738245
拟穴青蟹 Scylla paramamosainPrx1/2ASS34529597198
Prx3ASS34530690229
Prx4ASS34531738245
Prx5-1ASS34533561186
Prx5-2ASS34534429142
Prx6ASS34532660219
中华卤虫 Artemia sinicaPrxACF37206594197
美国大盐湖卤虫 Artemia franciscanaPrxABY62745594197

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2.2 甲壳动物Prx的生物学分析

通过在线软件ExPASy(http://www.expasy.org/proteomics)对表2中甲壳动物Prx家族的氨基酸序列进行生物学分析,结果发现,甲壳动物Prx家族蛋白质在进化过程中较为或者高度保守。在亲疏水性方面,Prx、Prx4和Prx6都是亲水性蛋白;日本对虾的Prx3和中华绒螯蟹的Prx5是亲水性蛋白,其余甲壳动物的Prx3和Prx5都是疏水性蛋白。信号肽预测结果显示,只有Prx4含有信号肽,其他均无信号肽,该结果与在哺乳动物中发现的一致。跨膜结构分析表明,只有Prx4具跨膜结构域,其余均无。此外,亚细胞定位分析结果(表3)表明,Prx和Prx6定位在细胞质中的概率较大,Prx3定位于线粒体上,Prx4有较大概率定位于线粒体中,Prx5定位于过氧化物酶体上。以上所述的这些结果与章波等[13]的研究结果一致。

表3   亚细胞定位分析

Table 3  Subcellular localization analysis

物种

Species

Prx亚型

Prx subtype

亚细胞定位

Subcellular localization

脊尾白虾

Exopalaemon carinicauda

Prx5过氧化物酶体(55.6%)、细胞核(22.2%)、细胞质(11.1%)、线粒体(11.1%)

中国对虾

Fenneropenaeus chinensis

Prx细胞质(60.9%)、细胞核(21.7%)、线粒体(13.0%)、分泌系统囊泡(4.4%)

日本沼虾

Macrobrachium nipponense

Prx细胞质(47.8%)、线粒体(26.1%)、细胞核(21.7%)、分泌系统囊泡(4.4%)

三疣梭子蟹

Portunus trituberculatus

Prx

细胞质(52.4%)、线粒体(21.7%)、细胞核(13.0%)、过氧化物酶体(4.3%)、

内质网(4.3%)、质膜(4.3%)

斑节对虾

Penaeus monodon

Prx1细胞质(47.9%)、细胞核(30.4%)、线粒体(21.7%)
Prx4

线粒体(39.2%)、细胞质(17.4%)、内质网(17.4%)、细胞核(13.0%)、

空泡(8.7%)、细胞外(4.3%)

Prx5线粒体(73.9%)、细胞核(17.4%)、细胞质(8.7%)
Prxn细胞质(47.8%)、细胞核(30.4%)、线粒体(17.4%)、高尔基体(4.4%)

中华绒螯蟹

Eriocheir sinensis

Prx细胞质(52.3%)、线粒体(26.1%)、细胞核(13.0%)、细胞外(4.3%)、空泡(4.3%)
Prx3线粒体(91.4%)、细胞质(4.3%)、细胞核(4.3%)
Prx4

线粒体(43.8%)、细胞外(13.0%)、内质网(13.0%)、细胞质(13.0%)、

过氧化物酶体(4.3%)、高尔基体(4.3%)、空泡(4.3%)、细胞核(4.3%)

Prx5过氧化物酶体(77.8%)、线粒体(11.1%)、细胞质(11.1%)
Prx6细胞质(61.3%)、细胞核(30.4%)、线粒体(4.3%)、高尔基体(4%)

日本对虾

Penaeus japonicus

Prx细胞质(47.8%)、线粒体(26.1%)、细胞核(21.7%)、分泌系统囊泡(4.4%)
Prx3线粒体(82.6%)、细胞核(8.7%)、细胞质(8.7%)
Prx4

线粒体(34.8%)、细胞质(30.6%)、细胞核(8.7%)、高尔基体(8.7%)、细胞外(4.3%)、

内质网(4.3%)、分泌系统囊泡(4.3%)、空泡(4.3%)

Prx6细胞质(56.6%)、细胞核(34.8%)、线粒体(4.3%)、高尔基体(4.3%)

印度明对虾

Fenneropenaeus indicus

Prx细胞质(47.9%)、细胞核(30.4%)、线粒体(21.7%)

平背泥蟹

Eurypanopeus depressus

Prx

细胞质(47.8%)、线粒体(26.3%)、细胞核(13.0%)、空泡(4.3%)、

内质网(4.3%)、细胞外(4.3%)

南美白对虾

Penaeus vannamei

Prx细胞质(43.5%)、细胞核(30.4%)、线粒体(26.1%)

拟穴青蟹

Scylla paramamosain

Prx1/2细胞质(52.2%)、细胞核(17.4%)、线粒体(17.4%)、过氧化物酶体(8.7%)、内质网(4.3%)
Prx3线粒体(87.0%)、细胞质(8.7%)、细胞核(4.3%)
Prx4

线粒体(34.8%)、内质网(17.5%)、细胞质(13.0%)、细胞核(13.0%)、细胞外(8.7%)、

高尔基体(8.7%)、空泡(4.3%)

Prx5-1过氧化物酶体(77.8%)、线粒体(11.1%)、细胞质(11.1%)
Prx5-2过氧化物酶体(77.8%)、线粒体(11.1%)、细胞质(11.1%)
Prx6细胞质(60.9%)、细胞核(30.5%)、高尔基体(4.3%)、线粒体(4.3%)

中华卤虫

Artemia sinica

Prx细胞质(43.6%)、线粒体(30.4%)、细胞核(21.7%)、分泌系统囊泡(4.3%)

美国大盐湖卤虫

Artemia franciscana

Prx细胞质(43.5%)、细胞核(30.4%)、线粒体(26.1%)

括号内百分比为定位到该部位的概率。

Percentages in parentheses refer to positioning probabilities.

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2.3 甲壳动物Prx系统进化分析

从NCBI中筛选出几种哺乳动物Prx亚型基因的氨基酸序列,分别为人(Homo sapiens)的Prx1(NP_001189360.1)、Prx2(NP_005800.3)、Prx3(AAI13724.1)、Prx4(NP_006397.1)、Prx5(AAI13724.1)和Prx6(NP_004896.1);家鼠(Mus musculus)的Prx2(NP_001304314.1)、Prx3(EDL01849.1)和Prx4(AAH19578.1);褐家鼠(Rattus norvegicus)的Prx1(AAH88118.1)、Prx2(AAH58481.1)、Prx3(EDL94585.1)、Prx4(AAH59122.1)和Prx6(NP_446028.1);牛(Bos taurus)的Prx1(NP_776856.1)和Prx5(AAG53661.1);原鸡(Gallus gallus)的Prx6(NP_001034418.1)。利用邻接法,对上述哺乳动物的Prx蛋白序列与表2中已知的部分甲壳动物Prx蛋白序列构建系统进化树(图1),分析发现:中华绒螯蟹Prx3与拟穴青蟹Prx3首先聚在一起,然后再与人Prx3、家鼠Prx3和褐家鼠Prx3聚为一支,甲壳动物Prx4、Prx5和Prx6亦是如此;中华绒螯蟹Prx4与拟穴青蟹Prx4先聚在一起,再与人Prx4、家鼠Prx4和褐家鼠Prx4聚为一支;中华绒螯蟹Prx5、拟穴青蟹Prx5和脊尾白虾Prx5先聚在一起,再与人Prx5和牛Prx5聚为一支;中华绒螯蟹Prx6和拟穴青蟹Prx6先聚在一起,再与原鸡Prx6、人Prx6和褐家鼠Prx6聚为一支;甲壳动物的Prx则不与哺乳动物的Prx1和Prx2聚在一起,而是形成了一个新的典型2-Cys Prx分支。这与TU等[34]的研究结果相同。

图1

图1   基于9种动物Prx基因蛋白序列构建的系统进化树

Fig. 1   Phylogenetic tree based on the protein sequences of Prx genes in nine animals


2.4 甲壳动物Prx在不同组织中的表达分析

Prx于不同组织中广泛表达,推测Prx可能介入细胞代谢的多种生理功能;然而,其在不同组织中的表达水平不同,这证明它们具有组织偏好性,通常在免疫、发育组织中的表达量相对较高。在体液免疫和基础代谢中,甲壳动物的肝胰腺发挥着重要的作用,在功能上与哺乳动物的肝脏和胰脏类似[36]。多数与免疫相关的基因在肝胰腺中都有较高的表达量[37]。卜瑞倩[35]发现,PmPrx1在斑节对虾鳃、肌肉、肠和脑中具有较高的表达水平,这意味着PmPrx1的表达具有组织偏好性。PmPrx5在肌肉中的表达量最高,其次是在胃、心脏和鳃中,这意味着PmPrx5在调节氧化还原平衡的过程中,可预防ROS过度积累对组织产生的氧化损伤。ZHANG等[38-39]研究发现,中国对虾Prx在卵巢、肠和肝胰腺中高表达,Prx4在性腺和肝胰腺中的表达量较高。中华绒螯蟹中EsPrxEsPrx3、EsPrx4EsPrx5在血细胞、心脏和肠道中的表达量都相对较低而在肝胰腺中表达量均最高[40]。中华绒螯蟹血细胞在细胞免疫中发挥着重要作用,然而上述4种EsPrx基因在血细胞中低表达,推测健康的中华绒螯蟹在没有受到刺激的情况下,体内免疫和ROS都处于相对平衡的状态。TU等[34]研究发现,拟穴青蟹6种SpPrxs基因的表达模式有明显差异:SpPrx3在肝胰腺、肌肉和心脏等能量消耗较高的器官中的表达量较高,说明SpPrx3可能与线粒体活性氧稳态紧密相关。SpPrx1/2在肝胰腺、鳃、肌肉和肠道中均有较高的表达量。SpPrx4在肝胰腺中高表达。SpPrx6在血细胞中高度表达,与中华绒螯蟹Prx6的表达水平相似[41],表明SpPrx6可能主要在血细胞中起作用。此外,SpPrx5-1在心脏、鳃、肝胰腺、肌肉和肠道中都有一定量的高表达,而SpPrx5-2在这些组织中的表达量极低。

综上所述,甲壳动物Prx1/2Prx2Prx3Prx4Prx5Prx6在组织中广泛表达且在肝胰腺中均具有较高的表达量,从侧面也印证了肝胰腺在甲壳动物中的重要免疫作用。

3 Prx的生物学功能

Prx家族蛋白在清除自由基与抗氧化活性方面发挥着至关重要的作用。在氧化应激状态下,Prx家族基因表达量显著上调,以清除细胞胁迫下产生的过多活性氧,保护机体免受活性氧损伤。同时,Prx也参与细胞信号转导。研究表明,过氧化氢(H2O2)作为细胞内的信号分子,使信号通路中的蛋白质活化或失活,可作为细胞内的二级信使。过氧化物还原酶可以调整体内H2O2浓度,因此,过氧化物还原酶可以间接地调节细胞内的信号传递[42-44]。过氧化物还原酶具有提高自然杀伤细胞活性的能力,并在机体免疫应答过程中发挥重要作用[45]。过氧化物还原酶Ⅰ型和Ⅱ型在哺乳动物中又被称为自然杀伤细胞增强因子A和B。Prx通过细胞表面受体介导细胞信号转导途径,减轻氧化应激引起的危害,可用于疾病的治疗。基于该家族过氧化物酶活性,Prx在肿瘤的治疗中可能具有遏制肿瘤细胞生长的功能[46-47]

3.1 细菌及病毒感染下甲壳动物Prx的生物学功能

谢亚凯[48]在日本囊对虾中发现,鳗弧菌感染引起的H2O2可以诱导MjPrx6的表达上调,MjPrx6通过发挥谷胱甘肽过氧化物酶活性调节对虾体内H2O2水平,维持对虾体内的氧化还原稳态,防止H2O2过度积累。在嗜水气单胞菌感染情况下,中华绒螯蟹中的EsPrxEsPrx3EsPrx4EsPrx5基因的表达量均显著上升,表明嗜水气单胞菌在中华绒螯蟹体内诱导产生大量ROS,这就需要大量的抗氧化酶来抵御ROS过度积累带来的危害。感染24 h后,EsPrx3EsPrx5的表达量分别提高了16倍和15倍,而EsPrxEsPrx4则分别提高了5倍和9倍[40]。现研究发现,细胞内约90%的ROS在生物氧化磷酸化过程中会返回到线粒体中[47]

ZHANG等[38]发现,中国对虾感染白斑综合征病毒(white spot syndrome virus, WSSV)后,FcPrx4在血细胞和肝胰腺中的表达量显著上调。体外制备融合蛋白并经活性分析,FcPrx4可在二硫苏糖醇存在下还原H2O2。DUAN等[23]对脊尾白虾进行人工感染鳗弧菌和WSSV,发现其血细胞和肝胰腺中的EcPrx5表达在早期上调,而后逐渐下降。这表明EcPrx5可能参与了对鳗弧菌和WSSV的暂时免疫应答,同时,在受到鳗弧菌和WSSV攻击后,EcPrx5在血细胞和肝胰脏中的表达谱有所不同,这可能是因为血细胞和肝胰脏的功能不同。母昌考[41]对中华绒螯蟹进行鳗弧菌刺激,发现在血细胞中EsPrx6的表达量在3~12 h内持续下降,刺激后12 h降至最低水平,显著低于对照组,24 h后又开始上升,表明EsPrx6参与了中华绒鳌蟹感染鳗弧菌的免疫应答过程。CHEN等[49]对三疣梭子蟹进行藻溶弧菌(Vibrio alginolyticus)感染,Prx的表达量在初期阶段稍有增加,而后Prx转录水平逐渐下降,并在12 h时下降到最低,仅为对照组的18%。表明Prx可能参与了三疣梭子蟹的细菌感染反应。

Prx4在过氧化物还原酶家族中是唯一具有分泌性信号肽功能的蛋白,首次发现Prx4作为损伤相关分子模式(damage-associated molecular patterns, DAMPs)发挥抗病毒作用。在日本囊对虾中发现,在受到WSSV感染后,Prx4的表达量明显上调,胞外Prx4的分泌增加。作为DAMPs的胞外MjPrx4通过激活转录因子Dorsal使相关抗病毒抗菌肽表达上调,从而抑制WSSV的增殖。这为甲壳动物由WSSV引起的疾病的预防和治疗提供了新的研究思路[50]

3.2 理化因子刺激下甲壳动物Prx的生物学功能

作为小型甲壳动物,中华卤虫在水产养殖中具有颇高的营养价值。周茜[51]研究了被硫酸铜刺激的中华卤虫幼体中Prx基因的表达变化,结果显示:在刺激6 h后,Prx的表达水平略有增加(P>0.05),而后逐渐减少,12 h时降至最低;刺激后12~24 h时,Prx的表达水平急剧增加,24 h时达到峰值。说明硫酸铜刺激后并且随着时间的增加,大量的活性氧在体内产生,诱导Prx基因的表达上调,以清除过多活性氧,防止对正常细胞造成损伤。卜瑞倩[35]研究了斑节对虾在pH、盐度和重金属胁迫下过氧化物还原酶的表达模式,结果显示:PmPrx1在重金属铜刺激下,表达量呈逐渐下降的趋势,于48 h时降至最低,与对照组差异显著(P<0.05);在pH 7的海水处理下,PmPrx1的表达量逐渐升高,12 h时升至最高,与对照组差异显著(P<0.05),后逐渐下降并恢复至正常水平;在pH 9的海水处理下,仅在96 h时表达量极显著升高(P<0.01)。在高盐应激时,PmPrx1的表达量在8 h最高(P<0.01),而后逐渐降低;低盐应激时,在16 h表达量最高(P<0.01)。这些结果表明PmPrx1可能参与了非生物毒性应激。

综上所述,Prx在甲壳动物中的主要作用为清除自由基和抗氧化(表4),在氧化应激的情况下,Prx家族基因表达量明显增加,以清除氧化应激产生的过多活性氧。Prx基因的表达可作为确定环境对生物影响的重要指标,检测其表达变化已成为毒理学研究的重要方法[52]

表4   甲壳动物Prx的生物学功能研究汇总

Table 4  Summary of biological function research of crustacean Prx

物种

Species

基因

Gene

胁迫方式

Coercion mode

功能

Function

文献

Reference

日本囊对虾 Penaeus japonicusPrx6鳗弧菌清除自由基和抗氧化[48]
中华绒螯蟹 Eriocheir sinensisPrxPrx3Prx4Prx5嗜水气单胞菌[40]
中国对虾 Fenneropenaeus chinensisPrx4WSSV[38]
脊尾白虾 Exopalaemon carinicaudaPrx5鳗弧菌和WSSV[23]
中华绒螯蟹 Eriocheir sinensisPrx6鳗弧菌[41]
三疣梭子蟹 Portunus trituberculatusPrx藻溶弧菌[49]
日本囊对虾 Penaeus japonicusPrx4WSSV[50]
中华卤虫 Artemia sinicaPrx硫酸铜[51]
斑节对虾 Penaeus monodonPrx1Prx5PrxnpH、盐度和重金属[35]

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4 展望

Prx广泛存在于多种生物体中,在生物体对活性氧分子的防御中起着至关重要的作用。随着研究的深入,这个家族的生理生化功能已逐渐显现在人们面前。许多研究表明,Prx参与了多种生物学过程,包括氧化还原调节,细胞增殖、分化和凋亡等。目前,虽然在许多物种中发现了Prx,但在甲壳动物中,尤其是虾蟹Prx的研究仍处于初期阶段,还有许多物种的过氧化物还原酶基因尚未被发现,研究得还不够深入,未来还需要从以下2方面进行探索:一是克隆出更多的甲壳动物Prx基因亚型,同时,需要对甲壳动物中未分化的基因进行更深入的研究。二是探究Prx在甲壳动物生物和非生物胁迫中抗氧化能力的生物学功能,对其在氧化条件下的作用机制和其他功能进行深入研究。总之,通过研究甲壳动物过氧化物还原酶,可以加深人们对无脊椎动物免疫防御机制的了解,为进一步研究甲壳动物固有免疫作出贡献。

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