浙江大学学报(农业与生命科学版), 2020, 46(3): 263-270 doi: 10.3785/j.issn.1008-9209.2019.07.091

综述

瘤胃微生物多糖利用位点研究进展

高歌,,, 王佳堃,,

浙江大学动物科学学院奶业科学研究所,杭州 310058

Research advances in polysaccharide utilization loci of rumen microorganism

GAO Ge,,, WANG Jiakun,,

Institute of Dairy Science, College of Animal Sciences, Zhejiang University, Hangzhou 310058, China

通讯作者: 王佳堃(https://orcid.org/0000-0002-7213-3721),Tel:+86-571-88982389,E-mail:jiakunwang@zju.edu.cn王佳堃(https://orcid.org/0000-0002-7213-3721),Tel:+86-571-88982389,E-mail:jiakunwang@zju.edu.cn

收稿日期: 2019-07-09   接受日期: 2019-12-19   网络出版日期: 2020-07-16

基金资助: 国家重点研发计划重点专项子课题“农副产品利用与饲料资源开发技术集成与应用”.  2018YFD0501903

Received: 2019-07-09   Accepted: 2019-12-19   Online: 2020-07-16

作者简介 About authors

高歌(https://orcid.org/0000-0001-9659-5157),E-mail:gloria1942@163.com , E-mail:gloria1942@163.com

摘要

多糖利用位点(polysaccharide utilization loci, PULs)是一组编排特定多糖降解的基因簇,编码细胞表面多糖结合蛋白、外膜转运蛋白、碳水化合物活性酶和转录因子。通过多糖利用位点,拟杆菌可更好地协同多个蛋白的合作,实现对植物多糖识别、捕获和降解的一体化,具备高效利用多糖的能力。拟杆菌在瘤胃微生物中占比丰富,揭示瘤胃拟杆菌通过多糖利用位点降解纤维类物质的作用机制是改善瘤胃功能、挖掘高效酶的基础。本文主要对多糖利用位点的作用模式、调控机制及瘤胃微生物多糖利用位点的研究进展进行了综述,旨在为加强多糖利用位点的研究,并将其应用于微生物调控和生物能源开发提供理论依据。

关键词: 瘤胃 ; 微生物 ; 拟杆菌 ; 多糖 ; 多糖利用位点

Abstract

Polysaccharide utilization loci (PULs) are gene clusters that orchestrate the breakdown of a specific glycan, encode cell surface polysaccharide binding proteins, outer membrane transport proteins, carbohydrate-active enzymes (CAZymes) and transcription factors. Bacteroidetes are highly abundant in rumen and are considered as efficient degraders of polysaccharides, which can use PULs to arrange the detection, sequestration, digestion of complex carbohydrates. Effective improvement of the rumen function and excavation of high-performance enzymes by Bacteroidetes will be significantly informed by a holistic understanding of the mechanisms of PULs. This paper introduces the mode of action and regulatory mechanism of PULs, reviews the latest developments in rumen PULs research, and is aimed at providing the theoretical basis for the strengthening of PULs study and the application of PULs in microorganism modification and bioenergy development.

Keywords: rumen ; microorganism ; Bacteroidetes ; polysaccharide ; polysaccharide utilization loci

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本文引用格式

高歌, 王佳堃. 瘤胃微生物多糖利用位点研究进展. 浙江大学学报(农业与生命科学版)[J]. 2020, 46(3): 263-270 doi:10.3785/j.issn.1008-9209.2019.07.091

GAO Ge, WANG Jiakun. Research advances in polysaccharide utilization loci of rumen microorganism. Journal of Zhejiang University(Agriculture & Life Sciences)[J]. 2020, 46(3): 263-270 doi:10.3785/j.issn.1008-9209.2019.07.091

瘤胃微生物可有效降解纤维类物质,生成挥发性脂肪酸,为机体供能。拟杆菌是瘤胃中主要的纤维降解菌[1],含有丰富的多糖利用位点(polysaccharide utilization loci, PULs),能在不同碳源环境中生存。多糖利用位点是一组基因簇,编码与多糖代谢相关的蛋白质[2]。多糖利用位点作为拟杆菌在瘤胃中降解纤维类物质的重要分子特征,对其作用机制及分子特征的深入了解,是调控瘤胃微生物群落、优化瘤胃微生物功能的基础。纤维类物质的降解是制造生物塑料、生物产氢和生物燃料的前提,与其他厌氧发酵系统相比,瘤胃微生物发酵具有高效降解纤维的独特优势[3]。多糖利用位点是在自然选择下多酶协同、高效降解多糖物质的范例,例如半乳甘露聚糖多糖利用位点中的糖苷水解酶(glycoside hydrolases, GHs)第26家族和第36家族共同作用于半乳甘露聚糖时,半乳糖的生成速率是2个酶分别作用时的10倍和5倍[4]。过去关于高效纤维素酶的挖掘多集中于碳水化合物活性酶(carbohydrate-active enzymes, CAZymes),未来的研究可更多地从基于多糖利用位点出发去寻找能应用于生物能源开发的酶和多酶组合[5-6]。总之,多糖利用位点在动物高效饲养和生物能源开发上有重要的应用价值。本文就多糖利用位点的作用模式、调控机制,瘤胃微生物多糖利用位点的底物多样性、生态位分布及研究现状进行简要综述。

1 多糖利用位点的作用模式

多糖利用位点由SALYERS研究团队首次报道。他们发现多形拟杆菌(Bacteroides theta-iotaomicron)基因组中有一个含8个基因的基因簇,它编码降解淀粉利用系统(starch utilization system, Sus)所需的全部蛋白质[7-8]。研究人员随后发现了许多结构类似的基因簇,它们除降解淀粉外还可以降解其他多糖,继而这些结构类似的基因簇被命名为多糖利用位点。多糖利用位点的标志性特点是至少有1对连续的分别编码TonB依赖性转运体(TonB-dependent transporters, TBDTs)蛋白和细胞表面多糖结合蛋白(cell surface glycan-binding proteins, SGBPs)的SusC/SusD[9]。除此之外,多糖利用位点还编码细胞表面及周质内的碳水化合物活性酶(CAZymes)、调控蛋白和其他的SGBPs。多糖利用位点中的CAZymes通常为GHs、多糖裂解酶(polysaccharide lyases, PLs)和碳水化合物酯酶(carbohydrate esterases, CEs)。针对特殊的底物,多糖利用位点中也可能出现蛋白酶和硫酸酯酶等辅助酶[10-11]。多糖利用位点中酶的数量与底物结构的复杂程度相对应,结构相对简单的淀粉,其多糖利用位点中仅含3个CAZymes[12],而结构复杂的鼠李半乳糖醛酸,其多糖利用位点中含23个CAZymes[13]

多糖利用位点通过级联的方式实现多糖的高效降解(图1)。这个级联过程起始于SusD、SusE和SusF识别和结合细胞外的多糖,随后多糖被内切聚糖酶或外切聚糖酶类GHs等初步降解为低聚糖,接着低聚糖通过SusC运输进入外胞周质,在细胞周质内低聚糖被糖苷酶类GHs等进一步水解,最后生成分子质量更小的寡糖或单糖,并被运输到细胞质内储存或利用。这一过程中外胞周质内的低聚糖作为转录调控的信号,被调控因子识别,从而调控多糖利用位点的表达。

图 1

图 1   多糖利用位点功能示意图[12]

Sus:淀粉利用系统;GH:糖苷水解酶;PUL:多糖利用位点;Reg.:调控因子。

Fig. 1   Function diagram of a PUL[12]

Sus: Starch utilization system; GH: Glycoside hydrolase; PUL: Polysaccharide utilization locus; Reg.: Regulator.


在多糖利用位点中,SusC和SusD是标志性的结构,对于多糖物质结合到细胞表面及后续的转运都是必需的,并且二者之间存在着相互作用的关系。GLENWRIGHT等利用X射线衍射的方法研究了SusC/SusD复合体的晶体结构,提出了多糖利用位点获取营养物质的踏板箱机制[14]。SusC是一类TBDTs,分子质量(约120 kDa)比典型的TBDTs分子质量(约75 kDa)大60%,具有TBDTs的典型结构:一个有N末端延长区的塞子样的结构域和一个由22股β链组成的桶形结构域,其中β桶形结构包围着塞子结构。SusD覆盖在桶状蛋白SusC上,形成细胞外的盖子,SusC和SusD由约50个氢键和3个盐桥稳固连接。未结合底物时,SusD盖子呈打开状态,向胞外暴露出底物结合区域;当结合底物后,SusD盖子关闭,塞子构象改变,形成转运通道,将底物由通道运输到细胞周质内。总之,蛋白结构解析技术揭示了多糖利用位点中SusC/SusD的作用机制,为进一步探究SusC/SusD的底物特异性提供了研究基础[15]

除多糖利用位点外,纤维小体和胞外分泌表达的游离酶是另外2种多糖降解模式[16]。纤维小体是通过锚定结构域与支架蛋白上的黏附结构域特异性结合组成的胞外多酶复合体,通常存在于细胞表面,紧密结合纤维素后发挥降解作用[17]。相较于胞外分泌表达的游离酶中多个酶的游离状,纤维小体和多糖利用位点中的多个酶极为贴近底物,协同活性更高[18-19]。与纤维小体在细胞表面结合和充分降解多糖物质不同的是,多糖利用位点仅在细胞表面初步降解多糖物质为特定的低聚糖,该低聚糖仅可被该菌自身或少量的其他菌株识别和利用,这是多糖利用位点规避互养和能量共享的“自私”机制,使编码多糖利用位点的菌株在任何环境中都可竞争性地获得主导地位[20-21]。蛋白质组学研究表明,以纤维素类物质为食的驯鹿瘤胃中,多糖利用位点是主要的多糖降解模式,纤维小体和胞外分泌表达的游离酶的模式都较少出现[22]

2 多糖利用位点的调控机制

为了更高效地利用多糖,对应不同的多糖底物,多糖利用位点的基因簇中包含着不同的调控元件,以不同的方式完成对多糖利用位点表达的调控。多糖利用位点的调控方式有SusR调控器/感受器、胞质外功能σ(extracytoplasmic function sigma, ECF-σ)因子/抗-σ(anti-σ)因子对、混合双组分系统(hybrid two-component systems, HTCSs)[23]。SusR识别周质中的麦芽糖,ECF-σ/anti-σ和HTCSs分别识别宿主多糖和植物多糖的水解产物。SusR是完整的内膜蛋白[24],与麦芽糖结合后,快速诱发淀粉多糖利用位点的转录。多形拟杆菌(B. thetaiotaomicron)接触到淀粉30 min内,淀粉多糖利用位点中的蛋白大量表达,呈现出对底物的快速响应[25]。anti-σ识别来自母乳和黏液O-连接聚糖中的低聚糖后,将ECF-σ释放入细胞质,与RNA聚合酶相互作用,促进多糖利用位点的转录[26]。HTCSs是一个跨膜蛋白,它从N末端到C末端依次包含碳水化合物感知域、组氨酸激酶结构域、响应调控域和DNA结合域。HTCSs感知到周质内的低聚糖后,发生磷酸化,进行分子内的磷酸转移,通过DNA结合域,触发转录激活,从而调控多糖利用位点的转录[27]。多形拟杆菌(B. thetaiotaomicron)中的HTCS BT0366识别阿拉伯聚糖后发生磷酸化,从而激活了阿拉伯聚糖多糖利用位点的转录;而添加硫酸软骨素来抑制HTCS BT0366的磷酸化,则抑制了阿拉伯聚糖多糖利用位点的转录。总之,多糖利用位点的调控机制,使其对多糖的识别与水解更加高效。

3 瘤胃微生物的多糖利用位点

宏基因学研究表明,在驯鹿[28]、牛[29-30]、骆驼[31]等反刍动物瘤胃中,多糖利用位点广泛存在。同时,宏转录组学[32]和宏蛋白组学[22]研究揭示,瘤胃中的多糖利用位点呈高转录和高表达水平。CAZymes的多糖利用位点数据库(PULDB)中包含了64株瘤胃拟杆菌的多糖利用位点信息,占全库信息的6%。

3.1 瘤胃微生物多糖利用位点的底物多样性

反刍动物的草食性及瘤胃液体环境决定了瘤胃微生物必须以更高效的方式从纤维性饲料中获取碳源。与其他单胃动物相比,瘤胃微生物的多糖利用位点广泛地参与纤维素、半纤维素(木聚糖、甘露聚糖、木葡聚糖、β-葡聚糖)和果胶等纤维类物质的高效降解[22,33]

多糖利用位点的底物多样性由不同的组分和它们的协同机制共同决定。瘤胃中的多糖利用位点结构以SusC/SusD居多,这可能是由于SusC/SusD附近的基因功能未知,无法预测出完整的多糖利用位点结构[22,33-34]。瘤胃中的纤维素多糖利用位点(图2,PUL 1)发现于不可纯培养的拟杆菌AC2a(Bacteroidetes phylotype AC2a)中,结构简单,仅编码8个基因。其中:SusD和SusE负责结合纤维素,GH5和GH9协同降解纤维素为纤维二糖,SusC 转运纤维二糖到细胞周质内,GH94将纤维二糖降解为单糖[19]。甘露聚糖多糖利用位点(图2,PUL 2)发现于普氏菌属PREV32(Prevotella sp. PREV32)中,结构较复杂。其中的GH5A负责降解植物纤维中的β-葡聚糖和木聚糖,使被覆盖的甘露聚糖可被GH5B接触到,CE7协助乙酰化甘露聚糖的降解。主要过程为GH5B降解半乳甘露聚糖为半乳甘露低聚糖,SusC转运低聚糖到外周胞质内,GH36去除低聚糖上的半乳糖,GH26降解甘露低聚糖为甘露二糖或甘露糖,转运蛋白运输降解产物到细胞质内,其中的甘露二糖-2-表异构酶易把甘露二糖加工为甘露糖基化葡萄糖,GH130负责降解甘露糖基化葡萄糖和甘露二糖。木聚糖利用位点(图2,PUL 3)发现于布氏普雷沃菌(Prevotella bryantii)中,其中存在一个木聚糖利用核心基因簇,包含2个串联的SusC/SusD结构、1个功能未知的蛋白和1个GH10[35],是拟杆菌利用木聚糖的典型特征。GH10的一个重要特征是它的催化域中有2个碳水化合物结合域4家族(carbohydrate-binding module family 4, CBM4),使该酶可以紧密结合木聚糖,增强了自身的木聚糖降解能力[36]。瘤胃中其他木聚糖利用位点也具有类似的核心基因簇,但其多糖利用位点中其他的组分可能不同。

图2

图2   瘤胃中多糖利用位点底物选择示意图

PUL:多糖利用位点;Reg.:调控因子;GH:糖苷水解酶;Sus:淀粉利用系统;Trans.:转运蛋白;Epim.:甘露二糖-2-表异构酶;CE:碳水化合物酯酶;Hypo.:假定蛋白;Est.:酯酶。

Fig. 2   Substrate selection diagram of PULs in rumen

PUL: Polysaccharide utilization locus; Reg.: Regulator; GH: Glycoside hydrolase; Sus: Starch utilization system; Trans.: Transporter; Epim.: Mannobiose-2-epimerase; CE: Carbohydrate esterase; Hypo.: Hypothetical protein; Est.: Esterase.


通常认为,1个多糖利用位点只可降解1种多糖,如GH5和GH9,二者都是作用十分广泛的酶,可降解许多半纤维素和纤维素物质,但当它们共存在一个木葡聚糖多糖利用位点中时,只可降解木葡聚糖[37]。与之相反,瘤胃中存在一个可降解多种多糖的多糖利用位点(图2,PUL 4),发现于拟杆菌SRM-1(Bacteroidetes phylotype SRM-1)中,其中的GH5可降解β-葡聚糖、甘露聚糖、木聚糖、木葡聚糖和非结晶纤维素[38]。2个SusD和1个SusE可以结合纤维素和β-葡聚糖,而结合甘露聚糖的能力较弱。GH5和GH26降解半纤维素底物,其中:GH5降解产生的纤维二糖被GH94降解为单糖;GH26降解产生的甘露低聚糖被GH130降解为甘露糖,半乳糖单体被GH2释放。GH5和CE7的存在,提示该多糖利用位点对木聚糖和低聚木糖有脱乙酰作用。转运蛋白负责最终单体的运输。该多糖利用位点广泛的功能决定了其在瘤胃中普遍存在。

3.2 瘤胃微生物多糖利用位点的生态位分布

与人肠道拟杆菌的多糖利用位点分布相似,瘤胃微生物降解不同的多糖,呈现精细的多糖利用位点生态位分布[22]。目前预测到的瘤胃多糖利用位点主要来自于普氏菌属(Prevotella)、拟杆菌属(Bacteroides[28,30-33,39]及未被分类的拟杆菌[34,40]。瘤胃微生物单个菌株中包含的多糖利用位点数量从1个到37个不等[35]。包含37个和35个多糖利用位点的菌株与多糖普雷沃菌(Prevotella multisaccharivorax)系统进化关系极近[41],多糖利用位点数量第2多的菌株与栖瘤胃普雷沃菌(P. ruminicola)系统进化关系极近[33],这均印证了普氏菌属强大的多糖降解能力,也说明丰富的多糖利用位点可能是普氏菌属成为瘤胃中丰度最高类群的重要原因之一[42-44]。单个普氏菌同时含有利用不同底物的多个多糖利用位点,但不同的普氏菌又有各自的专一性,与栖瘤胃普雷沃菌(P. ruminicola)相比,布氏普雷沃菌(P. bryantii)缺少α-甘露聚糖和β-葡聚糖多糖利用位点,栖瘤胃普雷沃菌(P. ruminicola)和布氏普雷沃菌(P. bryantii)各自不同的菌株间多糖利用位点的分布也有不同(表1)。这与瘤胃生态位的维系有何关联仍需深入研究。

表1   瘤胃中栖瘤胃普雷沃菌和布氏普雷沃菌菌株中的多糖利用位点[40]

Table 1  PULs detected in rumen Prevotella ruminicola and Prevotella bryantii strains[40]

多糖PolysaccharidePrevotella bryantiiPrevotella ruminicola
B14C21aTC1-1FB3001BPI-162BPI-34KHP123Ga6B6RM4
淀粉 Starch++++++++++
果聚糖 Fructan++++++++++++++
木聚糖 Xylan++++++++++++++++++++
β-葡聚糖 β-glucan++++++++++++
木葡聚糖 Xyloglucan++++
葡/半乳甘露聚糖 Glucomannan/galactomannan+++++++
α-甘露聚糖 α-mannan++++++++++++
聚半乳糖醛酸 Homogalacturonan++++++++++++++++++++
鼠李半乳糖醛酸聚糖 Rhamnogalacturonan++++++++++++++++++++
阿拉伯聚糖 Arabinan+++++++++++++++
阿拉伯半乳聚糖 Arabinogalactan++++++++++++
葡聚糖 Dextran+
宿主多糖Host glycans+/-+/-+/-++++++

++:有超过1个多糖利用位点;+:仅有1个多糖利用位点;+/-:没有完整的多糖利用位点,有SusC/SusD或效应蛋白(CAZymes、调控因子和转运蛋白);-:没有完整的多糖利用位点,也没有SusC/SusD和效应蛋白(CAZymes、调控因子和转运蛋白)。

++: More than one PUL; +: One PUL; +/-: No complete PUL, either SusC/SusD or effectors (CAZymes, regulator, transporter) are present, but not both; -: No complete PUL, no SusC/SusD or effectors (CAZymes, regulator, transporter) yet.

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3.3 瘤胃微生物多糖利用位点的研究现状

对多糖利用位点的研究主要集中在基因和基因组水平,而对多糖利用位点的结构和功能的研究相对缺乏,通过多糖利用位点探究微生物互作尚处于起步阶段。从基因组信息中预测多糖利用位点,首先需要将基因与Pfam数据库中的SusD蛋白(PF07980、PF12741、PF12771、PF14322)和SusC蛋白(PF00593、PF07715、PF13715)进行比对,在基因中寻找SusC/SusD结构[45],再在SusC/SusD附近的开放阅读框内寻找CAZymes或其他蛋白。将预测出的多糖利用位点和文献报道的多糖利用位点(http://www.cazy.org/PULDB/)进行比较,推测其底物类型。瘤胃可培养微生物的匮乏以及数据库信息的短缺使多糖利用位点的研究落后于人肠道中相关的研究,但除去微生物宿主的不同,多糖利用位点的研究方法是共通的。

对于可培养菌株,可利用推测出的多糖为碳源,配制单一碳源培养基,观察菌株的生长状况;或通过构建特定基因缺失株,在推测的多糖培养基上观察菌株的生长状况来验证多糖利用位点的功能;并可进一步结合转录组、蛋白组测序等,获得多糖利用位点的转录和表达信息。在人肠道拟杆菌——椭圆形拟杆菌(B. ovatus ATCC 8483)的基因组中预测含一个编码β-甘露聚糖酶和α-半乳糖苷酶的多糖利用位点。由β-甘露聚糖亲和电泳实验证实,该多糖利用位点中还包含2个多糖结合蛋白。以半乳葡甘露聚糖或葡甘露聚糖为底物进行单菌及基因敲除菌纯培养证实,多糖利用位点在椭圆形拟杆菌(B. ovatus)对半乳甘露聚糖利用中发挥关键作用[46]。敲除椭圆形拟杆菌(B. ovatus)谷物β-葡聚糖多糖利用位点中的SusD基因,椭圆形拟杆菌(B. ovatus)无法以谷物β-葡聚糖为底物生长,证实了多糖利用位点中SusD的关键作用[47]

已知作用模式的多糖利用位点可作为研究微生物互作的切入点。TUNCIL等以含混合6种多糖物质的培养基分别培养多形拟杆菌(B. thetaiotaomicron)和椭圆形拟杆菌(B. ovatus),结合底物消耗和基因转录情况,归纳出这2株菌对6种多糖物质的不同利用次序,该次序决定了这2株菌在共培养时以一个相对稳定的状态共存[48]。紫菜聚糖多糖利用位点被编码到一株拟杆菌后,该菌株的丰度可响应环境中紫菜聚糖的剂量变化,使其在不同的群落中都可稳定定殖[49]

从不可培养的微生物中预测出的多糖利用位点,则需要经异源表达、纯化、蛋白特性分析来探究各组分的功能[22]。探究多糖利用位点中CAZymes的底物特异性和酶学互作,是了解多糖利用位点作用机制的前提,多糖利用位点中的转运蛋白[50]、结合蛋白[51]和调控因子[52]的功能分析,是进一步掌握多糖利用位点作用模式的基础。目前,对瘤胃多糖利用位点的研究大多停留在预测水平,进一步利用分子生物学等手段研究其功能将成为研究热点。

4 小结与展望

与人肠道、海洋、土壤等环境相比,瘤胃有更强的纤维降解能力。通过宏基因组学、宏转录组学、宏蛋白组学等多种技术,研究人员在DNA、RNA和蛋白质3个层面探究了瘤胃内微生物群落组成及其发挥的功能,尤其是瘤胃内的纤维降解机制。但相对而言,此类研究仍然落后于人肠道微生物中相关的研究。待完善的数据库,较难分离培养的瘤胃微生物,微生物错综复杂的代谢功能和调控规律,都是今后研究中需要逐一突破的难关。

在一个复杂的动态环境中,微生物间的互作是很难被预测的,研究者只能在体外培养单个菌株或构建小的微生物群落,以小窥大,探究微生物互作。瘤胃中存在较多的多糖利用位点,以及反刍动物日粮中较多的纤维类物质,暗示着不同瘤胃菌群多糖利用位点的差异可能是日粮调节肠道菌群的机制之一。就瘤胃微生物群落和单菌层面而言,不同多糖利用位点的协调合作也就是瘤胃生态环境中不同微生物的协调合作,探究多糖利用位点的分布、表达情况及互作机制,有助于对瘤胃微生态的调控和新的微生物工程菌种及酶资源的挖掘。

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