高效液相色谱-二极管阵列检测器法测定茶叶中10种有机酸含量

doi:10.3785/j.issn.1008-9209.2017.12.192

高效液相色谱-二极管阵列检测器法测定茶叶中10种有机酸含量

王丽丽^,^,, 杨军国, 林清霞, 项丽慧, 宋振硕, 张应根, 陈林^,^,

1. 福建省农业科学院茶叶研究所，福建福安 355015

Determination of 10 organic acid contents in tea using high performance liquid chromatography-diode array detector

WANG Lili^,^,, YANG Junguo, LIN Qingxia, XIANG Lihui, SONG Zhenshuo, ZHANG Yinggen, CHEN Lin^,^,

1. Tea Research Institute, Fujian Academy of Agricultural Sciences, Fu’an 355015, Fujian, China

收稿日期: 2017-12-19 接受日期: 2018-05-08 网络出版日期: 2019-03-27

基金资助:

福建省属公益类科研院所专项. 2015R1012-3
福建省自然科学基金. 2016J01121，2017J01042

Received: 2017-12-19 Accepted: 2018-05-08 Online: 2019-03-27

作者简介 About authors

王丽丽（https://orcid.org/0000-0002-7433-1844） , E-mail：875720551@qq.com

陈林（https://orcid.org/0000-0002-4208-421X），Tel：+86-593-2210997 , E-mail：82785676@qq.com

摘要

从流动相配比、柱温、流速、检测波长等方面优化色谱条件，并进行方法学考察及验证性试验，从而建立了一种同时分离和定量测定茶叶中10种有机酸（草酸、D/L-酒石酸、甲酸、L-苹果酸、抗坏血酸、乳酸、乙酸、柠檬酸、琥珀酸和富马酸）的高效液相色谱法。优化后的色谱条件为：采用TSKgel ODS-100V（4.6 mm×250 mm，5 μm）色谱柱，流动相为0.10%磷酸水溶液（A相）和50%乙腈水溶液（B相），洗脱方式为100% A（0 min）→100% A（12 min）→0% A（17 min）→0% A（25 min）→100% A（30 min）→100% A（33 min），后运行2 min，柱温为40 ℃，流速为1.0 mL/min，二极管阵列检测器同时在210和245 nm波长下检测抗坏血酸，在210 nm波长下检测其他9种有机酸。结果显示，各有机酸组分回归方程的相关系数均在0.999 5以上，其精密度和重复性的相对标准偏差（relative standard deviation, RSD）均小于1%，稳定性的RSD小于4%（除抗坏血酸外），回收率为97%～116%。说明该方法的线性关系、精密度和重复性良好，对组分分离效果较好，可用于茶叶中10种有机酸含量的测定。

关键词： 茶叶 ; 有机酸 ; 高效液相色谱法 ; 二极管阵列检测器

Abstract

A high performance liquid chromatography (HPLC) was developed to simultaneously determine the content of 10 organic acids (oxalic acid, D/L-tartaric acid, formic acid, L-malic acid, ascorbic acid, lactic acid, acetic acid, citric acid, succinic acid and fumaric acid) in tea. The chromatographic conditions were optimized in the aspects of mobile phase composition, column temperature, flow rate and detection wavelength. The established HPLC method was methodologically assessed and applied to teas, which included maintaining TSKgel ODS-100V column (4.6 mm×250 mm, 5 μm) at 40 ℃, using 0.10% phosphoric acid-water solution (mobile phase A) and 50% acetonitrile-water solution (mobile phase B) with the gradient elution mode of 100% A (0 min)→100% A (12 min)→0% A (17 min)→0% A (25 min)→100% A (30 min)→100% A (33 min) with 2 min post-run at the flow rate of 1.0 mL/min, and detecting at the wavelengths of 210 and 245 nm for ascorbic acid, and 210 nm for other organic acids by diode array detector (DAD). The correlation coefficients of regression equations for all of the components were greater than 0.999 5, and the relative standard deviations (RSDs) of accuracy and repeatability were lower than 1%, and their RSDs of stability were lower than 4% (except ascorbic acid), as well as the recovery rate with the method of 97%-116%. It is appeared that the newly developed method can yield fine linear relationship, desirable precision, repeatability and separability for determinations of 10 organic acids in tea.

Keywords： tea ; organic acid ; high performance liquid chromatography ; diode array detector

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本文引用格式

王丽丽, 杨军国, 林清霞, 项丽慧, 宋振硕, 张应根, 陈林. 高效液相色谱-二极管阵列检测器法测定茶叶中10种有机酸含量. 浙江大学学报（农业与生命科学版）[J]. 2019, 45(1): 47-53 doi:10.3785/j.issn.1008-9209.2017.12.192

WANG Lili, YANG Junguo, LIN Qingxia, XIANG Lihui, SONG Zhenshuo, ZHANG Yinggen, CHEN Lin. Determination of 10 organic acid contents in tea using high performance liquid chromatography-diode array detector. Journal of Zhejiang University (Agriculture and Life Sciences)[J]. 2019, 45(1): 47-53 doi:10.3785/j.issn.1008-9209.2017.12.192

有机酸是组成茶叶香气和滋味的主要成分之一，占茶叶干物质总量的3%左右^[1]。茶叶中有机酸种类较多，茶叶（汤）中经发现的有机酸有40余种，其中茶汤中有10余种，香气成分中有30余种^[2]。业已发现，茶叶中的有机酸具有诸多生物学活性：一方面，可介导合成酚类、氨基酸、酯类和芳香化合物等物质，参与茶树的新陈代谢，并且可作为生化反应中糖类分解的中间产物；另一方面，可有效协同增强茶多酚激活α-淀粉酶和胰蛋白酶活性表达，增强茶多酚的抗氧化活性，促进儿茶素在人体中吸收转化，具有减轻关节炎、痛风等生理功能^[1,2,3]。因此，定性与定量分析茶叶中的有机酸，是对茶叶生产过程中品质调控研究必不可少的内容，在茶叶生物学活性研究中亦具有重要的意义。

已报道的茶叶有机酸分析方法有酸碱滴定法、气相色谱法、离子交换色谱法、毛细管电泳法和高效液相色谱法等^[2,3,4]，其中：酸碱滴定法灵敏度低，气相色谱法需进行复杂衍生化处理，离子交换色谱法存在无机阴离子干扰，毛细管电泳法重现性较差，而液相色谱法具有操作简单、灵敏度高、分离效果好的特点，是目前最广泛使用的检测手段。在所建立的茶叶有机酸高效液相色谱法（high performance liquid chromatography, HPLC）检测中，测定组分主要包括草酸、苹果酸、乙酸、柠檬酸、琥珀酸等，还包括乳酸、酒石酸、抗坏血酸、富马酸、甲酸、丙酮酸、α-酮戊二酸等^[5,6,7,8]。本文在前人研究的基础上综合了茶叶中可能检测到的10种有机酸，期望建立一种多茶类通用的有机酸同步快速HPLC检测方法，以期对茶叶风味品质调控起到一定的指导作用。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂和仪器

1.1.1 材料

绿茶、白茶、乌龙茶（清香型铁观音）、红茶和普洱茶，自制。

1.1.2 试剂

磷酸（H₃PO₄，优级纯，上海国药集团化学试剂有限公司）；乙腈（HPLC级，美国Fisher Scientific公司）；10种有机酸标准品：D/L-酒石酸（纯度99.8%）、乙酸（纯度99.7%）、富马酸（纯度99.8%）、乳酸（纯度91.2%）、琥珀酸（纯度99.5%）（以上均购自德国Dr. Ehrenstorfer公司），草酸和抗坏血酸（纯度100%，中国食品药品检定研究院），柠檬酸（纯度100%，中国药品生物制品检定所），甲酸溶液[HPLC级，含量49%～51%（T），美国Fluka公司]，L-苹果酸（纯度94.2%，美国ChromaDex公司）。

1.1.3 仪器

美国Agilent1260型液相色谱系统，包括四元泵（G1311C VL）、标准自动进样器（G1329B）、柱温箱（G1316A）和二极管阵列检测器（G1315D VL）；AL204电子天平（美国Mettler Toledo公司）；ACD-0502-U实验室超纯水系统（重庆颐洋企业发展有限公司）；TSKgel ODS-100V色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm，日本Tosoh公司）；PB-21酸度计（配PY-ASI电极，德国Sartious公司）；PES水系针式滤器（孔径0.45 μm，天津津腾实验设备有限公司）等。

1.2 HPLC方法的建立

1.2.1 有机酸标准品储备液的配制

准确移取甲酸、乳酸、乙酸标准品，以超纯水超声溶解并定容至10 mL，分别配制成1.5、5.0和10.0 mg/mL的标准品储备液；分别精密称取草酸、D/L-酒石酸、抗坏血酸、柠檬酸、琥珀酸、L-苹果酸、富马酸等标准品50.0 mg（精确至0.1 mg），以超纯水超声溶解并定容至10 mL，除富马酸配制成1 mg/mL的标准品储备液外，其余均配制成5 mg/mL的储备液。上述溶液均过0.45 μm水系针式滤器，分装，于－20 ℃保存，备用。

1.2.2 色谱条件优化

分别从检测波长（200～400 nm）、流动相配比[流动A相（H₃PO₄水溶液）的pH值为2.27、2.16、2.05，相应配制的体积分数为0.06%、0.10%、0.14%；流动A相与B相（50%乙腈水溶液）洗脱比例]、柱温（36、38、40、42 ℃）、流速（0.8、1.0、1.2 mL/min）等方面考察10种有机酸在TSKgel ODS-100V色谱柱上的分离效果，从而确定适宜的色谱条件。

1.2.3 方法学考察

从标准曲线、检测限、定量限、精密度、重复性、稳定性、回收率等方面对适宜的色谱条件予以考察，验证其运行效果。具体步骤如下：取各有机酸标准品储备液适量，按一定比例稀释，制成一系列不同质量浓度的标准品溶液，采用上述色谱条件进样分析，进样量10 μL。以进样的质量浓度为横坐标、峰面积为纵坐标绘制标准曲线，建立回归方程，确定线性范围。将各标准品储备液稀释成很低的浓度后进样，分别以3倍和10倍信噪比（S/N）测得检测限和定量限。根据标准曲线确定的线性范围，取各有机酸储备液适量，混匀，制成含草酸、D/L-酒石酸、甲酸、L-苹果酸、抗坏血酸、乳酸、乙酸、柠檬酸、琥珀酸、富马酸质量浓度分别为0.125、0.365、1.200、0.500、0.125、0.700、1.800、0.590、1.225、0.025 μg/mL的混合标准品溶液（以下简称“有机酸混标”），于4 ℃条件下保存，备用。取该有机酸混标上样分析，连续进样5次，计算各组分峰面积的相对标准偏差（relative standard deviation, RSD），考察精密度。平行制备有机酸混标3份，分别进样，计算各组分峰面积的RSD，考察重复性。对同一有机酸混标，分别于配制后的0、2、4、8、12、14和24 h时进样，计算组分峰面积的RSD，考察稳定性。取已知含量的茶样1份，分别添加质量浓度不等的有机酸混标3份，上样分析，测定添加前后茶样中各标准品含量，考察回收率。

1.3 方法验证性试验

准确称取磨碎茶样0.30 g，加45 mL纯水，涡旋混匀，沸水浴45 min，冷却过滤，用超纯水稀释1倍，过0.45 μm水系针式滤器后上样检测。

2 结果与分析

2.1 色谱条件优化结果

2.1.1 检测波长的确定

通过二极管阵列检测器（diode array detector, DAD）在波长200～400 nm范围内对有机酸混标进行光谱扫描。结果（图1）显示，抗坏血酸在245 nm附近有较大吸收值，其余9种有机酸均在210 nm附近吸收值较大，而且流动A相在紫外区几乎无吸收。因此，设置DAD为双波长同时检测，分别在210和245 nm处检测抗坏血酸，在210 nm处检测其他有机酸。

图1

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图1 10种有机酸的紫外光谱扫描图

Fig. 1 Ultraviolet spectra of 10 organic acids

（1～10）依次为草酸、D/L-酒石酸、甲酸、L-苹果酸、抗坏血酸、乳酸、乙酸、柠檬酸、琥珀酸、富马酸。

(1-10) represent oxalic acid, D/L-tartaric acid, formic acid, L-malic acid, ascorbic acid, lactic acid, acetic acid, citric acid, succinic acid, and fumaric acid, respectively.

2.1.2 流动相配比的确定

分别以0.06%、0.10%、0.14%的H₃PO₄水溶液做流动A相，测得溶液pH值依次为2.27、2.16、2.05，并设置柱温40 ℃，流速1 mL/min，有机酸混标溶液进样量10 μL，等度洗脱12 min，在210 nm波长下检测，考察流动A相的不同pH值对有机酸混标中各组分保留时间的影响。结果（图2）表明，因试验所设pH值（2.05～2.27）的范围波动较小，故仅对琥珀酸和富马酸的保留时间稍有影响，且随流动相pH值的升高，总体检测时间稍有缩短。考虑到此色谱柱pH值范围为2.0～7.5，选择pH值2.16与2.27均可，因此，本试验选择pH值2.16即以0.10% H₃PO₄水溶液做流动A相。然而，因后续茶样测试采用序列连续自动进样，在试验中发现上一针茶样中残留的杂质对后续进样的色谱分离效果造成了不良影响，如出现峰型变胖、杂峰较多、两峰之间或以上相互重叠、组分分离度变差等现象（图3），因此在0.10% H₃PO₄水溶液等度洗脱12 min后，以50%乙腈水溶液（流动B相）进行梯度洗脱[100% A（12 min）→0% A（17 min）→0% A（25 min）→100% A（30 min）→100% A（33 min），后运行2 min]，可有效清除上一针茶样中保留时间较长的残留杂质。

图2

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图2 流动A相的不同pH值对10种有机酸保留时间的影响

Fig. 2 Effect of mobile phase A with different pH values on the retention time of 10 organic acids

各图例符号后的编号表示的含义详见图1注。

Please see the footnote of Fig. 1 for the details of the No. after the each legend symbol.

图3

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图3 序列进样下茶样中10种有机酸的HPLC图

Fig. 3 HPLC chromatograms of 10 organic acids in tea during sequence sampling

a：第1针色谱图；b：第4针色谱图。

a: Chromatogram of the 1st sample injection; b: Chromatogram of the 4th sample injection.

2.1.3 柱温的确定

设置柱温36、38、40、42 ℃，以0.10% H₃PO₄水溶液做流动A相，采取梯度洗脱方式，其余色谱条件不变，进样分析，考察不同柱温对各组分保留时间的影响。结果（图4）表明，柱温为40 ℃时，分离10种有机酸所需检测时间最短，且柱温越低柱压越大，色谱柱寿命也相应缩短，因此，选用40 ℃柱温最佳。

图4

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图4 不同柱温对10种有机酸保留时间的影响

Fig. 4 Effect of different column temperatures on the retention time of 10 organic acids

各图例符号后的编号表示的含义详见图1注。

Please see the footnote of Fig. 1 for the details of the No. after the each legend symbol.

2.1.4 流速的确定

设置流速0.8、1.0、1.2 mL/min，以0.10% H₃PO₄水溶液做流动A相，采取梯度洗脱方式，其余色谱条件不变，进样分析，考察不同流速对各组分保留时间的影响。结果（图5）表明，随着流速的提高，各组分保留时间明显缩短，总的检测时间变短，但在1.2 mL/min流速下柱压最高且D/L-酒石酸和甲酸之间的分离度变差，因此，选用1.0 mL/min流速为宜。

图5

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图5 不同流速对10种有机酸保留时间的影响

Fig. 5 Effect of different flow rates on the retention time of 10 organic acids

各图例符号后的编号表示的含义详见图1注。

Please see the footnote of Fig. 1 for the details of the No. after the each legend symbol.

由此确定分离10种有机酸适宜的色谱条件为：采用TSKgel ODS-100V色谱柱，流动相由0.10% H₃PO₄水溶液（A相）和50%乙腈水溶液（B相）组成，以100% A（0 min）→100% A（12 min）→0% A（17 min）→0% A（25 min）→100% A（30 min）→100% A（33 min）进行梯度洗脱，后运行2 min，柱温40 ℃，流速1.0 mL/min，检测波长210 nm和245 nm。在此色谱条件下，有机酸混标中各组分均达到基线分离，分离效果良好（图6）。

图6

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图6 在适宜色谱条件下10种有机酸的HPLC图

Fig. 6 HPLC chromatogram of 10 organic acids under the suitable chromatographic condition

图上编号表示的含义详见图1注。

Please see the footnote of Fig. 1 for the details of the No. on the figure.

2.2 方法学考察结果

2.2.1 标准曲线、检出限和定量限

取不同质量浓度的标准品溶液适量，按试验确立的适宜色谱条件进样分析，测得各组分峰面积，绘制标准曲线。其保留时间、回归方程、相关系数、线性范围、检测限和定量限见表1。结果显示，所有回归方程的相关系数在0.999 5以上，表明10种有机酸在所测浓度范围内进样浓度X与峰面积Y呈良好的线性关系。

表1 标准品的回归方程

Table 1 Regression equation of standards

组分 Component	回归方程 Regression equation	相关系数 Correlation coefficient	线性范围 Linear range/(μg/mL)	检出限 LOD/(μg/mL)	定量限 LOQ/(μg/mL)
草酸 Oxalic acid	Y＝7.675 3X＋1.054 3	1.000 0	15.0～215.0	1.333	2.665
D/L-酒石酸 D/L-tartaric acid	Y＝0.927 9X＋0.108 6	1.000 0	6.0～105.0	2.031	5.080
甲酸 Formic acid	Y＝0.507 4X－0.548 2	0.999 5	7.5～125.0	3.050	7.625
L-苹果酸 L-malic acid	Y＝0.468 2X－1.414 6	1.000 0	25.0～500.0	5.228	8.714
抗坏血酸 Ascorbic acid	Y＝58.138 1X－7.345 7	1.000 0	2.5～40.0	0.515	0.644
乳酸 Lactic acid	Y＝0.262 5X＋0.232 0	1.000 0	60.0～2 000.0	12.090	24.180
乙酸 Acetic acid	Y＝0.326 2X＋0.180 0	1.000 0	15.0～210.0	6.979	10.469
柠檬酸 Citric acid	Y＝0.638 8X－0.018 1	0.999 9	5.0～80.0	2.055	4.110
琥珀酸 Succinic acid	Y＝0.333 8X－0.010 2	0.999 9	5.0～205.0	6.381	25.522
富马酸 Fumaric acid	Y＝74.201 6X－0.228 6	0.999 9	0.05～0.1	0.042	0.104

注：抗坏血酸组分回归曲线建立所用峰面积在245 nm处测得，其余均在210 nm处测得。

The peak area of ascorbic acid was detected at 245 nm and the others at 210 nm to establish their individual regression equations. LOD: Limit of detection; LOQ: Limit of quantitation.

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2.2.2 精密度、重复性和稳定性

在上述确立的适宜色谱条件下进行方法学考察，结果见表2。精密度试验和重复性试验显示，所有组分峰面积的RSD均小于1%；稳定性试验显示，在室温条件下同一混标溶液中抗坏血酸浓度呈直线下降，24 h后含量减少约50%，表明其稳定性较差，其余组分峰面积RSD均小于4%，稳定性良好；回收率试验表明，各组分回收率为97%～116%。由此表明所建立的高效液相色谱法精密度和重复性良好，回收率较好，在室温条件下混标溶液中除抗坏血酸外其余组分在24 h内稳定性良好，符合高效液相色谱测定要求。

表2 精密度、重复性、稳定性与回收率试验

Table 2 Tests on accuracy, repeatability, stability and recovery

组分 Component	相对标准偏差Relative standard deviation (RSD)			回收率 Recovery (n=3)
组分 Component	精密度Accuracy	重复性Repeatability	稳定性Stability	回收率 Recovery (n=3)
草酸 Oxalic acid	0.421	0.361	1.525	98.289
D/L-酒石酸 D/L-tartaric acid	0.036	0.143	0.673	104.277
甲酸 Formic acid	0.009	0.657	0.077	106.688
L-苹果酸 L-malic acid	0.107	0.240	3.738	97.802
抗坏血酸 Ascorbic acid	0.448	0.244	73.843	98.677
乳酸 Lactic acid	0.234	0.322	1.006	98.081
乙酸 Acetic acid	0.357	0.222	0.591	115.904
柠檬酸 Citric acid	0.159	0.199	1.070	99.202
琥珀酸 Succinic acid	0.082	0.081	0.164	108.900
富马酸 Fumaric acid	0.651	0.172	2.447	100.237

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2.3 方法验证性试验结果

按1.3节试验方法提取和测定茶样3次，得到的色谱图如图7所示，依据标准曲线计算各类茶提取液中有机酸含量，结果见表3。可以看出，在上述适宜的色谱条件下10种有机酸组分可得到较好的分离。从表3还可以看出，各茶样中有机酸总量约占其干物质的2%～5%，其中红茶有机酸总量最高，琥珀酸和乳酸占其总量的50%以上，白茶的有机酸总量次之，乳酸和乙酸是其主要成分，乌龙茶的有机酸含量最低。推测茶类间有机酸含量差异的原因可能与其发酵程度和原料嫩度相关，相比其他茶类，红茶发酵程度最高，而制作乌龙茶（铁观音）采用的鲜叶为对夹二至四叶或一芽三、四叶，嫩度均比绿茶和白茶低。

图7

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图7 绿茶样中10种有机酸的HPLC图

Fig. 7 HPLC chromatogram of 10 organic acids in green tea samples

图上编号表示的含义详见图1注。

Please see the footnote of Fig. 1 for the details of the No. on the figure.

表3 茶样中10种有机酸质量分数

Table 3 Content of 10 organic acids in teas

组分 Component	绿茶 Green tea	白茶 White tea	乌龙茶 Oolong tea	红茶 Black tea	普洱茶 Pu-erh tea
草酸 Oxalic acid	6.60±0.47	8.01±0.58	6.15±0.48	7.55±0.22	12.89±0.73
D/L-酒石酸 D/L-tartaric acid	2.61±0.65	2.43±0.33	0.99±0.037	3.89±0.045	0.57±0.044
甲酸 Formic acid	0.028±0.002 1	0.10±0.013	0.14±0.028	0.095±0.001 2	0.045±0.001 3
L-苹果酸 L-malic acid	1.10±0.10	1.42±0.31	3.40±0.23	1.98±0.10	1.13±0.22
抗坏血酸 Ascorbic acid	0.45±0.11	0.12±0.012	0.10±0.003 2	0.095±0.005 1	0.072±0.006 6
乳酸 Lactic acid	13.33±0.76	16.52±1.47	6.18±0.38	12.18±1.22	1.44±0.20
乙酸 Acetic acid	5.44±0.42	13.90±0.72	4.63±0.50	6.00±0.012	15.84±0.33
柠檬酸 Citric acid	2.10±0.23	2.55±0.47	1.66±0.042	4.01±0.42	1.50±0.098
琥珀酸 Succinic acid	6.10±0.82	ND	ND	15.22±1.70	5.01±0.025
富马酸 Fumaric acid	0.042±0.001 1	0.054±0.001 2	0.051±0.002 1	0.021±0.001 5	0.032±0.011
总量 Total content	37.80±3.56	45.10±3.91	23.30±1.70	51.04±3.72	38.53±1.67

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3 讨论与结论

本文采用DAD检测器对200～400 nm范围内全紫外波段扫描发现，抗坏血酸的最大吸收波长在245 nm附近，不同于其他9种有机酸（在210 nm附近），鉴于茶样中抗坏血酸含量较低，为提高检测准确性，故选用245 nm作为抗坏血酸的检测波长，将在此波长下测得的峰面积用于定量计算，这与乔方等^[9]选用的波长相同，与文献[10]采用的波长254 nm较为接近，而多数研究推荐210 nm^[11,12,13]，即与其他有机酸的测定波长一致，推测主要出于检测便捷性考虑。此外，抗坏血酸在室温条件下很不稳定，稳定性试验表明24 h后其含量降低约50%，因此为获得可靠的测试结果，极有必要低温保存该标准品溶液及所测茶样。更值得一提的是，以0.10% H₃PO₄水溶液做流动相，在等度洗脱12 min后就可分离茶叶中的10种有机酸，但由于茶样本身基质复杂，在序列进样中设置靠前的茶样里一些水溶性杂质会与后续所进茶样中的有机酸组分重叠，导致其分离效果变差。因此，为消除此不良影响，本试验先后尝试用不同体积分数甲醇水溶液和乙腈水溶液洗脱茶样中的杂质。结果发现，10%～90%甲醇仍不足以洗脱杂质，而50%乙腈梯度洗脱可有效洗去杂质，使受测试样品相互不受影响。这与刘晨明等^[14]用乙腈来洗脱培养液中绝大部分保留时间较长的物质，从而避免干扰下一个样品的测定方法一致。

综上可见，亲水性的TSKgel ODS-100V色谱柱可用于茶叶中有机酸的分离检测，其适宜的色谱条件为：以0.10% H₃PO₄水溶液（A相）和50%乙腈水溶液（B相）为流动相，洗脱梯度为100% A（0 min）→100% A（12 min）→0% A（17 min）→0% A（25 min）→100% A（30 min）→100% A（33 min），后运行2 min，柱温为40 ℃，流速为1.0 mL/min，DAD在双波长210和245 nm下同时检测。用该方法可在35 min内同时分离测定茶叶中的10种有机酸。

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