水稻（Oryza sativa L.）是我国第一大粮食作物，全国近2/3的人口以稻米为主食，水稻栽培面积约占粮食作物种植面积的1/3^[1]。水稻种子质量是决定水稻产量的重要因素，直接关系到粮食生产的安全。种子质量是由种子不同特征综合而成的一种概念，主要包括2方面的内容：品种质量和播种质量。品种质量是指与遗传特性有关的品质，可用真实性和纯度来反映。播种质量是指种子播种后与田间出苗有关的质量，包括净度、水分、种子健康度、种子籽粒质量、生活力、发芽力、活力等^[2]。

种子活力是决定种子在田间迅速整齐出苗及长成正常幼苗潜在能力的总称，是衡量种子质量的重要指标。高活力水稻种子具有明显的生长优势和生产潜力，对提高水稻种子耐藏性和田间成苗率、抵抗苗期逆境（低温、干旱和病虫草害等）、节省播种费用、增加作物产量具有重要意义^[3]。种子活力不是一个单一的特性，同时环境条件又增加了活力的不稳定性。因此，任何一种活力测定方法都不可能直接反映种子活力的全部特性^[4]。目前，种子活力测定方法归纳起来分为直接法和间接法2类。直接法是在实验室内模拟田间环境条件和其他条件，测定种子发芽情况的方法；间接法是测定与田间出苗率相关的生理生化指标的方法^[5]。

在逆境胁迫的田间条件下，实验室内发芽试验结果与田间出苗率相关性低，不能准确地预测田间出苗表现与生产情况。水稻是喜温作物，根据播种期、生长期和成熟期的不同，水稻又可分为早稻、中稻和晚稻。1960年以来，浙江省以双季稻（早稻+晚稻）种植为主，其中早稻在浙江省水稻产业中占有重要地位。相比于中、晚稻，早稻在直播或育秧期更容易遭受低温胁迫，严重影响水稻种子的出苗与幼苗生长。低温发芽试验可以模拟田间低温条件，采用较低的温度进行发芽试验，以预测种子在低温田间条件下的发芽适应能力^[6]。陈一清等利用低温对水稻品种进行鉴定并与田间出苗情况进行相关性分析，表明低温发芽可以测定水稻的种子活力^[7]。傅丹桂等研究表明，8个不同类型水稻品种在18 ℃低温发芽14 d的发芽率与田间出苗率呈极显著正相关^[8]。但是传统的低温发芽试验需要统计发芽 14 d的正常幼苗数，耗时费力。同时，低温发芽试验测定水稻种子活力的相关机制还未被充分研究。

因此，本试验选用了浙江省种植面积较广的6个早稻品种，通过人工加速老化的方法获得了各品种具有高低活力差异的种子样品（共12个），采用不同低温（12 ℃、15 ℃和18 ℃）发芽试验方法测定了这12个种子样品的种子活力，旨在为改进低温发芽试验并测定早稻种子活力提供进一步的理论研究基础。同时，试验选取了低温发芽试验测定水稻种子活力的最佳时间点，并进一步检测了高低活力种子批之间在低温胁迫下相关生理生化指标的差异，以期为低温发芽试验测定水稻种子活力的机制提供新的理论基础。

以‘株两优06’（ZLY06）、‘株两优101’（ZLY101）、‘中早39’（ZZ）、‘金早47’（JZ）、‘中嘉早17’（ZJZ）和‘甬籼15’（YX）6个水稻（Oryza sativa L.）早稻品种作为试验材料。通过人工加速老化的方法获得各品种低活力（-L）的种子样品^[3]，未经过人工老化的种子为高活力（-H）的种子样品，共12个早稻种子样品。人工加速老化在种子老化箱中进行，在48 ℃和100%空气湿度下人工老化72 h。

参照国际种子检验协会（International Seed Testing Association, ISTA）种子检验规程^[9]，对12个种子批水稻种子进行标准发芽试验。水稻种子经过0.1%的次氯酸钠溶液消毒15 min后采用纸上发芽。发芽盒（长×宽为12 cm×12 cm）内放两层发芽纸，充分润湿后，均匀放入100粒水稻种子，4组重复。将种子置于25 ℃恒温培养箱中发芽，光照设置为12 h光照/12 h黑暗。以种子胚根突破种皮1 mm为发芽标准，每天记录发芽数，在发芽的第4天和第7天分别计算发芽势（germination energy, GE）和发芽率（germination percentage, GP）。在发芽的第14天，随机选取具有代表性的10株幼苗，测量其长度。发芽指数（germination index, GI）=∑（G_t /t），其中G_t是第t天的发芽数。活力指数（vigor index, VI）=GI×苗干质量。

对12个种子批水稻种子进行低温发芽试验，温度设置分别为12 ℃、15 ℃和18 ℃。水稻种子经过0.1%的次氯酸钠溶液消毒15 min后采用纸上发芽。发芽盒内放两层发芽纸，充分润湿后，均匀放入100粒水稻种子，4组重复。光照设置为12 h光照/12 h黑暗。以种子胚根突破种皮1 mm为发芽标准，每天记录发芽种子数。

对12个种子批水稻种子进行田间出苗试验。于2018年4月7日—21日在浙江省农业科学院作物与核技术利用研究所农场进行，试验期间每天用U型高低温度计记录田间最高与最低气温（图1）。水稻种子经过0.1%的次氯酸钠溶液消毒15 min后播种于育秧田中，4组重复，每组播种100粒种子，在第14天时统计田间出苗率。

赤霉素（gibberellin, GA）和脱落酸（abscisic acid, ABA）含量测定参照HUANG等的方法并稍作修改^[10]。取水稻种子0.3 g，加入液氮，研磨成粉，然后加入6 mL的冷乙腈，密封放入4 ℃冰箱中浸提12 h。浸提后于4 ℃、1×10⁴ r/min条件下离心10 min，取上清液；接着在35 ℃条件下用氮气吹干，加入3 mL磷酸缓冲溶液（0.1 mol/L，pH=8.0），放入 －80 ℃超低温冰箱中冰冻30 min后，在4 ℃条件下解冻，低温、1×10⁴ r/min离心15 min，过滤弃去杂质，用盐酸（0.5 mol/L）调pH至3.0～3.5，再用等体积的乙酸乙酯萃取3次，合并酯相，在35 ℃条件下氮气吹干；最后用流动相定容至1 mL，溶液经0.45 μm的微孔滤膜过滤后进行高效液相色谱测定。

用植物RNA提取试剂盒提取水稻籽粒总RNA。利用NanoDrop 1000分光光度计（NanoDrop 技术公司，美国）检测RNA的纯度和浓度。采用PrimerScript^TM反转录试剂盒（TaKaRa公司，日本）进行RNA反转录试验。采用实时荧光定量聚合酶链式反应（real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction, RT-qPCR）系统（Roche公司，美国）进行基因检测。在96孔板上利用SYBR Premix Ex Taq^TM Ⅱ（TaKaRa公司，日本）法以cDNA为模板进行PCR反应，每个样品3次重复。PCR反应采用20 μL体系，包括SYBR PremixEx Taq^TM Ⅱ（10 μL），0.6 mmol/L正反向引物和1 μL cDNA。PCR扩增条件为：95 ℃预变性30 s；95 ℃变性5 s，56 ℃退火20 s，进行45个循环。每次PCR循环结束后进行熔解曲线分析，以线性方式从65 ℃升温至95 ℃。以OsActin为内参基因，采用2^－ΔΔCt法计算脱落酸代谢及信号传导相关基因OsNCED1、OsNCED3、OsNCED4、OsZEP1、OsAAO2、OsAAO3、OsABA8ox1、OsABA8ox2、OsPYL3、OsPYL5、OsPYL9、OsPP2C2、OsPP2C3、OsSnRK2、OsDREB1c、OsDREB1f和OsDREB2a的表达量。脱落酸代谢及信号传导相关基因表达量的PCR验证所用引物由Primer 5.0软件设计，引物序列信息如表1所示。

试验所得数据用SAS 8.0软件进行统计分析，多重比较采用最小显著差异法（least significant difference, LSD，α=0.05），百分率数据在分析前进行反正弦转换（y=arcsin [sqrt (x/l00)]）。

由表2可知，在12个早稻种子样品中，每个早稻品种的2个种子批均表现出显著的活力差异。‘株两优06’（ZLY06）、‘株两优101’（ZLY101）、‘中早39’（ZZ）、‘金早47’（JZ）、‘中嘉早17’（ZJZ）和‘甬籼15’（YX）高活力种子批的发芽势（GE）、发芽率（GP）、发芽指数（GI）与活力指数（VI）均显著高于低活力种子批。在田间出苗试验期间，2018年4月7日—9日与2018年4月14日—18日田间最低气温均低于15 ℃（图1），田间出苗率在每个品种种子批之间的差异表现更为明显，6个品种高活力种子批的田间出苗率为66.35%～79.30%，而低活力种子批则为43.34%～69.71%（表2）。

相关性分析结果（表3）表明，12个早稻种子样品的发芽势、发芽率、发芽指数、活力指数均与田间出苗率显著相关（P＜0.01），其相关系数在0.628～0.778之间。相比于发芽势（0.704）与发芽率（0.628），发芽指数（0.723）、活力指数（0.778）与田间出苗率的相关系数更高。此外，发芽势、发芽率、发芽指数、活力指数两两之间的相关系数均大于0.801，达到0.001水平相关。

18 ℃发芽4 d和5 d的发芽率与田间出苗率有较好的相关性，其相关系数分别达到了0.932（P＜0.001）与0.817（P＜0.001）；而在发芽6 d之后的发芽率与田间出苗率均无显著相关性。15 ℃发芽5～7 d的发芽率与田间出苗率的相关系数均达到显著水平（P＜0.05），在发芽8 d后的发芽率与田间出苗率均无显著相关性。12 ℃发芽不同天数的发芽率与田间出苗率均无显著相关性，其相关系数只分布在0.304～0.426之间（表4）。

为进一步评估低温发芽试验测定早稻种子活力的效果，试验选取了18 ℃低温发芽第4—5天的发芽率与田间出苗率做回归分析。结果（图2）显示：18 ℃低温发芽4 d的发芽率与田间出苗率的回归系数为0.852，表明18 ℃低温发芽4 d的发芽率能够有效地预测早稻种子田间出苗情况；而18 ℃低温发芽5 d的发芽率与田间出苗率的回归系数仅为0.703，其预测效果差于4 d的发芽率。

为了进一步研究低温发芽试验测定早稻种子活力的生理机制，试验选取了18 ℃发芽4 d的水稻样品，测定了其GA与ABA含量（图3）。在18 ℃发芽4 d，ZLY06、ZYL101、ZJZ、YX的高活力种子批中ABA含量均显著低于低活力种子批，而ZZ与JZ种子的ABA含量在高低种子批之间无显著差异。此外，不同水稻品种之间ABA含量也有所差异（图3A）。

相比于ABA含量，GA含量在6个水稻品种高低活力种子批之间的差异不具规律性。在18 ℃发芽 4 d，JZ高活力种子批中GA含量显著高于低活力种子批。相反的，ZLY06与ZZ高活力种子批中GA含量均显著低于低活力种子批，而ZLY101、ZJZ与YX种子批之间GA含量无显著差异（图3B）。

GA/ABA比例在ZLY06、ZLY101和JZ种子批之间存在显著差异，且都表现为高活力种子批显著高于低活力种子批，其上调倍数分别为2.12、1.79和1.35。而ZZ、ZJZ与YX种子批在GA/ABA比例上无显著差异（图3C）。相关性分析结果表明，18 ℃发芽4 d水稻种子GA/ABA比例与当天的发芽率及田间出苗率均表现为显著的正相关关系（表5）。

为了进一步研究ABA代谢及信号传导过程是否影响低温条件下早稻种子活力，试验选取了18 ℃发芽4 d种子批之间发芽率与ABA含量差异较大的3个水稻品种（ZLY06、ZLY101和ZJZ），测定了ABA代谢相关基因和ABA信号传导相关基因的表达量。

在18 ℃发芽4 d，ZLY06、ZLY101和ZJZ高活力种子的9-顺式环氧类胡萝卜素双加氧酶基因OsNCED1、OsNCED3与玉米黄质氧化酶基因OsZEP1表达量均显著低于低活力种子（图4A～B、D）。OsNCED4在ZJZ高活力种子中表达量显著低于低活力种子，在ZLY06、ZLY101高低活力种子批之间无显著差异（图4C）。而ABA醛氧化酶基因OsAAO2与OsAAO3表达量在ZLY06与ZJZ高低活力种子批之间无显著差异，仅在ZLY101高活力种子中观察到OsAAO3的表达量显著降低（图4E～F）。此外，ABA分解代谢关键酶8’-羟化酶基因OsABA8ox1与OsABA8ox2在ZLY06、ZLY101高活力种子中表达量均显著高于低活力种子，但是在ZJZ高低活力种子批之间无显著差异（图4G～H）。

18 ℃发芽4 d，不同水稻品种高低活力种子的ABA信号传导相关基因的表达模式也存在差异（图5）。ABA受体合成基因OsPYL3与OsPYL5表达量在ZLY101和ZJZ高低活力种子批之间有显著性差异（图5A～B），ABA受体合成基因OsPYL9在高活力种子中表达量均显著高于低活力种子（图5C），而2C类蛋白磷酸酶基因OsPP2C2、OsPP2C3在高活力种子中表达量均显著低于低活力种子（图5D～E）。SNF1相关的蛋白激酶2基因OsSnRK2在ZLY101高活力种子中表达量是低活力种子的3.81倍（图5F）。同时，ZLY06高活力种子中转录因子OsDREB1c、OsDREB1f和OsDREB2a的表达量亦显著高于低活力种子（图5G～I）。

本研究表明，标准发芽试验的发芽势、发芽指数与活力指数在各早稻品种高低活力种子批之间均存在显著差异，且均与田间出苗率呈显著正相关，说明这3个指标可以作为早稻种子活力衡量的指标。

水稻是喜温作物，早稻在直播或育秧阶段容易遭受低温胁迫并影响田间出苗情况^[11,12]。低温发芽试验也是一种常见的种子活力测定方法，可用于低温早播作物的活力测定^[13]。笔者之一对水稻种子活力测定的结果表明，3个杂交水稻品种在18 ℃低温发芽10 d的发芽率与田间出苗率显著相关，可以作为测定水稻种子活力的方法之一^[6]。本研究发现，在田间出苗试验期间，2018年4月7日—9日与2018年4月14日—18日田间最低气温均低于15 ℃，表明这12个早稻种子样品在田间出苗试验中遭受了低温胁迫。12个早稻种子样品18 ℃低温发芽第 4—5天的发芽率与田间出苗率有较好的相关性，其相关系数（0.932与0.817）显著高于发芽势、发芽指数、活力指数与田间出苗率的相关系数（0.704～0.778），其回归系数（0.852与0.703）也分别达到了极显著水平，可以作为预测早稻田间出苗的有效指标。此外，15 ℃低温发芽5～7 d的发芽率与田间出苗率也显著相关，但是其相关系数较小。12 ℃下12个早稻种子样品发芽速度与发芽率受到严重抑制，其不同天数的发芽率与田间出苗率均无显著相关性，说明12 ℃的低温发芽试验不能用于早稻种子活力的测定。以上结果表明，在早稻直播或田间育秧易遭受低温胁迫的情况下，18 ℃低温发芽试验可以更加准确有效地测定早稻种子活力。

赤霉素（GA）是调控水稻种子萌发的一类重要植物激素。GA能打破种子休眠，促进种子萌发，使种子在适宜的环境和合适的时间萌发，并为随后的幼苗生长做准备^[14]。在18 ℃发芽4 d，12个早稻种子样品的内源GA含量与发芽率、田间出苗率无显著相关关系。同一品种高低活力种子样品之间也没有统一的规律，这表明18 ℃发芽过程中GA与早稻种子活力对低温胁迫的响应关系尚不明确。

脱落酸（ABA）是另一类调控种子萌发的植物激素，也在低温逆境中起到重要的调控作用。一般而言，高浓度的ABA含量会诱导种子休眠，抑制种子萌发；而低温下提高ABA含量可以放大ABA信号传导，并诱导下游低温响应基因的表达，从而提高植物对低温的抗性^[15]。但也有研究表明，低温胁迫下相对较低浓度的ABA含量有利于提高水稻的低温抗性。HUANG等研究表明，过表达OsNAC095提高了水稻内源ABA含量，却增强了水稻对低温胁迫的敏感性^[16]。本研究结果显示，不同早稻品种高活力种子批中ABA含量均低于低活力种子批，且相关分析结果表明ABA含量与发芽率、田间出苗率呈显著负相关，说明一定范围内低浓度的ABA含量有利于提高水稻种子在低温条件下萌发的能力。与ABA含量结果一致的是，荧光定量PCR结果显示，一系列ABA合成相关基因（OsNCED1、OsNCED3、OsZEP1和OsAAO3）在低活力种子批中高度表达，而ABA分解相关基因在高活力种子批中高度表达，表明低温胁迫可以在转录水平调控水稻种子ABA代谢，并进一步影响水稻种子发芽能力。

水稻在长期的进化过程中产生了一系列响应低温胁迫的机制。水稻响应低温胁迫的信号传导过程主要包括不依赖ABA的信号传导途径与依赖ABA的信号传导途径。ABA受体PYL、负调控因子PP2C、正调控因子SnRK2与转录因子DREB等组分共同组成了ABA的信号通路^[17,18,19]。水稻种子在遭受低温胁迫后，内源ABA与PYL受体结合，与PP2C互作，并抑制PP2C与SnRK2的结合，SnRK2进一步磷酸化DREB转录因子，最终诱导ABA响应基因的表达，从而完成水稻对低温的响应过程^[15]。本研究结果显示，ABA受体合成基因OsPYL9与SNF1相关的蛋白激酶2基因OsSnRK2在高活力种子中表达量均高于低活力种子，而2C类蛋白磷酸酶基因OsPP2C2、OsPP2C3在高活力种子中表达量均显著低于低活力种子。同时，ZLY06高活力种子中转录因子OsDREB1c、OsDREB1f和OsDREB2a的表达量亦显著高于低活力种子。TIAN等研究表明，过表达ABA受体合成基因OsPYL3和OsPYL9均能显著提高水稻耐冷性^[20]，本研究结果与此一致。水稻中过量表达DREB1亚家族的OsDREB1D、OsDREB1F均能提高水稻对低温的耐受性^[21,22]。本试验与其他研究结果均表明，高表达丰度的ABA信号传导基因可能是水稻种子在低温胁迫下保持高水平种子活力的重要原因。

本研究表明，18 ℃发芽4 d的发芽率可以准确地预测早稻的田间出苗率，可作为测定早稻种子活力的有效指标。而高低活力种子样品之间ABA代谢、信号传导及其对低温胁迫响应基因表达量的差异，可能是低温胁迫下早稻种子活力差异的重要原因。