禽网状内皮增生病毒囊膜基因gp90的克隆表达及ELISA方法的初步建立
根据禽网状内皮组织增生症病毒( reticuloendotheliosis virus ,REV) SNV 株前基因组cDNA 序列,经生物信息学分析,设计并合成引物,以四川分离株REV-SC1 为模板,扩增囊膜基因gp90 抗原性、亲水性较高的121 ~ 1 023 bp 基因片段;将目的基因克隆至pMD-19T 载体,进行测序和比对;将基因片段按正确的阅读框架定向克隆至pET-32a( + ) ,转化大肠杆菌BL21(DE3) ,以IPTG 诱导表达,包涵体洗涤纯化,探讨以重组gp90 蛋白为包被抗原初步建立检测REV 的间接酶联免疫吸附试验( ELISA)方法.结果表明:1)REV-SC1 株gp90 核苷酸序列与在GenBank 上已发表序列的同源性最高为99% ,于231 位、870 位发生了2 个碱基突变;2)SDS-PAGE 分析表明表达蛋白分子质量约为45 ku ,与预期分子质量大小相符;免疫印迹(Western-blot)结果表明重组蛋白具有生物学活性;3) 间接ELISA 检测方法的最佳抗原包被质量浓度为1 .5mg.mL -1 ,一抗稀释度为1 ∶ 320 ,临界值为0.126 ;特异性、敏感性试验结果良好.综上,本试验成功表达了REV gp90 蛋白,并对其在ELISA 检测方面的应用作了初步探讨.