1 实验部分
1.1 仪器设备和试剂
Agilent1260高效液相色谱仪(配二极管阵列检测器)；Agilent6460液相色谱串联质谱仪；Agilent7000C气相色谱质谱仪；乙腈、甲醇、异丙醇（色谱纯，Merk公司）；正己烷（色谱纯，Tedia公司）；无水硫酸钠、乙酸铵（国药集团化学试剂有限公司）；试验用水为Milli-Q超纯水。标准物质：地西泮（纯度99.8%，中国药品生物制品检定所）。
地西泮标准溶液的配制：准确称取10.0 mg地西泮标准品于10.0 mL容量瓶中，用甲醇溶解定容后，混合均匀，－18℃冷冻储存，溶液可以完好保存6个月。准确吸取100.0 μL地西泮标准储备液于100.0 mL容量瓶中，用甲醇定容，得到地西泮标准中间溶液。分别吸取50.0，100.0，200.0，400.0，800.0 μL地西泮标准中间溶液于10.0 mL容量瓶中，用甲醇定容，得到LC-MS/MS和GC-MS的标准系列溶液；分别吸取1.0，2.0，4.0，8.0 mL的地西泮标准中间溶液于10.0 mL容量瓶中，用甲醇定容，得到HPLC的标准系列溶液。
1.2 色谱条件
HPLC法：色谱柱为SunFire C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm，Waters公司）；柱温30 ℃；进样量30 μL；流动相为0.02 mol·
L-1 乙酸铵水溶液：乙腈（40：60，体积比）；流速1.0 mL·min-1 ；检测波长为230 nm。LC-MS/MS法：色谱柱为Accucore C18柱（150 mm×2.1 mm，2.6 μm，Thermo公司）；柱温35 ℃；进样量20 μL；流动相为0.01 mol·
L-1 甲酸铵水溶液(A)和甲醇（B），梯度洗脱步骤为0.0 ~2.0 min，70%A+30%B；2.0~9.0 min，40%A+60%B；9.0~15.0min，35%A+65%B；15.0 ~ 20.0 min，70%A+30%B；流速0.2 mL·min－1 ；电喷雾离子源（ESI）；正离子多反应监测（MRM）模式；源电压4 000 V；毛细管温度400 ℃；鞘气流速11 L·min-1 。GC-MS法：色谱柱为DB-5MS柱（30 mm×0.25 mm，0.25 μm，Agilent公司）；载气为氦气；载气流速0.9 mL·mi
n-1 ；进样口温度290 ℃；程序升温步骤为初始温度150 ℃，保持1 min后以10 ℃·min-1 程序升温至290 ℃，保持4 min；进样量1 μL，恒流模式，不分流；电子轰击离子源（EI）；电子轰击能70 eV；离子源温度230 ℃；四级杆温度150 ℃；溶剂延迟9 min。LC-MS/MS法的监测离子及碰撞能量、GC-MS法的监测离子见表1。
1.3 样品前处理
准确称取2.00 g均质粉碎后的试样（精确到0.01 g），加无水硫酸钠5 g和20.0 mL乙腈，摇匀后超声提取15 min，4 000 r·mi
n-1 离心5 min，取上清液于鸡心瓶中，再在残渣中加入20 mL乙腈重复超声提取1次，离心后合并2次的上清液，加10 mL异丙醇，50 ℃减压旋转蒸至近干，用5 mL甲醇-水（体积比2:8）溶解。C18 固相萃取柱依次用5 mL甲醇，5 mL水，5 mL甲醇-水（体积比2:8）平衡，将上述溶液上样，用5 mL甲醇-水（体积比2:8）洗涤鸡心瓶，用鸡心瓶洗涤液淋洗小柱，抽干后用6 mL甲醇-乙酸溶液（体积比70:30）洗脱，收集洗脱液。将收集的洗脱液等分为3份，在50 ℃水浴，氮气吹至干，分别用甲醇溶解并定容至2.0 mL，经0.22 μm微孔滤膜过滤，滤液分别供高效液相色谱、气相色谱质谱法、液相色谱/串联质谱测定。2 结果与讨论
2.1 样品前处理方法优化
目前，对动物源性食品中镇静剂类兽药残留分析的前处理方法主要有2种：一种是经过有机试剂提取后，通过液液分配去除脂肪进行分析；另一种是通过有机试剂反复提取后，经固相萃取净化后进行分析。其中，固相萃取净化法因具有净化效果好、操作简便、对仪器要求低等优点，已成为主要的分析方式。朱馨乐
等[16] 建立了一种猪尿中镇静剂的前处理方法，该方法简单易行，但需要易制毒-2类的三氯甲烷作为洗脱液，存在一定的危险性。而动物样品成分复杂，若前处理操作不当，极易产生基质效应。本研究发现，固相萃取的洗脱液中甲醇量对净化效果影响显著，甲醇量越高，洗脱的杂质越多，造成的基质效应越强；但甲醇量过低会导致洗脱效率低下，甚至无法洗脱分析物。本研究在保证回收率的前提下，利用LC-MS/MS法深入探讨了洗脱液中不同甲醇量对回收率的影响，结果见表2（为便于理解和计算，所有加标量均用整数表示）。由表2知，洗脱液中甲醇体积比为70%时，地西泮回收率达到最佳。同时，利用HPLC法以及GC-MS法验证不同体积比甲醇-乙酸溶液的洗脱效果，结果与LC-MS/MS法一致，详见表3。因此，本研究采用体积比为7：3的甲醇-乙酸溶液作为洗脱液进行下一步探索。表2 不同配比洗脱液对地西泮回收率的影响(n=3，LC-MS/MS法)
Table 2 Influence of eluent compositions on the recovery of diazepam by LC-MS/MS (n=3)
甲醇/乙酸溶液（V/V）
Methanol/Acetic acid solution（V/V）
40/60 50/50 55/45 60/40 65/35 70/30 75/25 80/20 85/15 90/10 添加量Spiked / (ng· g-1 )50.00 50.00 50.00 50.00 50.00 50.00 50.00 50.00 50.00 50.00 测得量Found / (ng· g-1 )34.83 36.64 44.47 43.82 46.84 49.25 46.02 42.98 54.64 60.38 回收率Recovery / % 69.65 73.28 88.94 87.63 93.68 98.50 92.04 85.96 109. 28 120.76 表3 不同配比洗脱液对地西泮回收率的影响(n=3, HPLC法及GC-MS法)
Table 3 Influence of eluent compositions on the recovery of diazepam by HPLC and GC-MS (n=3)
甲醇/乙酸溶液（V/V）
Methanol/Acetic acid solution（V/V）
气相色谱-质谱法 （GC-MS） 高效液相色谱法 （HPLC） 50/50 60/40 70/30 80/20 90/10 50/50 60/40 70/30 80/20 90/10 添加量Spiked / (ng· g-1 )50.00 50.00 50.00 50.00 50.00 300.0 300.0 300.0 300.0 300.0 测得量Found / (ng· g-1 )45.86 44.87 46.97 46.51 53.83 270.0 283.5 291.3 290.6 281.2 回收率Recovery / % 91.71 89.74 93.94 93.01 107.65 90.01 94.50 97.09 96.85 93.73 2.2 线性范围、检出限和定量限
配制地西泮的标准工作溶液并对其进行测定，以仪器响应的峰面积A为纵坐标，以地西泮的浓度C为横坐标进行线性拟合，并在空白样品中添加地西泮标准溶液，以3倍信噪比（S/N=3）确定方法的检出限(LOD)，以3倍检出限确定方法的定量限(LOQ)。 最终确定质谱仪器的LOD为0.5 μg·k
g-1 ，HPLC的LOD为10.0 μg·kg-1 。 由于质谱类仪器的灵敏度远高于色谱仪器，两者的LOD相差约20倍，故选择了不同范围的标准工作曲线进行线性拟合。结果表明，在不同仪器条件下，地西泮在各自浓度范围内的线性关系良好，相关系数（r2）均大于0. 999，具体数值见表4。表4 不同仪器方法下地西泮的线性范围、回归方程、相关系数、检出限和定量限
Table 4 Linearity range, regression equation, correlation, LOD and LOQ of diazepam with different instruments
使用仪器 线性范围
Linearity range/
(ng·m
L-1 )回归方程
Regression equation
相关系数
Correlation
检出限
Limit of detection/
（μg·k
g-1 ）定量限
Limit of quantitation/
（μg·k
g-1 ）LC-MS/MS 5.570~89.120 A=54 069.9C+9 964.60 0.999 2 0.5 1.5 GC-MS 5.570~89.120 A=2 137.69C-949.74 0.999 2 0.5 1.5 HPLC 111.40~1 114.00 A=0.330 13C+0.155 66 0.999 9 10.0 30 2.3 回收率和精密度
对猪肉、猪肝、鸡肉样品进行地西泮回收率实验，质谱类仪器的添加水平分别为15.0 ，30.0 和60.0 ng·
g-1 ，液相色谱仪器的添加水平分别为100.0，300.0，500.0 ng·g-1 ，使用优化的前处理方法处理样品，每一添加水平各重复3次（猪肉样品添加水平重复6次以考察实验方法的精密度），平均回收率和RSD均良好，详见表5。表5 不同检测方法测定的动物源性食品中地西泮的加标回收率
Table 5 Recoveries of diazepam in animal original foods by different methods
加标水平
Spiked/
(ng·
g-1 )猪肉（n=6）
Pork
鱼肉
Fish
LC-MS/MS GC-MS HPLC LC-MS/MS GC-MS HPLC 回收率/
%
RSD/
%
回收率/
%
RSD/
%
回收率/
%
RSD/
%
回收率/
%
RSD/
%
回收率/
%
RSD/
%
回收率/
%
RSD/
%
LC-MS:15.0
GC-MS:15.0
HPLC:100.0
93.8 6.54 95.6 6.12 97.3 2.53 88.7 5.55 90.0 5.42 91.6 3.47 LC-MS:30.0
GC-MS:30.0
HPLC:300.0
96.2 4.31 91.5 8.02 92.0 2.55 90.1 5.04 92.5 5.24 87.0 0.52 LC-MS:60.0
GC-MS:60.0
HPLC:500.0
96.8 3.25 95.0 2.56 94.5 2.34 93.7 4.82 91.7 3.25 96.4 0.58 加标水平
Spiked/
(ng·
g-1 )鸡肉
Chicken
牛肉
Beef
LC-MS/MS GC-MS HPLC LC-MS/MS GC-MS HPLC 回收率/
%
RSD/
%
回收率/
%
RSD/
%
回收率/
%
RSD/
%
回收率/
%
RSD/
%
回收率/
%
RSD/
%
回收率/
%
RSD/
%
LC-MS:15.0
GC-MS:15.0
HPLC:100.0
93.2 7.36 87.9 6.30 95.2 2.84 96.3 4.12 95.8 7.13 87.9 3.29 LC-MS:30.0
GC-MS:30.0
HPLC:300.0
93.7 8.20 84.6 5.20 90.7 3.47 97.8 5.52 94.9 9.44 94.2 1.45 LC-MS:60.0
GC-MS:60.0
HPLC:500.0
98.1 2.22 94.5 5.18 92.0 3.03 99.0 1.27 98.4 1.38 94.7 1.56 2.4 3种检测方法比较
我国现行食品标准规定的动物源性食品中地西泮的检测方法主要有：GB 29697—2013 《食品安全国家标准动物性食品中地西泮和安眠酮多残留的测定气相色谱-质谱法》、SB/T 10501—2008 《畜禽肉中地西泮的测定高效液相色谱法》、SN/T 2113—2008 《进出口动物源性食品中镇静剂类药物残留量的检测方法液相色谱-质谱/质谱法》等，涉及的主要检测方法有气相色谱-质谱法、液相色谱-串联质谱法和高效液相色谱法。不同的标准规定的前处理方法不尽相同，虽然均采取有机试剂提取后通过固相萃取柱净化的方法，但在部分步骤上差异较大，例如气相色谱-质谱法需要加正己烷脱脂，而液相色谱-串联质谱法则省略了旋蒸的步骤并使用HLB固相萃取柱进行净化。各种前处理方法各有优劣，均不利于实验室仪器比对。因此，对每种方法进行总结归纳，并创建一种统一的方法进行样品前处理就显得格外重要。为此，本文首先尝试对不同的固相萃取柱进行比较，结果表明：在最优化前处理条件下，使用C18固相萃取柱的平均回收率为98.5%，而使用HLB固相萃取柱的平均回收率为89.7%，因此，本研究选择采用C18固相萃取柱作为净化柱；其次，探讨了不同的洗脱液对加标样品回收率的影响，最终确定用甲醇-乙酸溶液（体积比70:30）作为洗脱液，同时也证明优化后的方法并不需要正己烷脱脂这一步骤；最后比较了3种仪器方法对基质效应、回收率、灵敏度等参数的影响，从表4中可以看出，用质谱法检测时，回收率的相对标准偏差波动较大（0.78%~9.44%），说明即使采用优化后的前处理方法，在不同基质条件下，回收率仍易受基质效应的影响，因为质谱法的灵敏度较高，检出限和定量限较低，在加标浓度较低的情况下，微小的波动也会使结果有较大的变化；而用高效液相色谱法检测时，回收率的相对标准偏差比较稳定（均小于3. 5%），主要原因是色谱法的检出限较高，当加标浓度较高时，基质效应对结果的影响可以忽略。同时也可以看出，色谱法的灵敏度较低，无法满足痕量检测的要求。
3 结论
采用高效液相色谱法、液相色谱-串联质谱法及气相色谱质谱法对动物源性食品中的地西泮进行检测。方法简单快捷，准确率和精密度高，适用于动物源性食品中地西泮的定量检测。同时探讨了不同配比固相萃取洗脱液对地西泮回收率的影响，实验表明，当甲醇与乙酸溶液的体积比为70:30时，地西泮的回收率最高。在不同仪器条件下，地西泮在各自浓度范围内的线性关系良好，回收率和RSD值均能达到日常检测要求，故3种方法均可分析动物源性食品中的地西泮残留量。对比可知，质谱法的灵敏度和准确率高，但有一定的基质效应，适用于浓度较低的样品分析；液相色谱法操作简单，几乎不受基质效应的影响，但灵敏度和准确率不及质谱法，适用于浓度较高并对稳定性要求较高的样品的分析。研究可为检测机构合理高效地规划仪器方法提供一定的参考。
参考文献(References)
- 1
KAUR A, SINGLA N, DHAWAN D K. Low dose X-irradiation mitigates diazepam induced depression in rat brain[J]. Regulatory Toxicology and Pharmacology, 2016, 80: 82-90.doi:10.1016/j.yrtph.2016.06.004
- 2
严丽娟, 张洁, 潘晨松, 等. 超高效液相色谱-飞行时间质谱法高通量筛查乳制品中20种镇静剂[J]. 分析化学, 2013, 41(1): 31-35.
YAN L J, ZHANG J, PAN C S, et al. High throughput screening of tranquilizers in dairy products using ultra performance liquid chromatography coupled to high resolution time-of-flight mass spectrometry[J]. Chinese Journal of Analytical Chemistry, 2013, 41(1): 31-35.
- 3
CHENG L L, ZHANG Y J, SHEN J Z, et al. GC-MS method for simultaneous determination of four sedative hypnotic residues in swine tissues[J]. Chromatographia, 2010, 71(1/2): 155-158.doi:10.1365/s10337-009-1403-6
- 4
KAWANO T, OSHIBUCHI H, KAWANO M, et al. Diazepam suppresses the stress-induced dopaminergic release in the amygdala of methamphetamine-sensitized rat[J]. European Journal of Pharmacology, 2018, 833: 247-254.doi:10.1016/j.ejphar.2018.05.048
- 5
UDDIN M N, SAMANIDOU V F, PAPADOYANNIS I N. Validation of SPE-HPLC determination of 1,4-benzodiazepines and metabolites in blood plasma, urine and saliva[J]. Journal of Separation Science, 2008, 31(21): 3704-3717.doi:10.1002/jssc.200800342
- 6
徐安忆, 吴斌, 洪广亮, 等. 镇静剂在急诊危重病救治中的应用调查[J]. 医学研究, 2014, 43(4): 99-103.
XU A Y, WU B, HONG G L, et al. Application investigation of sedatives in the emergency treatment of critical care[J]. Journal of Medical Research, 2014, 43(4): 99-103.
- 7
潘玲珍, 闫智勇, 左长英, 等. 长期使用地西泮对神经活性配体受体互相作用信号通路的影响[J]. 中国药科大学学报. 2011, 42(5): 443-446.
PAN L Z, YAN Z Y, ZUO C Y, et al. Influence of long-term usage of diazepam on neuroactive ligand-receptor interaction signaling pathway[J]. Journal of China Pharmaceutical University, 2011, 42(5): 443-446.doi:10.11665/j.issn.1000-5048.20110511
- 8
徐庆, 詹尧平, 高处寒. 地西泮经皮吸收凝胶的制备与生物利用度[J]. 浙江大学学报（医学版）, 2012, 41(4): 441-444,463.doi:10.3785/j.issn.1008-9292.2012.04.014
XU Q, ZHAN Y P, GAO C H. Preparation of diazepam transdermal gel and its bioavailability[J]. Journal of Zhejiang University (Medical Sciences）, 2012, 41(4): 441-444.doi:10.3785/j.issn.1008-9292.2012.04.014
- 9
李桂敏, 宁保安, 白家磊, 等. 地西泮单克隆抗体的制备及其酶联免疫吸附检测方法的建立[J]. 食品安全质量检测学报, 2014, 5(3): 956-963.
LI G M, NING B A, BAI J L, et al. Preparation of anti-diazepam monoclonal antibody and establishment of its enzyme-linked immunosorbent assay method[J]. Journal of Food Safety and Quality, 2014, 5(3): 956-963.
- 10
谭贵良, 赵天珍, 王文林, 等. 气相色谱-质谱法同时测定腊肠中7种镇静剂类药物残留[J]. 现代食品科技, 2014, 30(2): 274-278.
TAN G L, ZHAO T Z, WANG W L, et al. Determination of seven sedative residues in sausage by gas chromatography-mass spectrometry[J]. Modern Food Science and Technology, 2014, 30(2): 274-278.
- 11
魏晋梅, 罗玉柱, 白云旭. 高效液相色谱法同时测定羊肉中的11种镇静剂类药物[J]. 食品工业科技, 2014, 35(10): 95-97，102.
WEI J M, LUO Y Z, BAI Y X, et al. Simultaneous high performance liquid chromatographic determination of 11 common sedatives in mutton[J]. Science and Technology of Food Industry, 2014, 35(10): 95-102.
- 12
SRUTHI A, TEJASWI P, THANUJA N, et al. Simple RP-HPLC method for estimation of diazepam in tablet dosage form[J]. Journal of Pharmacy Research, 2013, 6(1): 140-144.doi:10.1016/j.jopr.2012.11.029
- 13
张烁, 周爽, 陈达炜, 等. 畜肉中10种镇静剂残留的超高效液相色谱-串联质谱测定方法[J]. 分析测试学报, 2014, 33(11): 1213-1218.doi:10.3969/j.issn.1004-4957.2014.11.001
ZHANG S, ZHOU S, CHEN D W, et al. Determination of ten sedative residues in livestock products by ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry[J]. Journal of Instrumental Analysis, 2014, 33(11): 1213-1218.
- 14
ORFANIDIS A, GIKA H, MASTROGIANNI O, et al. Determination of drugs of abuse and pharmaceuticals in skeletal tissue by UHPLC–MS/MS[J]. Forensic Science International, 2018, 290: 137-145.doi:10.1016/j.forsciint.2018.07.004
- 15
李存, 皇甫伟国, 杨挺, 等. 液相色谱串联质谱法快速测定猪尿中10种镇静剂类药物残留量[J]. 分析化学, 2010, 38(7): 1015-1018.
LI C, HUANGFU W G, YANG T, et al. Rapid determination of tranquillizers residues in swine urine by liquid chromatography-tandem mass spectrometry[J]. Chinese Journal of Analytical Chemistry, 2010, 38(7): 1015-1018.
- 16
朱馨乐, 刘淇, 李丹, 等. 气相色谱-质谱法快速测定猪尿中地西泮[J]. 中国兽药杂志, 2009, 43(1): 28-30.doi:10.3969/j.issn.1002-1280.2009.01.010
ZHU X L, LIU Q, LI D, et al. Determination of diazepam in swine urine by gas chromatography - mass spectrometry[J]. Chinese Journal of Veterinary Drug, 2009, 43(1): 28-30.
- 1
摘要
采用高效液相色谱法（HPLC）、气相色谱质谱联用法(GC-MS/MS)以及液相色谱质谱联用法(HPLC-MS/MS)测定动物源性食品中镇静剂类药物地西泮的残留量。将样品均质粉碎后，经乙腈提取，固相萃取小柱净化后上机检测，外标法定量。实验证明，当固相萃取的洗脱液中甲醇与乙酸溶液的体积比为70：30时，洗脱效率最高。在不同仪器条件下，地西泮在各自浓度范围内的线性关系良好，相关系数（r2）均大于0.999，回收率在84.6%~ 101.7%，相对标准偏差（RSD）在0.52%~9.44%（n=3），检出限为0.5 μg·k
Abstract
High performance liquid chromatography (HPLC), gas chromatography mass spectrometry (GC-MS) and liquid chromatography tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) were applied to determine the diazepam residue in animal original food. Samples were detected quantitatively by external standard method through smashed homogeneously, extracted by acetonitrile as well as purified by solid phase extraction column. The highest efficiency of elution was reached when the ratio of methanol to acetic acid solution was 70:30 in volume. The linearity ranges of diazepam were all very well with different instruments, meanwhile, correlations were all above 0.999, the recoveries were between 84.6% and 101.7% with the RSDs in the range of 0.52% to 9.44% (n=3). The limit of detection was 0.5 μg·k
地西泮（Diazepam）是一种镇静剂类药物，其分子式为
地西泮对中枢神经系统有一定的抑制作用，有助于缓解抑郁和焦
目前，检测地西泮的方法主要有酶联免疫吸附法（ELISA
