泛素（ubiquitin）是一种普遍存在于真核生物中的由76个氨基酸组成的多肽^［1］。通过一系列酶将泛素分子与目标蛋白的特异性相结合，并引导其对蛋白酶体进行降解的过程称为泛素化。泛素化是一种常见的蛋白质翻译后的修饰方式，也是一种细胞内信号^［2］，在细胞分裂、自噬、消亡、DNA修复、蛋白质降解等生物学过程中具有重要调控作用。通过蛋白酶特异地从与泛素分子结合的蛋白质底物中切割泛素分子的过程称为去泛素化，这些蛋白酶即为去泛素化酶（deubiquitinating enzymes，DUBs）。迄今为止，人类基因组中已被识别的去泛素化酶有100余种，根据其氨基酸序列与保守结构域的不同，可分成6个家族：泛素特异蛋白酶（ubiquitin-specific protease，UBP，在哺乳动物中被称为USP）、泛素羧基末端水解酶（UCH）、卵巢肿瘤蛋白酶（OTU）、Machado-Joseph结构域蛋白酶（MJD）、MINDY蛋白酶（MINDY）和JAMM结构域蛋白酶（JAMM）。其中前五大家族属于半胱氨酸蛋白酶，最后一个属于锌金属蛋白酶^［3］。UBP家族成员数量最多，超过50个，且结构多样化^［4］。

UBP家族成员具有2个相似的催化残基三联体，每个三联体包含2个短且高度保守的半胱氨酸盒和组氨酸盒，是催化位点的关键部分（半胱氨酸盒中的Cys，组氨酸盒中的His和Asp/Asn）^［5］。半胱氨酸盒与组氨酸盒的区域被称为泛素羧基末端水解酶（UCH）结构域，其在空间和结构上比较保守^［6］，但不同成员UCH结构域之间的氨基酸序列不同，其氨基酸种类、数量的差异均较大^［7］。目前对UBP基因的分析主要集中在单个基因的生物功能。如发现拟南芥中AtUBP1和AtUBP2基因可能与体内异常氨基酸代谢的调节有关^［8］，AtUBP12参与了生物钟反馈调节，且可调控开花时间^［9］；哺乳动物中USP1参与了胃癌的早期阶段转化^［10］，USP24与细胞凋亡、细胞周期和DNA的损伤修复有关^［11］；USP13在小鼠单核巨噬细胞破骨分化中起重要作用^［12］。已对UBP家族进行全基因组鉴定的有拟南芥（27个成员）^［6］、毛竹（48个成员）^［13］、水稻（21个成员）^［14］等，尚未见对龙眼进行全基因组鉴定的报道。

龙眼（Dimocarpus longan Lour.），热带亚热带常绿经济型果树，因其假种皮富含多种磷质、氨基酸、维生素、类黄酮等^［15］，具有降血糖、补血健脑等作用^［16］。外界环境以及自身的遗传特性和基因的表达调控对龙眼胚胎发育具有重要影响，而龙眼的胚胎发育与树体的生长发育和果实的品质产量相关。目前已知UBP广泛存在于真核生物，能通过去泛素化作用调节生物的多种代谢过程，且已发现该家族部分成员参与胚胎生长发育，甚至会导致胚胎死亡，但关于龙眼DlUBP基因在胚胎发育中的作用尚未见报道。因此，对DlUBP基因进行分析有助于进一步了解DlUBP家族在龙眼胚胎发育中的作用。通过对DlUBP家族全基因组的鉴定，分析其基因结构、蛋白质结构、启动子顺式作用元件、进化关系，并分析龙眼体胚中DlUBP基因在不同时间梯度的脱落酸处理和干旱胁迫处理下的表达情况，以期为UBP基因家族在龙眼体胚或其他植物生长发育调控的研究提供参考。

第3代龙眼基因组数据库，龙眼转录组数据库，拟南芥（Arabidopsis thaliana）UBP家族的基因序列和氨基酸序列下载于Uniprot数据库（https：//www.uniprot.org/），甜橙（Citrus sinensis）、水稻（Oryza sativa）UBP家族的基因序列和氨基酸序列下载于phytozome数据库（https：//phytozome.html）。

龙眼体胚发生过程中的胚性愈伤组织（embryonic callu，EC）来源于福建农林大学园艺植物生物工程研究所。参照赖钟雄^［17］的培养方法，以EC为起始材料获得不完全胚性紧实结构（incomplete compact pro-embrogenic cultures，ICpEC）和球形胚（globular embryos，GE）。选择培养20 d的生长发育良好的龙眼胚性愈伤组织，分别接种于100 μmol·L^-1脱落酸（abscisic acid，ABA）、10%聚乙二醇（PEG 6000）的MS液体培养基中，于25 ℃、110 r·min^-1黑暗条件下摇床培养0，4，8，12 h，收样，液氮速冻后-80 ℃封存于冰箱，用于后续qPCR定量分析。

参照Tripue（Transgen，China）试剂盒说明书提取龙眼在EC、ICpEC、GE 3个阶段以及经ABA和PEG6000处理的RNA，再参照PrimerScript RT Reagent Kit （TaKaRa）试剂盒说明书逆转录合成qPCR所需的cDNA。

DlUBP基因在染色体上的定位：利用NCBI BLAST在线网站，将龙眼基因组数据库与模式植物拟南芥AtUBP的氨基酸序列进行同源比对，对DlUBP家族成员进行筛选，获得18条DlUBP候选序列。结合保守结构域数据库（conserved domains database，CDD）和SMART对蛋白结构域的预测分析，确定龙眼UBP基因组中存在18条DlUBP序列。参考拟南芥的命名方式，命名DlUBP基因。最后根据龙眼基因组注释信息和DlUBP基因的ID，用TBtools软件在染色体上绘制DlUBP基因的位置分布。

DlUBP基因结构及蛋白质分析：基于龙眼genome文件，用TBtools分析18个DlUBP基因的结构；从ExPASy中查询18个DlUBP基因的蛋白质等电点、分子质量和氨基酸数等，并列表分析；通过MEME在线软件分析DlUBP的保守基序，并下载XML格式的分析结果，用TBtools软件进行可视化绘图分析。根据DlUBP基因的氨基酸序列，用TBtools软件中的Batch SMART进行蛋白质结构域预测以及可视化分析。

UBP家族进化树的构建：先采用MEGA5.05软件中的邻近法（neighbor-joining method）单独对DlUBP家族进行进化分析，然后采用相同的方法构建龙眼、拟南芥、水稻、甜橙4个物种的UBP家族氨基酸序列系统进化树，自展系数法（Boot strap）设置1 000次重复检验。保存nwk格式的进化树文件，使用iTOL在线网站（https：//itol.embl.de）对进化树进行上色编辑。

DlUBP基因启动子分析：利用DlUBP基因组序列和基因结构注释信息文件，经TBtools软件提取获得18条CDS上游碱基对为2 000 bp的DlUBP序列，采用PlantCARE在线网站（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）对DlUBP基因启动子特征以及顺式作用元件的功能进行预测分析，再用Excel软件分类整理获得的数据，最后用TBtools软件对顺式作用元件进行可视化绘图。

从龙眼基因组数据库中提取18个DlUBP基因在龙眼体胚发生过程中EC、ICpEC、GE 3个阶段的特异表达每千个碱基转录每百万映射读取的碎片（fragments per kilobases per million mapped fragments，FPKM），提交至TBtools软件进行热图绘制，并分析DlUBP基因在不同体胚发生阶段的特异性表达情况。

为了解DlUBP基因在脱落酸处理和干旱胁迫处理下的表达情况，将DlUBP2、DlUBP8-1、DlUBP12-1、DlUBP12-2、DlUBP17、DlUBP19、DlUBP22-2和DlUBP23等8个基因的CDS序列通过 Primer premier 6设计正向引物和反向引物，再通过引物检测网站Beacon Designer Free Edition（http：//www.premierbiosoft.com）识别得到的引物，选出符合要求的基因，并收集其引物，见表1。20 μL qPCR体系包括10 μL HieffqPCR SYBRGreen Master Mix（Yeasen，Shanghai，China）染料，7.4 μL dd H₂O，0.8 μL正向引物和0.8 μL反向引物，1 μL cDNA模板。以elF-4a为内参基因，用Roche LightCycler 480 实时荧光定量PCR仪（Roche Applied Science，Switzerland）检测DlUBP基因在不同时间梯度的脱落酸处理和干旱胁迫处理下的表达量，采用2-ΔΔCT方法计算DlUBP基因的相对表达量，用Excel软件整理分析，并绘制柱形图。

通过与拟南芥基因组进行比对，利用CDD和SMART检测蛋白的结构域，共获得18个DlUBP基因。通过对龙眼与拟南芥、水稻和甜橙的UBP家族成员的系统进化分析，参照拟南芥家族成员的命名方法，将DlUBP家族成员分别命名为DlUBP2、DlUBP4、DlUBP5、DlUBP8-1、DlUBP8-2、DlUBP9、DlUBP12-1、DlUBP12-2、DlUBP12-3、DlUBP16、DlUBP17、DlUBP19、DlUBP21、DlUBP22-1、DlUBP22-2、DlUBP23、DlUBP25、DlUBP26。

通过分析DlUBP全基因组的蛋白质理化性质，发现UBP家族氨基酸数为369~1 117个，相差较大，除DlUBP2、DlUBP12-1、DlUBP12-2、DlUBP16外，其余基因的氨基酸数在1 000个以下；分子质量为42.11~130.80 ku；等电点为5.14~9.32，见表2。

根据染色体定位分析结果（图1），18个DlUBP基因不均匀地分布在10条染色体上。龙眼基因组已组装的染色体共有15条，其中第2，3，8，10，11号染色体上不存在DlUBP基因。定位在第1号染色体上的DlUBP基因最多，有4个，定位在第5，6，13，15号染色体上的DlUBP基因各有1个，其余5条染色体上分别有2个DlUBP基因。第12号染色体上的2个DlUBP基因的物理位置较接近，但超过了100 kb，HUANG等^［18］指出，染色体上物理位置不超过100 kb的2个及以上的同源基因为串联重复基因，因此各DlUBP基因不存在串联重复的情况。

18个DlUBP基因的内含子数、外显子数及其位置如图2所示，可知，DlUBP基因内含子数为2~31个，其中DlUBP12-1基因的内含子数最多，有31个，其次是DlUBP12-2，有30个，DlUBP2和DlUBP22-2基因的内含子数最少，均为2个，大部分DlUBP基因的内含子数在20以内。此外，DlUBP基因的长度存在较大差异，DlUBP8-2基因最长，DlUBP22-2基因最短，这可能由内含子数差异较大引起，也可能导致各DlUBP基因之间的功能有所区别。

使用MEME在线软件，搜索到25个motif（图2）。从图2中可以看出，motif 1、motif 2、motif 3、motif 5、motif 8出现的频率较高，出现在18个DlUBP基因中，说明这5个motif在DlUBP家族中较保守，其中motif 2在DlUBP8-1基因中出现了2次。其次是motif 4和motif 6，出现在17个基因中，特别是motif 6在DlUBP9基因中连续出现了2次。motif 12和motif 18出现在大多数基因中。此外，在同一个小分支上，保守基序的种类和排列基本一致，这可能与其功能的保守性有关。

蛋白质结构域预测分析结果如图3所示。由图3可知，18个DlUBP基因均含有一个UCH结构域，这体现了UCH蛋白质结构的保守性。除共有的UCH结构域，部分DlUBP基因存在特异的保守区，如DlUBP2和DlUBP22-2均有一个ZnF-UBP锌指结构，DlUBP12-1、DlUBP12-2和DlUBP12-3均有1个MATH结构域，DlUBP16、DlUBP17和DlUBP19均有1个zf-MYND锌指结构，DlUBP5、DlUBP9和DlUBP26均有1个DUSP结构域。此外，同属于一个亚家族的成员在蛋白质结构域的种类和分布上比较相似，表明龙眼UBP基因各亚家族拥有的生物学功能不同。

基于龙眼、拟南芥、水稻、甜橙的氨基酸序列，用MEGA5.05软件构建了4个物种的68条氨基酸序列系统进化树，如图4所示。参考拟南芥中AtUBP基因的分类方式^［8］，采用SAMRT蛋白质结构域分析，根据基因的蛋白质结构差异，将DlUBP基因分为10组：G1的成员为DlUBP2，G2的成员为DlUBP4，G3的成员为DlUBP5、DlUBP8-1、DlUBP8-2、DlUBP9，G5的成员为DlUBP12-1、DlUBP12-2、DlUBP12-3，G7的成员为DlUBP16、DlUBP17、DlUBP19，G8的成员为DlUBP21，G9的成员为DlUBP22-1、DlUBP22-2，G10的成员为DlUBP23，G12的成员为DlUBP25，G13的成员为DlUBP26。其中，G2成员中包含1个ZnF-UBP锌指结构，G5成员中包含1个MATH结构域，G7成员中包含1个zf-MYND锌指结构，G3部分成员中以及G13成员中包含1个DUSP结构域。

使用PlantCARE在线网站对DlUBP基因启动子序列中可能存在的顺式作用元件进行预测分析，结果如图5所示。可知，18个DlUBP基因的启动子序列均含CAAT-box和TATA-box，且CAAT-box的数量比TATA-box的多，说明DlUBP基因都能够正常转录。18个DlUBP基因均含有较多的光响应元件，大部分DlUBP基因具有厌氧诱导响应元件，响应脱落酸和茉莉酸甲酯激素应答；50%以上的基因具有干旱胁迫下MYB转录因子的结合位点和防御与应激响应元件；44%左右的基因具有低温响应元件、光胁迫下MYB转录因子的结合位点和MYBHv1结合位点；33%左右的基因响应生长素、水杨酸和赤霉素应答；少数基因具有胚乳表达、缺氧特异性诱导响应元件和参与类黄酮生物合成基因调控的MYB结合位点，参与昼夜控制和玉米醇溶蛋白的代谢调控；与种子特异调控有关的响应元件只存在于DlUBP5基因中。由此可知，DlUBP基因具有较多光响应、激素响应元件以及与植物生长发育有关的其他顺势作用元件，而且不同的基因具有的顺式作用元件的种类及数量不同，表明DlUBP基因可能在胚胎发育、种子生长、植株生长发育和抗逆等过程中有重要作用，且不同的DlUBP基因所起的作用不同。

利用龙眼基因组数据库中DlUBP基因在龙眼体胚发生过程中EC、ICpEC、GE 3个阶段的特异表达FPKM值绘制聚类分析热图（图6），发现DlUBP基因在体胚发生阶段的表达模式共有6种：（1） 在EC和GE阶段表达下调，在ICpEC阶段上调（DlUBP2、DlUBP5、DlUBP8-1、DlUBP8-2、DlUBP9、DlUBP12-1、DlUBP12-2、DlUBP17、DlUBP26）；（2） 在ICpEC和GE阶段上调，在EC阶段下调（DlUBP22-2、DlUBP19、DlUBP23）；（3） 在EC和ICpEC阶段上调，在GE阶段下调（DlUBP12-3、DlUBP21、DlUBP25）；（4） 在EC阶段上调，在ICpEC和GE阶段下调（DlUBP22-1）；（5） 在EC和GE阶段上调，在ICpEC阶段下调（DlUBP4）；（6） 在EC和ICpEC阶段下调，在GE阶段上调（DlUBP16）。整体来看，多数DlUBP基因的表达在EC阶段和GE阶段下调，在ICpEC阶段上调，推测DlUBP基因可能有助于龙眼胚性愈伤组织的分化。

DlUBP基因启动子中含有较多的脱落酸顺式作用元件，为探究DlUBP基因在脱落酸处理下的表达情况，筛选含脱落酸响应元件的6个基因：DlUBP2、DlUBP8-1、DlUBP12-1、DlUBP12-2、DlUBP17、DlUBP19，采用qPCR方法分析它们在不同时间梯度（0，4，8，12 h）脱落酸处理下的表达量，如图7所示。可知，DlUBP2、DlUBP12-1、DlUBP17基因在脱落酸处理下表达量先升高后降低，处理4 h时表达量达最高；DlUBP8-1基因在脱落酸处理下的表达量明显降低，均低于0 h对照组；DlUBP19基因的表达量随脱落酸处理时间的增加逐渐升高，在处理12 h时表达量急剧升高；DlUBP12-2基因的表达量在脱落酸处理4 h时无明显变化，在处理8 h达到最高，然后显著下降，在处理12 h时最低，且低于0 h对照组。综上所述，脱落酸能影响DlUBP基因的表达，且多数DlUBP基因的表达量在处理4 h时较高，在处理12 h时最低，猜测脱落酸处理时间较长会抑制多数DlUBP基因的表达。

为探索DlUBP基因在干旱胁迫处理下的表达水平，从18个DlUBP基因中随机挑取含干旱胁迫响应元件的6个基因：DlUBP2、DlUBP8-1、DlUBP12-2、DlUBP17、DlUBP22-2、DlUBP23，用qPCR方法分析它们在10%聚乙二醇（PEG6000）渗透调节剂模拟的不同时间梯度（0，4，8，12 h）干旱胁迫处理下的表达量，结果如图8所示。可知，随着处理时间的增加，DlUBP2、DlUBP22-2、DlUBP23基因的表达量先降低后升高；DlUBP12-2基因的表达量先降低再升高再降低，在处理8 h时表达量最高。4个基因的表达量均在处理4 h时达最低水平，低于0 h对照组，推测干旱胁迫对这4个基因的表达产生影响，且在处理4 h时抑制其表达，在处理8和12 h时促进其表达（DlUBP23的表达在处理8 h时被抑制）。此外，在干旱胁迫处理下DlUBP17的表达量均高于0 h对照组，但在处理8 h后即使增加处理时间，表达量的升高幅度也非常小，推测干旱胁迫对DlUBP17的表达有促进作用，且表达量可能在处理8 h后逐渐趋于稳定。结果表明，干旱胁迫处理影响DlUBP基因的表达，且处理时间不同，对表达量的影响亦不同。

去泛素化酶广泛存在于真核生物体内，它们在细胞内分工明确，同时相互协调，共同维护细胞内泛素化水平的稳定^［19］。目前对于去泛素化酶功能的研究尚不够深入，已知的生理功能主要有激素调控与应激反应^［20］、肿瘤与癌症的发生^［21］等，在植物体内主要调控植物的形态发生、免疫应激和信号转导和程序性细胞死亡等，在动物体内参与癌症与肿瘤^［22］的发生、神经和生殖细胞分化、DNA损伤修复等^［23］。泛素特异蛋白酶是去泛素化酶的一种，其生物学功能与去泛素化酶相似，可调节植物生长发育和对环境响应，并介导多种信号转导途径。参照拟南芥的基因分类鉴定方法，对龙眼、拟南芥、甜橙、水稻4个物种进行进化树分析，将基因分为14类。龙眼中有18个DlUBP基因，拟南芥中有27个AtUBP基因，由于龙眼与拟南芥的亲缘关系较近，猜测其生物学功能也可能较相似^［24］。DOELLING等^［25］的研究指出，缺乏AtUBP14基因会阻止拟南芥胚胎的发育甚至导致胚胎死亡，AtUBP13基因在调节根分生组织发育中起关键作用^［26］。此外，AtUBP2可能参与了体内异常氨基酸的代谢，AtUBP12能调节开花时间，AtUBP26在种子发育过程和花期中起重要调控作用等。龙眼中也有相同的UBP基因，且其蛋白质结构的相似程度较高，如DlUBP2和AtUBP2都有1个ZnF-UBP锌指结构，DlUBP12和AtUBP12都有1个MATH 结构域，DlUBP26和AtUBP26都有1个DUSP结构域，因此推测龙眼中的UBP基因有类似的功能。LEE等^［27］通过分析小鼠胚胎阶段的Northern印迹发现，USP22在多数发育的小鼠胚胎中普遍表达，且在各种成人组织和胚胎早期均有广泛表达，于是猜测其与胚胎发生有关。不仅如此，分析发现，DlUBP基因启动子含有20余种顺式作用元件，包括光响应元件、厌氧诱导响应元件、缺氧特异性诱导元件、干旱胁迫响应元件、多种激素响应元件等，且不同的DlUBP基因所含的顺式元件的种类和数量不同。DlUBP12-1和DlUBP12-3基因含有参与类黄酮生物合成基因调控的MYB结合位点，表明DlUBP基因可能参与龙眼体胚发生过程中花青素、黄酮类化合物等次生代谢产物的合成^［28］；DlUBP5基因含有细胞周期调控元件，猜测DlUBP基因可能与龙眼体胚细胞周期的调控有关。总之，18个DlUBP基因在功能上既有特异性也有互补性，共同维护龙眼正常生长发育并提高其抵御逆境胁迫的能力。

组织特异性和应激反应基因表达情况主要取决于启动子中的顺式元件，顺式元件与多种应激反应基因密切相关。分析发现，DlUBP基因启动子含有多种植物激素的响应元件，如脱落酸响应元件、赤霉素响应元件、茉莉酸甲酯响应元件、水杨酸响应元件等，这表明龙眼中的DlUBP基因可能在多种激素胁迫响应中起作用。MOON等^［13］指出，毛竹中含有与脱落酸对应的顺式元件，同时证明了有些PeUBP基因具有较高的脱落酸敏感性，推测PeUBP基因在植物发育和脱落酸胁迫响应中发挥了作用。在本研究中，随着脱落酸处理时间的增加，6个DlUBP基因中的5个表达量呈下降趋势，有些甚至低于0 h对照组，仅DlUBP19的表达量逐渐上升，由此推测DlUBP基因可能参与脱落酸的调控，且基因表达情况与处理时间有很大关系。

在胁迫条件下，脱落酸快速产生，调节气孔关闭，影响胁迫响应基因的表达。JINFENG等^［29］指出，AtUBP24是拟南芥中脱落酸信号传导和盐胁迫耐受性的负调控因子，若缺少AtUBP24基因，可能导致拟南芥在脱落酸诱导的气孔调节中对干旱胁迫的敏感性增加。不仅如此，文献［30-31］指出，在干旱胁迫下，MYB受脱落酸依赖，可通过调节胁迫增加植物的耐旱性^［30］。对龙眼DlUBP基因启动子的分析发现，50%以上的DlUBP家族成员启动子含有在干旱胁迫下MYB转录因子结合位点，且其中一半成员具有1个以上该结合位点，初步猜测DlUBP基因可能对干旱胁迫有响应。通过分析干旱胁迫处理不同时间梯度下6个DlUBP基因的表达量发现，在干旱胁迫处理不同时间后，6个DlUBP基因的表达量均呈上升或下降趋势，大部分基因的表达量在干旱胁迫处理4 h后呈上升趋势，因此推测DlUBP家族对干旱胁迫有应激反应，且适当时间的干旱胁迫处理有利于基因表达。

对龙眼泛素特异蛋白酶（UBP）进行全基因组鉴定，对体胚早期不同阶段以及在外源胁迫下的表达进行了分析。在龙眼中共鉴定出18个DlUBP基因，分析了DlUBP基因的结构、蛋白质理化性质、染色体定位、启动子顺式元件、在不同时间梯度的脱落酸处理和干旱胁迫处理下的表达情况。结果表明，DlUBP基因可能参与龙眼体细胞胚胎发育、脱落酸和干旱胁迫响应过程，可为后续对龙眼UBP家族单基因的功能验证以及外源胁迫的响应机理研究提供参考。