耶氏肺孢子菌肺炎是由耶氏肺孢子菌引起的，发生在免疫功能低下人群中的机会性感染。复方磺胺甲恶唑(TMP-SMZ)是目前临床最常用的预防和治疗肺孢子菌肺炎的药物。其中，磺胺甲恶唑(SMZ)可以结合二氢叶酸合成酶(DHPS)基因位点从而抑制DHPS的生成，甲氧苄啶(TMP)可以结合二氢叶酸还原酶(DHFR)基因位点从而抑制DHFR的生成，这两种酶都是叶酸合成过程中的必需酶，而叶酸是耶氏肺孢子菌生存所必需的[1]。研究发现，DHPS和DHFR基因突变与肺孢子菌对TMP-SMZ的耐药性相关[2-3]。耶氏肺孢子菌DHPS基因突变最早报道于1998年[4]。近年来，有关DHPS和DHFR基因突变的报道逐渐增多，但其与患者临床结局之间的相关性尚不明确。为了进一步了解耐药基因的突变机制，以及耐药突变基因引起的临床结局，本文对耶氏肺孢子菌DHPS基因突变和DHFR基因突变产生原因、分子流行病学及其与临床预后的关系进行综述。
1 DHPS和DHFR基因突变产生的原因 1.1 药物选择性压力在发达国家，由于抗逆转录病毒治疗和预防性应用抗菌药物的双重干预，艾滋病患者肺孢子菌肺炎的发病率显著下降。然而，在大量使用TMP-SMZ进行预防性治疗的同时，肺孢子菌出现了DHPS基因突变的高度流行，提示TMP-SMZ的使用可能增加了DHPS基因突变的发生率[4-5]。Hauser等[6]研究发现，接受磺胺类药物预防性治疗的患者比没有接受磺胺类药物预防性治疗的患者携带肺孢子菌DHPS基因突变体的比例更高(70.6%比16.6%)；Dini等[7]研究发现，在南非接受磺胺类药物预防性治疗的患者中，56%的患者检测到肺孢子菌DHPS突变基因。药物选择性压力对DHPS基因突变的影响在恶性疟原虫中也存在。研究发现，在磺胺多辛乙胺嘧啶选择性优势压力的存在下，恶性疟原虫中DHPS基因的突变体增加[8-9]。同样，对于DHFR基因，Queener等[10]研究结果显示，在接受药物预防性治疗后，DHFR基因更容易出现突变体(6/15比2/18)；Nahimana等[11]研究表明，接受预防性治疗的患者更可能感染具有非同义DHFR基因突变的肺孢子菌(9/15比9/18，P＜0.01)。由此推测，耶氏肺孢子菌DHPS和DHFR基因突变的出现可能是磺胺类药物选择作用的结果。
1.2 自发基因突变Ponce等[12]在没有接受磺胺类药物(TMP-SMZ或氨苯砜)预防性治疗患者的新鲜冷冻呼吸道标本中找到了肺孢子菌DHPS突变体基因。Monroy-Vaca等[13]研究证明在没有经历任何磺胺类药物选择压力的婴儿和幼儿中也流行着肺孢子菌DHPS突变体(单突变体或双突变体)，提示没有接受磺胺类药物治疗的群体也存在着肺孢子菌的突变流行。此外，Queener等[6]研究发现存在天然突变的DHFR基因。上述结果提示，并非所有DHPS和DHFR基因突变体都与药物选择性压力相关，也可能是肺孢子菌基因多态性自然发展的结果。
1.3 突变基因的可传播性有研究表明，有磺胺类药物相关肺孢子菌基因突变体定植的患者可以将其突变的基因传递给肺孢子菌肺炎的易感个体[14]。Gianella等[15]通过多位点DNA序列分型(MLST)分析同一病区的7例同种异体肾移植受者的肺孢子菌基因组的4个基因突变区(ITS1、26S、mt26S、b-微管蛋白)，发现这些患者的突变序列是相同的；Rostved等[16]研究发现，19例肾移植受者和肝移植受者感染了三种相同的肺孢子菌突变基因型(ITS、26S、mt26S)。可见在医院内免疫缺陷患者中，基因突变的可传播性具有潜在的流行病学意义。此外，Choukri等[17]研究发现，在距离患者头部1 m直径范围内，19例肺孢子菌肺炎患者中有15例(79.8%)能检测到肺孢子菌DNA，其负荷范围为7.5×103至4.5×106拷贝/m3。通过对比肺和室内空气样品中肺孢子菌的基因型，Damiani等[18]发现15个空气样品中(4个野生型样品、2个突变型样品和其他未确定基因型)的DHPS基因型与相应感染者肺部所取的基因型相同。8.8%的ICU医护人员有肺孢子菌的定植，这表明空气传播以及患者与医护人员之间传播增加了突变体的流行[19]。以上研究从不同方式、途径、传播对象等方面提示突变基因具有可传播性。
2 DHPS和DHFR基因突变的分子流行病学 2.1 DHPS和DHFR基因突变位点和分型最常见的DHPS基因突变发生在核苷酸位点165和171处，其导致密码子55(苏氨酸至丙氨酸)和57(脯氨酸至丝氨酸)处氨基酸的改变。这些突变位于磺胺结合位点，并且可以表现为单位点的突变或双位点的突变。Huang等[1]将野生型定义为M1型，55位点单突变为M2型，57位点单突变为M3型，55、57位点双突变为M4型，还有混合突变型等。Rabodonirina等[20]对112份支气管灌洗液标本进行PCR-单链构象多态性(SSCP)技术分析，结果显示67.0%为野生型基因，15.2%为57位点单突变基因型(M2)，17.8%为双位点突变基因型(M3)。除密码子55和57外，研究者还陆续发现了其他位置的突变。Long等[21]研究指出，在没有接受磺胺类药物预防性治疗的18个非HIV阳性肺孢子菌肺炎患者中，其密码子55或57的扩增测序没有检测到DHPS基因的突变，而在两个相对罕见的基因突变位点检测到了突变，即密码子98处的突变(谷氨酸被赖氨酸替代)和密码子90处的突变(天冬氨酸被天冬酰胺替代)；Dimonte等[22]在12份样本中分别找到98、131、164、171和276处五个密码子的突变。近年来，DHPS基因突变位点的报道越来越多，但这些突变位点的产生机制及与耐药的相关性仍需进一步明确。
关于DHFR基因的突变位点，目前的文献较少，尚未发现十分常见且具有临床意义的突变位点。Nahimana等[7]在11例患者中鉴定了核苷酸位点110、312和16处的非同义突变位点，其中110位点的突变最为常见。此外，他还发现核苷酸位点36、277处(特定的内含子中)的三个同义突变。Costa等[23]在27.3%(35/128)的患者中确定了9个肺孢子菌DHFR基因的突变位点。其中，31例患者在核苷酸位点检测中发现201、272、312和381处的四个同义突变；5例患者中找到5个非同义突变，即核苷酸位点38(T至C)、68(A至G)、92(C至T)、154(A至T)和200(C至T)，分别导致密码子13(亮氨酸至丝氨酸)、23(天冬酰胺至丝氨酸)、31(丝氨酸至苯丙氨酸)、52(甲硫氨酸至亮氨酸)和67(丙氨酸至缬氨酸)的突变。Queener等[6]运用动力学和结构分析方法研究得到六种DHFR基因突变类型，即S31F、F36C、L65P、A67V、V79I和I158V。总之，目前文献报道的DHFR基因突变位点多但较为分散，缺少规律性，尚需进一步研究。
2.2 DHPS和DHFR基因突变流行情况根据近几年的研究文献，我们总结了在不同条件下DHPS基因突变的流行情况(表 1)。总体来说，DHPS基因突变率发展中国家比发达国家更低[20, 24-25]。多位点微卫星基因分型分析显示，来自乌干达、美国和西班牙的肺孢子菌种群之间存在遗传分化。在含有DHPS基因突变的乌干达分离株中，与DHPS基因连锁的微卫星位点表现出抑制的杂合性，其抑制的杂合性与磺胺类药物作用引起突变的定向选择一致[26]。Le等[27]研究结果显示，与法国南部城市巴黎(18.5%)、里昂(33%)DHPS基因突变的流行率相比，法国西部布雷斯特地区的突变流行率只有3%。可见不同城市中基因突变流行状况具有不同特点，同时可能存在突变体流行的地区差异[28]。此外，对抗病毒治疗前后的艾滋病患者的DHPS基因突变流行情况进行分析，结果表明，DHPS基因突变在抗病毒治疗之前更为常见(33%比5.5%，P＜0.01)[29]；Sheikholeslami等[30]研究发现，伊朗DHPS基因的突变率为14.7%(5/34)，其中接受抗病毒治疗的HIV阳性患者DHPS基因突变率最低(1/16)，慢性阻塞性肺病患者突变率中等(1/7)；恶性肿瘤患者比率最高(3/11)。综上所述，肺孢子菌DHPS基因突变流行状况存在明显差异，不仅仅受磺胺类药物预防治疗的影响，与地区差异、抗病毒治疗、疾病本身也有关。
| 研究者 | 国家或城市 | 标本收集时间段 | 研究对象例数 | 是否预防性治疗 | DHPS基因突变率(%) |
| Rabodonirina等[20] | 法国里昂 | 1993—1996年 | 112例PCP患者，其中110例HIV感染者 | — | 33 |
| Beser等[31] | 瑞典 | 1996—2003年 | 103例PCP患者, 其中17%为HIV感染者 | — | 0 |
| Yoon等[32] | 美国 | 1997—2008年 | 301例成人HIV感染者 | 28%患者使用磺胺类药物预防性治疗 | 77 |
| Alvarez-Martínez等[33] | 西班牙 | 2000—2004年 | 188例HIV感染者 | 6%患者接受抗真菌预防性治疗 | 3.7 |
| Ponce等[12] | 智利圣地亚哥 | 2002—2010年 | 56例(PCP首发), 其中46例HIV感染者 | 否 | 48 |
| Muñoz等[34] | 哥伦比亚麦德林 | 2004—2005年 | 45例PCP患者 | — | 6.6 |
| Dini等[11] | 南非 | 2006—2007年 | 151例PCP患者 | — | 56 |
| Kim等[35] | 韩国首尔 | 2007—2013年 | 95例PCP患者, 其中13例HIV感染者 | — | 0 |
| Deng等[24] | 中国广州 | 2009—2013年 | 25例HIV感染者 | 否 | 12 |
| Sheikholeslami等[30] | 伊朗德黑兰 | 2010—2011年 | 34例PCP患者, 其中16例HIV感染者 | HIV感染者接受HAART治疗和复方磺胺甲噁唑预防性治疗 | 14.7 |
| “—”：无相关资料；DHPS:二氢叶酸合成酶；PCP：耶氏肺孢子菌肺炎；HIV：人类免疫缺陷病毒；HAART：高效抗逆转录病毒治疗. | |||||
DHFR基因突变在各地区都有较高的流行。据文献报道，在印度，DHFR基因突变率为42%[36]；在曼谷，DHFR基因突变率为61.1%[37]；在葡萄牙，DHFR基因突变率为27.3%[23]；在日本，Nagamori等[38]从27例肺孢子菌肺炎病患得到DHFR基因，发现其中59.25%具有核苷酸位点的改变。尽管DHFR有较高的流行突变率，但因其突变位点较为分散，相关研究相对较少。
3 DHPS和DHFR基因突变相关临床结局 3.1 DHPS基因突变相关临床结局Montesinos等[39]研究发现，在4例DHPS基因突变的患者中，2例对TMP-SMZ治疗无应答，提示DHPS基因突变可能与临床结局相关。Ponce等[12]研究表明，出现肺孢子菌突变体的患者在应用TMP-SMZ治疗后更容易出现不良反应，并且这些患者出现呼吸衰竭后需要比未出现突变体的患者多两倍以上的时间来维持机械通气，提示TMP-SMZ的疗效不佳。此外，有研究表明，肺孢子菌突变类型7型与肺孢子菌肺炎引起的死亡风险增加相关，但DHPS基因常见突变位点的突变对肺孢子菌肺炎患者一个月内的病死率没有影响[20]。van Hal等[40]研究表明，密码子55和57突变的DHPS基因型与严重疾病程度相关，与野生型相比，患者有创通气的比例更高，且临床结局更差。在TMP-SMZ浓度超过250 mg/L的培养皿中，相比单位点突变基因或野生型基因的菌株，肺孢子菌DHPS基因双重突变的菌株更容易出现TMP-SMZ疗效不佳的情况，提示双重突变的肺孢子菌DHPS基因可能与预防治疗失败相关[41]。由此可见，DHPS基因突变的耶氏肺孢子菌感染更容易引发患者不好的临床结局以及对TMP-SMZ的不良反应。
3.2 DHFR基因突变相关机制及结局Queener等[6]研究发现，F36C和L65P的基因型突变对甲氧苄啶药物具有较强的抗性，即对甲氧苄嘧啶的Ki值为野生型的4~100倍，这可能有助于解释临床标准治疗或预防治疗失败的原因。Cody等[42]研究表明，在肺孢子菌DHFR基因突变中，活性位点残基35和64具有关键作用，但是单独转化这两个残基不会改变人类DHFR基因对甲氧苄啶的反应，但这只是相对耶氏肺孢子菌DHFR基因而言的。此外，pj-、pc-和hDHFR基因的活性位点突变使得这些基因的蛋白产物更相似[43]。监测DHFR基因的分子多态性发现，在核苷酸位点72(A到C)的突变引起密码子24(苏氨酸到脯氨酸)的非同义突变可能导致肺孢子菌肺炎治疗失败[36]。分析单个核苷酸多态性，发现DHFR基因312处核苷酸位点胸腺嘧啶的存在与肺孢子菌肺炎患者呈现中度到高度的病毒载量有关，这可能也与耶氏肺孢子菌肺炎患者的临床结局相关[44]。总之，DHFR基因突变可能会直接或间接导致治疗失败和患者临床结局的恶化。
综上所述，耶氏肺孢子菌肺炎是免疫功能低下群体的常见机会性感染。TMP-SMZ对肺孢子菌肺炎的预防性治疗虽然大大降低了患病率及病死率，但随之出现的相关耐药基因突变引起了研究者们的关注。报道指出，DHPS及DHFR的基因突变可以引起肺孢子菌对TMP-SMZ的耐药进而影响TMP-SMZ的疗效导致患者临床结局较差。然而，肺孢子菌基因突变引起耐药的机制目前依旧不明，基因位点突变与耐药关系以及不同的位点突变引起不同的临床预后结果需进一步研究。由于临床相关因素的复杂性，基因突变是否与基础疾病及疾病严重程度相关也需进一步明确。我们相信更多基因分子水平的技术以及动力学、结构学的分类方法将会更广泛地用于临床，期待发明更加简单、便捷、经济的技术用于监测耶氏肺孢子菌突变体的流行状况，及时减少机会性感染肺孢子菌导致的临床患病率及病死率。
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