2. 浙江省宁波市医疗中心李惠利医院心胸外科, 浙江 宁波 315040
2. Department of Cardiothoracic Surgery, Ningbo Medical Center Lihuili Hospital, Ningbo 315040, Zhejiang Province, China
记忆T细胞(memory T cell)在肿瘤发生和发展过程中发挥着重要作用[1]。根据CC趋化因子受体7(CCR7)和L-选择素(CD62L)的表达，记忆T细胞可分为中央型记忆T细胞(central memory T cell，TCM)和效应型记忆T细胞(effector memory T cell，TEM), 两者相辅相成，共同发挥抗肿瘤免疫作用。非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)是肺癌最为常见的组织学类型，放射治疗是其重要的治疗方法。研究表明，手术、放化疗等传统方法在实现治疗目的的同时，对机体抗肿瘤免疫功能也具有一定的抑制作用[2-3]。为了解NSCLC患者放射治疗后记忆T细胞的变化，本研究拟以CD4+/CD8+CD45RO+CD62L+CCR7+代表TCM细胞，以CD4+/CD8+CD45RO+CD62L-CCR7-代表TEM细胞，检测放射治疗前后CD4+TCM、CD4+TEM、CD8+TCM、CD8+TEM的表达及变化，以期分析记忆T细胞对NSCLC患者预后的预测价值，并评估放射治疗对NSCLC患者免疫系统的影响。
1 对象与方法 1.1 对象收集2010年2月至2012年5月在浙江省宁波市医疗中心李惠利医院进行放射治疗的NSCLC患者46例(NSCLC组)。病例纳入标准：①年龄在18岁及以上；②经病理或痰细胞学证实为鳞癌或腺癌；③局部进展不可手术，有放射治疗指征；④无心、肝、肾等脏器合并症；⑤近期未接受任何激素或免疫抑制剂治疗；⑥签署放射治疗同意书。46例患者中，男性30例，女性16例，年龄44~74岁，平均(54±6)岁；鳞癌20例，腺癌26例；按美国癌症联合会(AJCC)的分期标准：Ⅱ期9例，ⅢA期20例，ⅢB期17例。选择同期健康体检者50名作为健康对照组，均证实无心、肝、肾等脏器疾病者，其中男性29例，女性21例，年龄34~70岁，平均(50±8)岁。
1.2 仪器和试剂电子直线加速器10MV-X线为日本三菱公司产品；BD-FACS Calibur流式细胞分析仪及CD4-Percp、CD8-Percp、CD45RO-FITC、CCR7(CD197)-PE、CD62L-APC等配套试剂为美国BD公司产品。
1.3 放射治疗方法使用电子直线加速器10MV-X线对原发灶、同侧肺门及纵隔进行垂直照射，每次200 cGy，每周五次，当剂量达到40 Gy/20 f后缩野，原发灶和转移的淋巴结的剂量达到60~70 Gy。46例患者中，36例接受了以铂类为主的同期化疗。
1.4 流式细胞术检测外周血记忆T细胞无菌采集患者清晨空腹静脉血5 mL置于EDTA二钠抗凝管待检。NSCLC组在放射治疗前、放射治疗4周和12周时各采集一次，健康对照组仅在体检当日采集一次。取100 μL保存的待检样本，将3 μL CD4-Percp、3 μL CD8-Percp、5 μL CD45RO-FITC、5 μL CCR7(CD197)-PE、5 μL CD62L-APC加入常规标记抗体，设相应的同型对照，反应30 min后加入溶血剂2 mL，5 min后进行离心处理(600×g)去除上清液，用PBS缓冲液洗涤，然后上BD FACSCalibur流式细胞分析仪检测，用CellQuest软件进行分析，结果以阳性细胞百分比表示。
1.5 随访方法随访起始时间为放射治疗结束后，截止时间为2016年5月，总生存时间为放射治疗结束至死亡或随访截止的时间，失访患者按死亡计算。本研究失访2例，随访率为95.7%。
1.6 统计学方法应用SPSS17.0统计软件进行数据分析。计量资料以均数±标准差(x±s)表示，行t检验。行单因素Cox回归分析患者临床特征及记忆T细胞变化与总生存时间的相关性，并将单因素分析中P＜0.1的因素纳入多因素Cox回归模型分析。采用Kaplan-Meier法绘制生存曲线，Log-Rank检验进行生存曲线之间的比较。P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 NSCLC患者放射治疗前后外周血记忆T细胞的变化NSCLC患者放射治疗前外周血CD4+TCM、CD4+TEM、CD8+TCM和CD4+/CD8+TEM比值较健康对照组低，CD4+/CD8+TCM比值较健康对照组高(均P＜0.05)；放射治疗4周时，NSCLC患者外周血CD4+TCM、CD4+TEM、CD8+TCM和CD4+/CD8+TEM比值较放射治疗前明显降低(均P＜0.05)，而CD8+TEM、CD4+/CD8+TCM比值升高(均P＜0.05)；放射治疗12周时，NSCLC患者外周血CD4+TCM、CD4+TEM、CD8+TCM较放射治疗4周时升高(均P＜0.05)，见表 1。提示NSCLC放射治疗初期患者表现为明显的免疫抑制，之后抑制作用有所改善，从而进一步发挥抗肿瘤作用。
| (x±s) | |||||||
| 组别 | n | CD4+TCM(%) | CD4+TEM(%) | CD8+TCM(%) | CD8+TEM(%) | CD4+/CD8+TCM | CD4+/CD8+TEM |
| 健康对照组 | 50 | 67.8±3.3 | 24.8±1.3 | 56.3±1.8 | 20.1±1.2 | 1.20±0.06 | 1.28±0.07 |
| NSCLC组 | |||||||
| 治疗前 | 46 | 51.5±2.2* | 18.5±1.2* | 30.9±1.3* | 19.7±1.2 | 1.56±0.07* | 0.98±0.05* |
| 治疗4周 | 46 | 40.8±1.5# | 15.5±1.1# | 23.3±1.1# | 22.4±1.5# | 1.80±0.04# | 0.65±0.09# |
| 治疗12周 | 46 | 44.3±2.4Δ | 16.4±1.1Δ | 26.8±1.1Δ | 21.5±1.1 | 1.61±0.09 | 0.74±0.03 |
| NSCLC：非小细胞肺癌; TCM:中央型记忆T细胞；TCM:效应型记忆T细胞.与健康对照组比较，*P＜0.05；与放射治疗前比较，#P＜0.05；与放射治疗4周比较，ΔP＜0.05. | |||||||
单因素分析结果显示，年龄、性别、组织学类型、病变部位、临床分期、CD4+TCM变化趋势、CD8+TCM变化趋势与患者总生存时间存在相关性(表 2)。多因素Cox回归分析结果显示，仅放射治疗后CD4+TCM变化趋势与NSCLC患者的总生存时间存在相关性(风险比：1.185，95%CI：1.135~2.994，P＜0.01)，见表 3。提示记忆T细胞尤其是CD4+TCM可以作为预测NSCLC放射治疗患者预后的指标之一。
| (x±s) | |||
| 因素 | 总生存时间(月) | P值 | |
| 年龄 | ＜60岁 | 36±17 | ＜0.05 |
| ≥60岁 | 27±13 | ||
| 性别 | 男性 | 35±16 | ＜0.1 |
| 女性 | 31±14 | ||
| 抽烟状态 | 是 | 27±11 | ＞0.1 |
| 否 | 30±15 | ||
| ECOG评分 | 0~1分 | 34±18 | ＞0.1 |
| 2分 | 29±13 | ||
| 组织学类型 | 非腺癌 | 30±12 | ＜0.1 |
| 腺癌 | 24±10 | ||
| 病变部位 | 中上叶 | 38±17 | ＜0.1 |
| 下叶 | 32±14 | ||
| 临床分期 | Ⅱ期 | 40±19 | ＜0.05 |
| ⅢA/B期 | 26±10 | ||
| CD4+TCM变化趋势 | 上升 | 37±18 | ＜0.05 |
| 下降 | 11±6 | ||
| CD8+TCM变化趋势 | 上升 | 29±16 | ＜0.05 |
| 下降 | 20±11 | ||
| CD4+TEM变化趋势 | 上升 | 18±8 | ＞0.1 |
| 下降 | 10±5 | ||
| CD8+TEM变化趋势 | 上升 | 21±11 | ＞0.1 |
| 下降 | 19±9 | ||
| CD4+/CD8+TCM变化趋势 | 上升 | 24±11 | ＞0.1 |
| 下降 | 22±10 | ||
| CD4+/CD8+TEM变化趋势 | 上升 | 28±13 | ＞0.1 |
| 下降 | 25±12 | ||
| ECOG:美国东部肿瘤协作组; TCM:中央型记忆T细胞；TCM:效应型记忆T细胞. | |||
| 因素 | 风险比(95%CI) | P值 |
| 年龄 | 0.777(0.543~1.012) | ＞0.05 |
| 性别 | 0.879(0.608~1.271) | ＞0.05 |
| 组织学类型 | 0.644(0.453~0.905) | ＞0.05 |
| 病变部位 | 0.783(0.515~1.182) | ＞0.05 |
| 临床分期 | 0.615(0.490~0.857) | ＞0.05 |
| CD4+TCM变化趋势 | 1.185(1.135~2.994) | ＜0.01 |
| CD8+TCM变化趋势 | 1.110(0.786~1.857) | ＞0.05 |
放射治疗后，CD4+TCM呈下降趋势者占21.7%, 存活率为23.1%，总生存时间为10.7个月(95%CI：0.29~12.41)；CD4+TCM保持稳定者占45.7%，存活率为52.7%，总生存时间为27.4个月(95%CI：0.00~31.26)；CD4+TCM上升者占32.6%，存活率为66.4%，总生存时间为37.4个月(95%CI：0.33~29.21)。各组生存曲线见图 1，曲线间差异有统计学意义(P＜0.01)。提示放射治疗后CD4+TCM呈上升状态的患者能获得更长的生存时间。
|
| NSCLC:非小细胞肺癌；TCM:中央型记忆T细胞. 图 1 NSCLC患者放射治疗后不同外周血CD4+TCM变化趋势患者的生存曲线 Fig. 1 The relationship between CD4+TCM and overall survival in NSCLC patients after radiotherapy |
记忆T细胞是T细胞进行初次免疫应答后分化形成的具有免疫记忆功能的T细胞，在二次应答时能够迅速识别并杀伤抗原，是机体内抗肿瘤特异性免疫的重要组成部分，具有更高的增殖潜能和生存能力，对凋亡耐受性强，能够介导持久的免疫应答[4-5]。按照其分子表型及功能的不同，记忆T细胞可分为TCM细胞和TEM细胞[6]。既往研究证实，记忆T细胞亚群在小鼠模型中具有不同的抗肿瘤活性[7]，两者都在抗肿瘤免疫中发挥重要作用。TCM是CD62L+CCR7+细胞，类似于初始T细胞，主要分布在淋巴组织，在抗原刺激下可转变为TEM而发挥免疫应答功能，在机体荷瘤或肿瘤转移状态下发挥免疫保护作用。TEM是CD62L-CCR7-细胞，能够表达向炎症部位迁移的趋化因子，主要分布在非淋巴组织。动物试验表明，TCM发挥的是反应性记忆，TEM发挥的是保护性记忆，能够趋向病灶处发挥效应功能。虽然TCM几乎无效应功能，但其增殖稳定且可分化成效应细胞[8]，因此从一定程度上讲，它比TEM在抗肿瘤特异性免疫中更具优势[9]。
记忆T细胞在健康人群中的分布及作用已有较多报道[10]，而其在NSCLC患者中的病理性分布和功能尚不清楚。Sheng等[11]研究发现，NSCLC患者外周血中CD8+TEM、CD4+TCM和CD4+TEM表达较健康者下降。本研究同样发现，NSCLC患者外周血中CD4+TCM、CD4+TEM、CD8+TCM表达较健康对照组低，呈现免疫缺陷状态。此外，Sheng等[11]还发现NSCLC患者外周血和转移淋巴结中CD4+TCM表达率较CD8+TCM高，而CD4+TEM则在淋巴结中占主导，具体机制尚不明确。本文资料显示，NSCLC患者外周血中TCM以表达CD4+为主，与文献报道一致而对于肿瘤浸润淋巴结中记忆T细胞的比例则需要进一步研究证实。
既往研究认为，TCM与TEM能够反映肿瘤患者的免疫状态，有助于治疗方案的制订和疗效监测[12]。传统的治疗方法，如手术、放化疗等会抑制患者的抗肿瘤免疫功能，包括对TCM细胞的杀伤[13-14]。本研究观察了NSCLC患者放射治疗后外周血中记忆T细胞的变化, 结果显示，放射治疗4周时患者外周血中CD4+TCM、CD4+TEM、CD8+TCM细胞较放射治疗前明显下降，CD8+TEM细胞明显上升，说明放射治疗初期患者表现为明显的TCM细胞与TEM细胞比例失调，TCM细胞向TEM细胞转变，呈现出典型的T细胞耗竭状态[15]。处于免疫抑制状态的NSCLC患者虽然TEM细胞表达水平较高，但功能性T细胞缺失，辅助性T细胞不足[16]，从而影响抗肿瘤的效果。而在放射治疗12周时，患者的CD4+TCM、CD4+TEM、CD8+TCM细胞表达水平又较放射治疗4周时明显上升，说明放射治疗初期存在明显的非选择性杀伤作用，之后这种细胞免疫抑制作用会有所改善。
肺癌患者单纯放射治疗的效果不理想，患者五年存活率低于17%[17]。NSCLC放射治疗患者的免疫状态呈动态变化，其对预后的预测价值值得探讨。国外学者的研究表明，肺鳞癌组织中CD45RO+记忆T细胞高表达是患者获得更长生存期的独立预测因素(风险比：2.65，95%CI：1.64~4.28，P＜0.01)[18]。本文资料显示，NSCLC患者放射治疗后CD4+TCM的变化趋势与NSCLC患者的总生存时间相关。Kaplan-Meier生存分析结果显示，放射治疗后CD4+TCM呈上升趋势者的存活率较高，总生存时间也更长。因此，初步认为可将记忆T细胞的变化作为NSCLC患者放射治疗预后的预测指标，但这一结果期待大样本、随访时间较长的研究来证实。
综上所述，记忆T细胞可以作为评估NSCLC患者免疫状态的有效指标，也可用于评估放射治疗的疗效，进而指导个体化治疗方案的制订。
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