磁标记和磁共振示踪技术的应用是近年来分子影像学领域研究的热点。双模态对比剂Molday ION^TM EverGreen(MIEG)是一种专用于细胞标记的新型超顺磁氧化铁对比剂。该对比剂具有Molday ION^TM磁性内核，同时插入了荧光染料异硫氰酸荧光素(FITC)，具有磁性和荧光的双重显像功能。本研究采用MIEG作为双模态显像探针标记大鼠骨髓来源内皮祖细胞(endothelial progenitor cells，EPC)，探讨其最佳标记浓度，追踪观察标记6周后的情况及对细胞活性的影响，并在体外采用3.0T磁共振扫描仪对不同浓度MIEG标记EPC进行T₁加权像(T₁WI)和T₂加权像(T₂WI)扫描，为EPC进入活体后的较长期(6周)活体示踪提供参考。

体质量为100 g的清洁级SD大鼠12只，雌雄不限，由浙江大学医学院附属第一医院实验动物中心提供。

MIEG为美国Biopal公司产品；淋巴细胞分离液、台盼蓝染色液、胰蛋白酶为美国Sigma公司产品；高糖DMEM为美国Hyelone公司产品；FBS为杭州四季青生物工程材料有限公司产品；血管内皮生长因子(VEGF)、碱性成纤维细胞生长因子(b-FGF)为英国PeproTech公司产品；多聚甲醛为天津傲然精细化工研究所产品。

荧光倒置显微镜为日本Olympus公司产品；Signa HDx 3.0T磁共振扫描仪为美国GE公司产品；二氧化碳培养箱为美国西盟(SIM)公司产品。

用10%水合氯醛溶液麻醉大鼠(0.3 mL/100 g)。无菌操作下取出胫骨和股骨，用PBS冲出骨髓，密度梯度离心法获得单个核细胞层，5 mL培养液(含体积分数为10%的FBS、100 U/mL青链霉素的高糖DMEM培养液，10 ng/mL VEGF、4 ng/mL b-FGF)重悬，接种于培养瓶内。倒置显微镜下观察原代细胞80%左右融合时按1:3比例传代。

用MIEG(铁的终浓度为10、20、50 μg/mL)标记原代EPC，37 ℃，体积分数为5%的二氧化碳饱和湿度孵箱内孵育16 h，用PBS洗涤三次去除未进入细胞的铁离子。

不同浓度MIEG标记EPC完成后，荧光显微镜下观察EPC内是否有FITC绿色显影，并与未标记细胞对照。三种浓度的MIEG标记EPC 16 h后进行普鲁士蓝染色，倒置显微镜下观察细胞核呈红色、三价铁离子呈蓝色表明标记成功，计算细胞质内存在蓝色颗粒的细胞的数量和比例。荧光标记率=同一视野荧光激发下发光细胞数/倒置显微镜下细胞数。至少计数500个EPC，统计染色阳性率，重复三次。

用20 μg/mL MIEG标记EPC，待细胞生长至80%~90%融合时，用0.25%胰蛋白酶+0.02%EDTA消化，以1:3传代，6周后显微镜下观察荧光强度。

MIEG标记细胞消化离心吹打呈悬液，取90 μL悬液和10 μL台盼蓝染液混匀，细胞计数板与盖玻片上、下两侧各加10 μL混匀液，未标记组方法同上。倒置显微镜下分别于细胞标记后1 d及1、2、6周观察计数100个细胞，行细胞活性检测，并与未标记细胞对照。如果细胞膜不完整、破裂，台盼蓝染料进入细胞，细胞变蓝，即为坏死；如果细胞膜完整，细胞未被台盼蓝染色，则为正常细胞或凋亡细胞。计数活细胞和坏死细胞数(着色细胞)，细胞活性(%)=(细胞总数－着色细胞数)/细胞总数×100%。

以头线圈为射频发射和接收线圈，使用Signa HDx 3.0T磁共振扫描仪扫描成像。制备不同浓度的MIEG(10、20、50 μg/mL)标记原代细胞，细胞数为1×10⁶/mL，未标记细胞及无细胞的培养基作为对照。标记后16 h分别重悬于1 mL 1%琼脂糖Ependoff管中，行T₁WI、T₂WI序列扫描，观察磁共振扫描结果，并测量不同Eppendorf管内细胞团T₁WI、T₂WI扫描序列图像上的信号强度。感兴趣区均设为0.04 cm²类圆形游标，每个感兴趣区均测量六次，取平均值，计算不同标记浓度细胞T₁WI和T₂WI序列信号强度。

采用SPSS 17.0软件进行统计学分析。实验数据以均数±标准差(x±s)表示，两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析，P < 0.05为差异有统计学意义。

原代EPC细胞贴壁缓慢，培养24 h可见少量圆形的单个核细胞附于培养皿；培养3 d后细胞贴壁较为完全，细胞多为长梭形，部分为多角形；培养第7~8天细胞形态呈现典型的“铺路石”样外观；培养12 d后至6周排列成放射状或旋涡状，细胞数量较少时为成簇分布，待细胞长满后，沿梭形或多角形的细胞长轴平行排列(图 1)。

培养3 d后细胞贴壁较为完全，细胞多为长梭形，部分为多角形；培养1周时细胞形态呈现典型的“铺路石”样外观；培养6周时细胞呈放射状或旋涡状排列，细胞数量较少时为成簇分布，待细胞长满后，沿梭形或多角形的细胞长轴平行排列.标尺=50 μm. 图 1 原代内皮组细胞培养不同时期镜下观察图片 Fig. 1 Microscopic observation of primary endothelial progenitor cells

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10、20、50 μg/mL三种浓度的MIEG标记EPC完成后，荧光显微镜下可见明显的FITC绿色荧光显影，未标记细胞内未见荧光显影。10 μg/mL MIEG标记细胞荧光显像效果欠佳，50 μg/mL MIEG标记的细胞贴壁细胞数下降，20 μg/mL的MIEG标记EPC显示荧光显影清晰明亮，且对贴壁细胞数量无明显影响，见图 2。提示20 μg/mL MIEG标记效果较好。

10 μg/mL MIEG标记的细胞荧光显像效果欠佳; 20 μg/mL的MIEG标记的细胞显示荧光显影清晰明亮，且对贴壁细胞数量无明显影响; 50 μg/mL MIEG标记的细胞贴壁细胞数下降.MIEG:Molday IOIXTM Ever Green; EPC:内皮祖细胞.标尺=50 μm. 图 2 不同浓度MIEG标记大鼠EPC 16 h时荧光显微镜下观察图片 Fig. 2 Microscopic observation of EPCs 16 h after labeled with MIEG of different concentrations

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三种浓度的MIEG标记EPC 16 h后进行普鲁士蓝铁染色，细胞内可见蓝色颗粒(图 3)，均聚集成堆，未标记细胞内未见蓝色颗粒。三组标记细胞的铁染色率分别为(98.66±23.00)%、(99.28±31.00)%和(99.88±26.00)%，MIEG标记率随浓度增加而增加(F=25.144，P＜0.01)。

蓝色为细胞质中的铁染色；红色为细胞核染色.MIEG:Molday IOIXTM Ever Green; EPC:内皮祖细胞.标尺=50 μm. 图 3 普鲁士蓝染色证明MIEG存在于大鼠EPC的细胞质内 Fig. 3 Prussian blue staining showed blue cytoplasm in MIEG-labeled EPCs

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用20 μg/mL MIEG标记EPC 6周后，肉眼观察荧光强度有一定程度降低，但荧光标记率仍达90%以上(图 4)。提示20 μg/mL MIEG可使细胞标记率在较长期(≤6周)内维持较高的水平。

镜下观察细胞荧光强度降低, 但标记率仍较高. MIEG: Molday IOIXTM Ever Green; EPC: 内皮祖细胞. 标尺=100 μm. 图 4 20 μg/mL MIEG标记6周后EPC的标记率仍达90%以上 Fig. 4 More than 90% EPCs labeled with 20 μg/mL MIEG at 6 w after labeling

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用20 μg/mL的MIEG标记EPC后用台盼蓝染色，并于标记后1 d及1、2、6周观察计数(表 1)。结果显示，MIEG标记和未经MIEG标记的EPC的活性差异无统计学意义(均P＞0.05), 且不同时间点之间EPC活性差异也无统计学意义(均P>0.05)，提示MIEG标记后不会影响细胞的活性。

测量不同Eppendorf管内细胞团T₁WI、T₂WI扫描序列图像上的信号强度，分别进行邻近两组感兴趣区T₁WI信号强度和T₂WI信号强度差异比较，结果显示T₁WI细胞信号强度无明显差异，T₂WI信号强度随MIEG浓度的增加而减少(图 5)，差异有统计学意义，见表 2。

1：无细胞的培养基；2：未标记的EPC；3：10 μg/mL MIEG标记的EPC；4：20 μg/mL MIEG标记的EPC；5：50 μg/mL MIEG标记的EPC.MIEG:Molday IOIXTM Ever Green; EPC:内皮祖细胞. 图 5 不同浓度MIEG标记原代大鼠EPC 16 h体外磁共振信号强度比较 Fig. 5 Signal intensity on T1 and T2 weighted images of primary EPCs 16 h after labeled with different concentrations of MIEG

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肿瘤血管的生成是其生长、转移和复发的关键。肿瘤细胞的生存有赖于其完整的血供。EPC是血管内皮细胞的前体，具有向血管内皮细胞分化的潜能。健康人的外周血中EPC含量很少，而肿瘤患者骨髓中的EPC被动员到外周血循环中，促进肿瘤血管新生及内皮细胞的修复，或分泌VEGF等促进局部缺血组织的血管新生^[1]。EPC的这种功能为肿瘤的治疗、抑制肿瘤进展带来了新的契机。倘若可以阻止肿瘤对EPC的动员，或将其作为载体携带肿瘤抑制基因或抗癌药物，则可限制肿瘤的生长，为抗肿瘤治疗开辟新的视角。

研究表明，体外分离大鼠骨髓单个核细胞后在培养基中加入VEGF和b-FGF可培养出稳定扩增的内皮祖细胞^[2]；而研究EPC的动员过程及归巢需要一种直观的较长期内可持续观察的显像方法。在显像方法方面，分子影像学方法中磁共振活体示踪的应用较为广泛。磁共振可直观观察细胞的动态迁徙过程，且对比度好，能反映组织器官的解剖信息，是细胞检测和示踪较理想的手段^[3-4]。双模态成像是磁共振中的研究热点，目前有多种超顺磁性氧化铁与不同有机荧光染料的耦合物，如Molday ION Rhodamine-B^TM[5-6]既具有磁性内核，又与罗丹明B(Rh-B)相耦合，可在磁共振显像的同时在荧光显微镜下显示红色荧光。本实验使用的MIEG也是一种磁共振双模态造影剂，是Molday ION^TM和FITC的耦合物，其内的Molday ION^TM是粒径为30 nm的超顺磁性氧化铁，能使组织T₂信号下降而产生T₂负性对比效应，而荧光单元FITC易溶于水和乙醇溶剂，最大吸收光波长为488 nm，最大发射光波长为525 nm，呈现明亮的黄绿色荧光。因此MIEG标记的细胞理论上能同时被磁共振和荧光显微镜所见，在体外更便于检测和明确细胞的标记情况，在实验动物体内既可以直观简单地在荧光显微镜下观察移植的细胞，又可以利用磁共振无创性、显示解剖信息等优点进行较长期示踪，两者相辅相成、相互验证。

本研究使用MIEG标记大鼠EPC，方法简便，细胞孵育时间16 h已能获得较高标记效率。本研究选取10、20、50 μg/mL三种浓度，通过荧光显微镜和普鲁士蓝染色观察其标记率均较高，且MIEG标记率随其浓度增高而增加。10 μg/mL MIEG标记细胞荧光显像效果欠佳、荧光强度较弱，50 μg/mL MIEG标记细胞后，虽然荧光标记率及荧光强度均高，但贴壁细胞数有所下降，提示MIEG浓度过高会影响EPC的生物学活性，而20 μg/mL MIEG标记细胞后对细胞活性基本无影响，故从荧光显影效果及细胞活性影响两方面考虑，20 μg/mL MIEG标记EPC是最适宜的标记浓度；同时体外磁共振检测表明，T₂WI信号强度随MIEG浓度增加而减少，且三种浓度标记的EPC与未标记EPC比较差异均有统计学意义，说明三种浓度MIEG标记的EPC进行体内示踪足以被磁共振T₂WI检测到，且50 μg/mL MIEG标记细胞显示的信号分辨力最高。考虑对细胞活性的影响，20 μg/mL MIEG标记EPC是进行磁共振体外示踪成像的最佳标记浓度，为EPC进行磁共振活体示踪的MIEG浓度选择奠定了基础。另外，磁共振活体示踪研究EPC的动员过程及归巢需要进行较长期的可持续观察，而目前的文献报道中，标记后的示踪时间多在1 d~2周^[7-8]。本研究以20 μg/mL浓度MIEG标记EPC达6周后，肉眼观察荧光强度虽然有一定程度降低，但荧光标记率仍达90%以上。以往的细胞磁性标记实验均着重于细胞标记的适宜浓度或细胞标记后特性的检测，而本研究在检测MIEG磁性标记的同时探讨了其较长期(≤6周)的荧光标记情况，为其在体内进行较长期的示踪提供了依据。

综上所述，本研究探讨MIEG标记EPC的可行性，结果显示，标记过程简便且标记效率高，适宜浓度的MIEG标记细胞后不影响细胞活性。结果不仅可在荧光显微镜下直接观察，也可在体外磁共振扫描显影，且标记6周仍保持较高的标记率，为细胞的磁共振及光学双成像对比剂标记示踪及较长期追踪提供了研究基础。