乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，我国近年来乳腺癌发病率正以每年3%的速度递增，成为城市中病死率增长最快的癌症，严重威胁女性的身心健康[1]。随着疾病个体化治疗的发展，精准医疗正逐渐成为肿瘤治疗的新方向，而“伴随诊断”作为精准医疗的基石也日益受到关注[2]。人类表皮生长因子受体2(human epidermal growth factor receptor 2，HER2)基因状态与乳腺癌的发生发展及治疗效果密切相关[3]。因此，检测HER2基因状态具有重要的临床价值。国内外乳腺癌HER2检测指南推荐采用荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization，FISH)检测HER2基因状态[4-5]。FISH法检测HER2基因扩增结果可作为HER2评判的金标准[6]。HER2阳性的乳腺癌患者可从HER2靶向治疗中获益；同时，HER2基因状态还可评估乳腺癌患者预后情况。
影响乳腺癌HER2基因检测的因素很多，其中标本的充分、及时和规范的固定是保障检测质量的基础。Kong等[7]报道甲醛固定液的用量及固定时间因不同组织而异。步宏和杨文涛[8]认为在FISH检测HER2基因过程中，组织固定时间过长会导致检测结果假阴性，时间不足会导致组织抗原表达的异质性。王银萍[9]认为在病理标本的制作中，固定液的体积至少仍应五倍以上于所浸泡组织体积，固定时间为6~72 h，固定不足或过度均影响免疫组织化学和分子病理的检查结果。由此可见，固定时间和固定液的量正如一辆车的两个车轮，共同决定了固定效果。在指南推荐的固定时间6~72 h，检测乳腺原发性浸润癌HER2基因状态过程中，固定液与所浸泡组织的比例目前尚无标准化的数据，即使是《乳腺癌HER2检测指南(2014版)》[4](下文简称指南)也仅给出“固定液量与所浸泡组织的比例应足够”这样一个模糊的说法，其体积比例多少才足够未明确指出。本研究使用4%中性甲醛作为固定液，根据固定液量与所浸泡组织体积的比例不同，采用FISH法检测了七组乳腺原发性浸润癌的HER2基因扩增情况，通过观察荧光显微镜下各组的大体情况，统计分析其阳性率变化趋势，为优化标本固定方法、确保HER2基因检测结果的准确性及可重复性提供实验依据。
1 材料与方法 1.1 试剂与仪器HER2探针为GLP HER2/CSP17探针, 由中国北京金菩嘉医疗科技有限公司提供。4%中性缓冲甲醛即用型固定液为广州维格斯生物科技有限公司生产。SAKURA Tissue Tek Vip-5全自动密闭式组织脱水机、DRS-2000J-D2全自动染色机均为日本樱花检验仪器株式会社生产，Thermo HM325轮转石蜡切片机为德国Thermo公司生产。尼康ECLIPSE 80i荧光显微镜为日本奥林巴斯株式会社生产。S500-24荧光原位杂交仪为美国Thermobrit公司生产。
1.2 标本来源收集南方医科大学附属中山市博爱医院2014年6月至2016年10月手术切除乳腺原发性浸润癌标本109份，患者年龄36~78岁，中位年龄为58岁，平均年龄(57.8±8.6)岁。所有患者术前未接受过靶向治疗、放化疗、内分泌治疗，术后经病理检查确诊为乳腺原发性浸润癌。根据2012版WHO乳腺肿瘤分类[10]，其中浸润性导管癌105例、经典型浸润性小叶癌2例、黏液癌1例、小管癌1例。标本离体后取组织0.3 cm×0.2 cm×0.1 cm，根据随机数字表分为A、B、C、D、E、F、G七组。使用4%中性(磷酸盐缓冲)甲醛作为固定液，从A至G组固定液量与所浸泡组织体积的比例分别为3:1、6:1、9:1、10:1、15:1、20:1、25:1。
1.3 标本处理肿瘤标本根据分组的不同在室温下使用相应量的固定液固定15 h，在全自动组织脱水机中处理。相关处理流程和时间按中华医学会相关规程进行[11]，常规石蜡包埋、切片、HE染色。由两位资深病理医师确诊，同时各组HE切片肿瘤实质与间质比例相似，以保证具有可比性。
1.4 FISH检测HER2基因参考相关文献[12-13]：玻片预处理后放入65 ℃恒温箱烤片过夜，二甲苯脱蜡后依次室温置于100%、85%、70%的乙醇各2 min，50 ℃下用质量分数为30%酸性亚硫酸钠溶液处理组织切片20~30 min。室温下氯化钠柠檬酸钠缓冲液(sodiumchloride-citric sodi, SSC)漂洗，胃蛋白酶K消化，于2×SSC溶液中漂洗，室温下将组织切片玻片依次置于梯度乙醇脱水，加热玻片至56 ℃。玻片和探针混合液在体积分数为70%的甲酰胺/2×SSC变性液中，72~74 ℃变性5 min，-20 ℃预冷的70%、85%和100%乙醇梯度脱水各3 min，玻片自然干燥，置于45~50 ℃烤片机上预热2~5 min后与探针杂交。将变性后的探针混合液10 μL滴于玻片杂交区域，将玻片置于预热的湿盒中，42 ℃保温箱中过夜杂交。将玻片置于三瓶体积分数为50%甲酰胺溶液中各漂洗10 min，将玻片置于2×SSC溶液中，漂洗10 min，将玻片置于体积分数为0.1%的NP-40/2×SSC溶液中漂洗5 min，将玻片室温浸泡在70%乙醇中漂洗3 min。干燥后滴加4′, 6-二脒基-2-苯基吲哚(4′, 6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)封固，于荧光显微镜下观察。每张切片的检测均设置阴性和阳性对照。
1.5 检测结果判断判读标准参考指南[4]，重点关注七组中使用不同量的4%中性(磷酸盐缓冲)甲醛固定液对双探FISH检测乳腺原发性浸润癌HER2基因扩增的影响：是否影响细胞核的完整性、背景洁净程度、探针信号数量和定位以及清晰度等技术问题，是否影响其基因扩增阳性率。HER2基因阴性为HER2/17号染色体着丝粒特异性探针(CSP17)比值小于2.0以下且平均HER2拷贝数/细胞小于4.0；HER2基因阳性为HER2/CSP17比值不小于2.0。结果为不确定时，由两位资深病理医师复核，阴性或不确定的标本统一归为阴性。
1.6 统计学方法采用SPSS 20.0统计软件进行统计学分析。七组HER2基因扩增阳性率的变化用卡方趋势检验，P＜0.05为有线性相关；七组之间HER2基因扩增阳性率的差异用配对资料χ2检验，P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 各组HER2基因染色结果在荧光显微镜下，A~G组细胞核经DAPI染色呈深蓝色荧光，HER2探针被四甲基罗丹明标记激发呈桔红色荧光，CSP17探针被异硫氰酸荧光素标记激发呈绿色荧光。其中A、B、C组的组织轮廓稍模糊，出现细胞碎片，部分探针定位欠佳，出现信号丢失、核发空现象，见明亮的桔红和绿荧光信号，D、E、F、G组的组织轮廓清晰而完整、背景洁净、探针定位准确，见耀眼的桔红和绿荧光信号，见图 1。提示采用FISH法检测乳腺原发性浸润癌HER2基因扩增，甲醛固定液的量必须要保证至少是所浸泡组织体积的10倍及以上才能获得稳定而可信的定性染色结果。
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| A、B、C组的组织轮廓稍模糊，出现细胞碎片，部分探针定位欠佳，出现信号丢失、核发空现象，见明亮的桔红和绿色荧光信号；D、E、F、G组的组织轮廓清晰而完整、背景洁净、探针定位准确，见耀眼的桔红和绿色荧光信号.HER2基因阴性：HER2/CSP17＜2.0且平均HER2拷贝数/细胞＜4.0;HER2基因阳性:HER2/CSP17≥2.0.标尺=10 μm.HER2:人类表皮生长因子受体2. 图 1 浸润性乳腺癌HER2基因FISH染色结果 Fig. 1 FISH image of HER2 gene in invasive breast cancer |
A~G各组HER2基因扩增阳性率分别为11.93%、16.51%、19.27%、24.77%、24.77%、24.77%和24.77%, 其中A~D组的阳性率逐渐提高(χ2=8.601，P＜0.01)；D~G组基因扩增阳性率稳定在24.77%，均高于A、B、C组(均P＜0.05)。A、B、C组HER2基因扩增状态不稳定，D、E、F、G组HER2基因扩增阳性率稳定。提示甲醛固定液的量必须要保证至少是所浸泡组织体积的10倍及以上方可获得稳定而确切的HER2基因扩增定量检测结果。
3 讨论国内外HER2检测指南推荐使用4%中性缓冲甲醛固定乳腺癌组织，其对乳腺癌组织的渗透作用取决于三个方面：其一，4%中性缓冲甲醛在容器中对乳腺癌组织产生的压强(P=ρgh，式中ρ为溶液的密度，g=9.8 N/kg，h为溶液的高度)；其二，4%中性缓冲甲醛溶液本身的渗透压(渗透压π=cRT，式中π为溶液的渗透压，c为溶液的浓度，R为气体常数8.31kPa·L·K-1·mol-1，T为绝对温度)；其三，固定时间。就本研究而言，在固定时间和溶液本身的渗透压相同的情况下，七组被固定的乳腺原发性浸润癌组织，4%中性缓冲甲醛溶液浸泡组织液面越高，其对被固定的乳腺癌组织产生的压强越大，因此渗透能力会越强、固定效果越好。在选择恰当固定液与固定时间后，实际工作中我们既要保证需要固定的组织全都被浸泡在固定液里，还需保证固定液新鲜、不重复使用，更不能浪费固定液，因而把握好固定液的量与所浸泡组织的比例十分重要。
本研究应用FISH法检测109例乳腺原发性浸润癌中HER2基因扩增水平，重点观察七组使用不同的体积量4%中性甲醛固定液对HER2基因扩增效果的影响。在荧光显微镜下可见，固定液量与所浸泡组织体积的比例大于等于10:1的D、E、F、G各组，标本组织轮廓的完整性、背景洁净程度、探针信号数量以及清晰度等观察指标均明显优于比例小于10:1的A、B、C各组。随着固定液量与所浸泡组织体积比例的增加(3:1到25:1)，HER2基因检出阳性率呈上升的趋势，4%中性缓冲甲醛量与所浸泡乳腺癌组织体积的不同比例与HER2基因扩增阳性率之间线性相关效果显著。我们认为固定液量与所浸泡组织体积的比例在10:1以下的A、B、C组组织固定不充分，导致HER2基因表达的异质性增加，影响了HER2基因检测结果；随着固定液量的增加，组织固定充分，HER2基因表达的异质性越来越小，HER2基因扩增阳性率基本稳定在24.77%，与Rakha等[3]研究结果相符，与张虹等[14]运用双探针FISH法对348例浸润性乳腺癌的HER2状态检测结果也基本一致。
对石蜡切片标本，良好的组织固定是做好FISH实验的先决条件，固定液的量是其中重要的一环。当固定液的量不足时，容易造成假阴性结果。本研究结果显示，HER2基因扩增C组与D组之间是个分水岭，跨越C组到了D组，HER2基因的检测结果显得稳定而真实可靠。因此，我们认为采用FISH法检测乳腺原发性浸润癌HER2基因扩增状态，固定液的量必须要保证至少是所浸泡组织体积的10倍以上方可获得确切的检测结果。
杨莹等[15]研究表明：在FISH时若使用非甲醛固定很可能导致强的背景荧光甚至完全遮盖HER2信号；延迟固定2 h的组织行FISH检测会出现细胞轮廓模糊、信号不规则以及细胞核溶解等现象。Moatamed等[16]研究的是缺血时间、固定时间、固定液类型对免疫组织化学法、FISH法检测乳腺癌组织HER2状态的影响，结果证实标本离体1 h后使用10%甲醛或者使用Bouin固定液均可导致HER2检测结果不同。本研究是在指南推荐的固定时间内，通过研究固定液量与所浸泡组织的不同比例对HER2基因扩增造成的影响而展开，指南中提示的“固定时间以6~72 h为宜”是非常宽的范围，“固定时间”这一变量值得探讨。本研究结论固定时间为15 h，固定液的量应至少为组织的10倍是一个比较好的参数。但是也有可能调整固定时间、调整体积比后获得新的可行的研究结论，有待后期我们在大样本实验研究中去探讨。
本研究结论固定液的量应至少为组织的10倍是基于乳腺癌HER2基因FISH法检测时使用了0.3 cm×0.2 cm×0.1 cm的小块组织而得出的，至于是否适用于临床送检的大块组织(固定时将乳腺癌标本每隔5~10 mm切开)或穿刺标本，也有待我们进一步探讨。如果能结合小块组织、大块组织、穿刺标本相应的HER2-IHC对照实验，进而更全面、更严谨地阐明检测乳腺癌HER2蛋白表达、基因扩增水平时，检测操作中固定液与组织的比例将会对临床实际检测工作更有指导意义。
精准诊断是精准治疗的重要保证。随着精准医学不断发展，FISH法检测HER2基因扩增可应用在胃、乳腺、卵巢、肺、肝等多种癌症的精准诊断中，明确其基因状态与判断肿瘤进展、患者预后及临床治疗效果息息相关。有趣的是，本文的研究结论与胃癌HER2检测指南中固定液的量应至少为组织的10倍相一致[17]。至于此结论在卵巢、肺、肝等多癌种的HER2基因检测中是否适用，甚至在诸癌种的HE染色技术、免疫组织化学技术、特殊染色技术中是否适用，均有待进一步探讨。
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