微小RNA(miRNA，miR)是一类长为18~25个核苷酸的非编码RNA, 其可能通过与目的mRNA的3′-非翻译区(UTR)的直接结合导致mRNA降解或抑制蛋白质的翻译[1-3]。miRNA参与一系列重要的生命过程，在细胞生存、增殖、分化等方面起着关键作用, 并在肿瘤的发生和发展中起着促进或者抑制的作用[4]。有研究发现，miR-101在乳腺癌[5]、卵巢癌[6]、子宫内膜癌[7]和肝细胞癌[8]中起抑制作用。关于miR-101在肝癌发生和发展中的作用，Xu等[9]研究发现，miR-101可以抑制自噬并能促进顺铂诱导下肝癌细胞的凋亡；Zhang等[10]发现miR-101可以通过抑制SOX9基因从而阻碍肿瘤的发生，并有利于人类肝细胞癌的预后；Cao等[8]研究发现，miR-101通过下调Girdin蛋白从而抑制肝细胞癌的增殖、迁移以及侵袭。为了深入探讨miR-101在肝癌的发生和发展过程中的生物学功能和作用机制，我们运用近年来发展迅速的成簇的规律间隔的短回文重复序列(clustered regulatory interspaced short palindromic repeats, CRISPR)/CRISPR相关蛋白(CRISPR-associated，Cas)基因编辑技术，构建靶向敲除小鼠miR-101a基因(小鼠的miR-101a与人的miR-101序列相同)的一体化载体系统，为后续细胞及动物模型研究提供技术支撑和保障，同时也为其他miRNA敲除提供借鉴。
1 材料与方法 1.1 细胞和质粒AML12细胞、293A细胞、腺病毒载体PAD/pl-DEST、pENTRY-U6-EF1α-WT Cas9、pENTRY-U6-U6-EF1α-Cas9 D10A均来自北京蛋白质组研究中心分子遗传实验室。
1.2 试剂、引物和仪器琼脂糖凝胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒购自美国Omega公司；Gibson Assembly Master Mix、限制性内切酶、T7 EndonucleaseⅠ购自美国New England Biolabs(NEB)公司；KOD FX购自日本Toyobo公司；Gateway试剂盒、聚乙烯亚胺(PEI)转染试剂、TRIzol和Lipofectamine® LTX & PLUS Reagent购自美国Invitrogen公司；DMEM/F12培养基、DMEM培养基、FBS购自美国Gibco公司；miScriptⅡ RT Kit反转录试剂盒、miRNA特异性引物miR-101a购自美国Qiagen公司(未公开序列)；PCR引物及测序鉴定由深圳华大基因科技服务有限公司完成。其他常规试剂均为进口或国产的分析纯级产品。凝胶成像系统、电泳仪、PCR仪购自美国Bio-Rad公司；二氧化碳恒温培养箱、DNA电泳槽购自美国Thermo Fisher Scientific公司。
1.3 小向导RNA(sgRNA)的设计和扩增查找小鼠miR-101a的前体序列(图 1A)及其基因序列，并通过哈佛大学张峰实验室提供的网站(http://crispr.mit.edu/)设计sgRNA，设计出的sgRNA长度约20 bp，并以-NGG结尾。共设计出三条靶向sgRNA以及一条靶向绿色荧光蛋白(GFP)的对照sgRNA，用CRISPR-F和CRISPR-R对sgRNA(KI-1、KI-2、KI-3、KI-GFP)进行扩增，见表 1。扩增体系如下：50 ng/μL模板DNA 0.5 μL，10 μmol/L CRISPR-F/R各0.6 μL，2×PCR缓冲液10 μL，2 mmol/L脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)4μL，KOD高保真DNA聚合酶0.4 μL，补水至20 μL，进行PCR扩增sgRNA模板。
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| A：小鼠miR-101a前体序列；B：将sgRNA1、2、3和sgRNA GFP分别构建至一体化载体系统(pENTRY-U6-sgRNA-EF1α-WT Cas9)；C：D10A突变型Cas9双切口设计示意图；D：将sgRNA1和sgRNA3构建至一体化载体系统(pENTRY-U6-sgRNA-U6-sgRNA-EF1α-Cas9 D10A)以进行双切口操作，而只插入sgRNA3的载体作为对照. 图 1 一体化载体的构建 Fig. 1 Construction of the all-in-one vectors |
| 引物名称 | 序列(5′-3′) |
| sgRNA1 | GCACTGTGATAACTGAGCCA GGG |
| sgRNA2 | AGCACTGTGATAACTGAGCC AGG |
| sgRNA3 | GCTGATGCTGTCCATTCTAA AGG |
| sgRNA GFP | CGGCACGGGCAGCTTGCCGG TGG |
| CRISPR-F | GTATTTCGATTTCTTGGCTTTATATATCTTGTGGAAA GGACGAAACACCG |
| CRISPR-R | GTTGATAACGGACTAGCCTTATTTTAACTTGCTATT TCTAGCTCTAAAAC |
| KI-1 | GAAAGGACGAAACACCGCACTGTGATAACTGA GCCA GTTTTAGAGCTAGAAAT |
| KI-2 | GAAAGGACGAAACACCGGCACTGTGATAACTG AGCC GTTTTAGAGCTAGAAAT |
| KI-3 | GAAAGGACGAAACACCGCTGATGCTGTCCATT CTAAGTTTTAGAGCTAGAAAT |
| KI-GFP | GAAAGGACGAAACACCGGGCACGGGCAGCTT GCCGG GTTTTAGAGCTAGAAAT |
| hu6 | ATGGACTATCATATGCTTACCGTA |
| 表中加粗部分为连接进入质粒载体中且起引导作用的sgRNA序列. | |
将质粒pENTRY-U6-EF1α-WT Cas9用XmaⅠ和PmeⅠ限制性内切酶进行双酶切，37 ℃孵育5 h后，直接过柱进行回收。使用Gibson Assembly进行载体构建，体系如下：XmaⅠ和PmeⅠ双酶切回收产物0.5 μL，2×Gibson Assembly Master Mix 2.5 μL，sgRNA1、2、3及对照sgRNA GFP扩增的PCR产物2 μL，50 ℃孵育1 h后分别构建得到三种pENTRY-U6-sgRNA-EF1α-WT Cas9质粒及其对照质粒(图 1B)。用hu6引物进行测序，以证实sgRNA序列是否已正确插入载体之中。
1.5 一体化载体pENTRY-U6-sgRNA1-U6-sgRNA3-EF1α-Cas9 D10A的构建首先进行D10A突变型Cas9双切口(double nicking)设计(图 1C)，sgRNA1和sgRNA3之间的距离为-3 bp，满足双切口设计条件，可以用于载体构建。将质粒pENTRY-U6-U6-EF1α-Cas9 D10A用XmaⅠ和PmeⅠ限制性内切酶进行双酶切，使用Gibson Assembly将sgRNA3扩增产物组装到双酶切产物上，构建成pENTRY-U6-U6-sgRNA3-EF1α-Cas9 D10A(对照组)。经测序正确后，在此载体基础上用AfeⅠ和SbfⅠ双酶切后，将sgRNA1扩增产物用同样方法组装上去，形成最终载体pENTRY-U6-sgRNA1-U6-sgRNA3-EF1α-Cas9 D10A(实验组)。用hu6引物进行测序，以证实sgRNA序列是否已正确插入载体之中。
1.6 细胞培养和转染将AML12细胞提前铺于六孔板上，用含有10% FBS、1%双克隆抗体(链霉素100 U/mL和青霉素100 U/mL)、40 ng/mL地塞米松和胰岛素—转铁蛋白—硒添加剂(ITS)的DMEM/F12培养基，37 ℃、5%二氧化碳恒温培养, 生长至50%左右用Lipofectamine® LTX & PLUS Reagent分别等量转染WT Cas9载体及双切口Cas9 D10A载体。
1.7 T7核酸内切酶Ⅰ(T7EⅠ)酶切检测剪切效率AML12细胞转染质粒72 h后，用胰蛋白酶消化细胞，收取细胞沉淀提取基因组DNA。依据小鼠miR-101a基因序列设计验证引物(正向：5′-ACACTTGGTGCATAGGTGTGA-3′，反向：5′-CGGTGTGAAGTGTGTCTGGT-3′)，并以提取的基因组DNA作为模板，用KOD高保真DNA聚合酶进行PCR扩增目的片段，后将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，切胶回收。测浓度后取400 ng产物进行加热变性、梯度退火、再复性，体系如下：400 ng PCR产物，1 μL 10×缓冲液2，补水至9.5 μL。由于Cas9切割靶序列后缺乏修复模板，主要以非同源重组的方式进行修复，或多或少会插入或者删除一些片段，故而修复后的序列在每个细胞中是随机或不同的，因此将靶序列PCR扩增后经过变性、退火，将形成错配。T7EⅠ酶会识别错配的杂合双链并剪切，因此在变性退火后的产物里加0.5 μL T7EⅠ酶，37 ℃反应30 min，结束后进行琼脂糖凝胶电泳，检测miR-101a基因的剪切效率。
1.8 重组腺病毒载体的构建将构建的一体化质粒通过Gateway重组系统重组到PAD/pl-DEST。Gateway反应体系(10 μL)包括100 ng pENTRY质粒、150 ng PAD/pl-DEST质粒、2 μL LRⅡ重组酶，然后Tris-EDTA缓冲液(酸碱度为8.0)补至10 μL，室温反应1 h。然后转化大肠埃希菌感受态，涂板后挑取单克隆，提取质粒用XbaⅠ酶切鉴定。
1.9 腺病毒的包装与扩增将重组正确的PAD质粒用PacⅠ酶线性化，再用乙醇沉淀法回收，将回收产物用PEI转染293A细胞，培养期间勤换液。约7~10 d，部分细胞开始变圆脱落时，收集病毒(包括细胞和培养基)，冻于-80 ℃，再置于37 ℃水浴中冻融，反复冻融三次以充分释放病毒颗粒，然后4100×g离心10 min，取上清液用滤膜过滤后，部分感染新的293A细胞，扩增病毒，部分冻于-80 ℃备用。
1.10 病毒感染AML12细胞及RT-PCR鉴定将包装好的腺病毒(三种WT Cas9载体及其对照、一种双切口Cas9 D10A载体及其对照)分别感染AML12细胞系。感染72 h后分别收集感染的实验组细胞和对照组细胞，TRIzol法提取总RNA。取1 μg RNA作为模板，用miScriptⅡRT Kit反转录试剂盒进行反转录反应，反应条件：37 ℃ 60 min；95 ℃ 5 min。然后进行实时定量PCR检测，并采用适合小鼠种属的内生RNA snord 72作为内参引物。
1.11 统计学方法采用SPSS 19.0软件进行统计分析，计量数据用均数±标准差(x±s)表示，组间比较采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 一体化载体系统的构建sgRNA1，2，3和sgRNA GFP分别构建至WT Cas9一体化载体系统(pENTRY-U6-sgRNA-EF1α-WT Cas9)，sgRNA1和sgRNA3构建至Cas9 D10A一体化载体系统，然后用hU6引物进行测序鉴定，证实所设计的sgRNA序列已正确插入载体之中。
2.2 一体化载体系统的剪切效率T7EⅠ酶切结果显示，构建的三种WT Cas9载体(sgRNA1、sgRNA2、sgRNA3)及双切口Cas9 D10A载体(sgRNA1+sgRNA3)均发生了明显剪切，形成了两个条带(图 2)，表明设计的sgRNA有效果。
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| A：WT Cas9；B：Cas9 D10A. M：DNA标准带；“-”：未加T7EⅠ；“+”：加T7EⅠ. 图 2 一体化载体系统的剪切效率 Fig. 2 Shearing efficiencies of the all-in-one vectors |
用XbaⅠ酶切鉴定重组载体，结果与预期相符合(图 3)，表明成功构建出重组一体化腺病毒载体。
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| M：DNA标准带; 1~5:pAD-sgRNA1-WT Cas9;6~10:pAD-sgRNA2-WT Cas9;11~15:pAD-sgRNA3-WT Cas9;16~19:pAD-sgRNA1+3 Cas9 D10A. 图 3 重组pAD载体的酶切鉴定 Fig. 3 Identification of recombinant adenovirus vector by enzyme digestion |
重组腺病毒感染细胞后，其miR-101a表达水平较对照组明显下降(图 4)，差异有统计学意义(均P＜0.01)，表明两种类型的Cas9一体化载体均构建成功。
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| A：WT Cas9载体；B：Cas9 D10A载体.**与对照组(sgRNA GFP、sgRNA3 D10A)比较，P＜0.01. 图 4 miR-101a敲除的效率 Fig. 4 Knockout efficiency of miR-101a |
miRNA基因种类极其丰富，构成了一个非常庞大的家族并广泛存在于动物、植物以及病毒之中。最新的miRNA数据库已经编目了2588条人源miRNA分子。据推测，在人类的基因组中，miRNA参与调节约30%的蛋白质编码基因，几乎涉及生物体所有的生长发育和病理进程。miRNA在物种进化过程中相当保守且其表达模式具有严谨的位相性与时序性，因而它们的异常表达可能与人类的许多疾病相关[11-12]。
CRISPR/Cas9系统广泛存在于细菌以及古细菌的基因组中，是它们在进化过程中为了抵御噬菌体或质粒等外源DNA入侵而形成的适应性免疫系统[13]。CRISPR/Cas系统可分为三类：Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型，其中Ⅱ型因为组成简单，因而被改造成为基因编辑工具。在Ⅱ型系统中，CRISPR先转录形成前体CRISPR衍生RNA(crRNA)，然后经过加工后产生成熟的crRNA，crRNA能与反式激活crRNA(trans-activating crRNA, tracrRNA)形成复合体，Cas9蛋白能识别并与该复合物结合，从而在crRNA的引导下识别并切割靶向基因位点。研究人员正是通过模拟crRNA：tracrRNA复合体的结构从而设计出sgRNA，可有效介导Cas9蛋白对靶位点的识别与切割[14]。sgRNA和Cas9蛋白可分开构建在两个载体上，也可以直接构建在同一个载体上形成一体化载体。我们所构建的便是第二种，这有利于Cas9蛋白和sgRNA的协同表达，且这种构建方式简便又快捷，适合于难转染的细胞以及进行生物体内实验。
尽管CRISPR/Cas系统具有简便快捷、成本低廉、突变效率高以及适用范围广等诸多优点，但是sgRNA的序列长度只有20个碱基，而且Cas9蛋白对于sgRNA与靶位点的错配不敏感，因而系统也面临着脱靶率比较高的问题。为了解决这个问题，有研究人员构建了一种突变型Cas9蛋白(Cas9 D10A)[15]，我们所构建的第二种载体系统采用了这种Cas9蛋白。Cas9 D10A只有一个活性结构域，另一个活性结构域通过点突变而失活，因为其只能切割DNA的一条单链[10]。这需要我们设计一对能结合于两条互补的DNA链上且位置相邻sgRNA，同时引导Cas9 D10A蛋白识别才能成功对靶位点进行切割。这种载体系统对于靶位点的识别长度加长，从而能有效降低脱靶率。在本研究中，我们构建的pENTRY-U6-sgRNA1-U6-sgRNA3-Cas9 D10A载体中便插入了一对sgRNA，而pENTRY-U6-U6-sgRNA3-Cas9 D10A中只有一条sgRNA，只能引导单链切割，并不能造成靶基因破坏，故而当作对照组。
综上所述，我们利用CRISPR/Cas9基因编辑技术，通过构建两种不同的一体化载体系统来实现对miR-101a基因的靶向切割与破坏。该研究不仅为miRNA的基因敲除提供了实验依据，有助于进一步构建CRISPR/Cas9介导的基因敲除小鼠，更为下一步研究miR-101a在肝癌发生发展中的作用机制提供了极其重要的工具，也为其他miRNA的敲除与功能研究提供了技术借鉴。
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