2. 温州医科大学检验医学院, 浙江 温州 325035
2. Wenzhou Medical University School of Laboratory Medicine, Wenzhou 325035, China
解甘露醇罗尔斯顿菌(Ralstonia mannitolilytica)属于伯克菌科罗尔斯顿菌属，为非发酵专性需氧的革兰阴性杆菌，能在低营养环境中生存，是广泛存在于自然水体中的腐生性细菌[1]。近年来，解甘露醇罗尔斯顿菌感染引起人败血症和肺炎的病例报道日趋增多[2-4]，其导致的脑膜炎、肾移植和腹膜透析后感染、慢性阻塞性肺病和眼部感染也有报道[5-9]。
我们从一例脓毒血症患者外周血中分离并鉴定了一株解甘露醇罗尔斯顿菌，采用药敏试验和PCR分别检测了该菌株的耐药性和β-内酰胺酶编码基因。此外，我们发现该菌株有一个独特的编码原卟啉亚铁螯合酶(protoporphyrin ferrochelatase)hemH基因。有文献报道，原卟啉亚铁螯合酶表达下调使原卟啉底物堆积，有氧状态下可发生光毒性反应产生大量单线态氧(1O2)和过氧化物自由基(ROO·)等活性氧，导致组织与细胞损伤并引发炎症反应[10]。本研究中我们扩增并测定了该菌株hemH基因序列，然后采用生物信息学软件分析了其产物结构和功能，以期为研究原卟啉亚铁螯合酶的致病机制提供线索和依据。
1 材料与方法 1.1 菌株来源菌株分离自一例68岁的男性脓毒症患者。该例患者外伤骨折后6 d入住浙江省人民医院重症监护室，体温38.9 ℃，外周血白细胞数29.7×109/L，中性粒细胞占0.913，C反应蛋白225.0 mg/L。
1.2 主要仪器和试剂Vitek 2-Compact型全自动细菌检测分析系统及其配套的GN细菌鉴定卡为法国生物梅里埃公司产品；SmartSpecTM-3000型紫外分光光度仪、MyCycler型PCR仪和Gel Doc 2000型凝胶图像分析系统为美国Bio-Rad公司产品。
哥伦比亚血琼脂平板，M-H血琼脂平板以及头孢硝噻吩、头孢他啶、头孢他啶/克拉维酸、头孢噻肟、头孢噻肟/克拉维酸、美罗培南纸片购自法国生物梅里埃公司；细菌基因组DNA提取试剂盒和高保真PCR试剂盒分别购自美国Axygen公司和宝生物工程(大连)有限公司；金黄色葡萄球菌ATCC25923株、大肠埃希菌ATCC25922株和肺炎克雷伯菌ATCC700603株购自北京中国食品药品检定研究院。
1.3 菌株分离培养和鉴定采集双份患者外周血样本接种于哥伦比亚血琼脂平板进行分离培养，37 ℃培养24 h后，挑取菌落革兰染色后用全自动细菌检测分析系统及其配套的GN细菌鉴定卡鉴定。采用细菌基因组DNA提取试剂盒提取分离菌株基因组DNA，分光光度法测定其浓度和纯度[11]。采用文献[12]报道的引物(表 1)以及PCR检测分离菌株DNA中解甘露醇罗尔斯顿菌16S rRNA基因片段。反应总体积100 μL，内含2.5 mol/L dNTP、250 nmol/L引物、20 mol/L氯化镁、2.5 U EX-Taq DNA聚合酶、100 ng DNA模板和1×PCR缓冲液(酸碱度为8.3)。采用溴乙锭预染色1.5%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物并委托上海英骏生物技术有限公司测序。
| 引物名称 | 上游(5′-3′) | 下游(5′-3′) | 产物长度(bp) |
| 16S RNA | GGGAAAGCTTGCTTTCCTGCC | TCCGGGTATTAACCAGAGCCAT | 399 |
| TK49_09850 | ATGACACTGAGATTCGCC | AACGCTGTGCCATGGCAA | 786 |
| TK49_12955 | ATGCACGCCCAGATCGAA | CAGCGCGTTGAGCGGGAT | 861 |
| TK49_14470 | ATGGTCACCACCTTGTAT | CCCCGTTGCCGCTGGCGG | 795 |
| TK49_14495 | ATGCGTTTGCTCACTTCC | GTCTGCGCGGTCGGTGCG | 1005 |
| TK49_18990 | ATGACGAAACTCCGCCAC | GGGCTTGGCGGCAGCCAG | 828 |
| hemH | ATGCCCTTCTTGCCCGAACCC | TGCCGCGGCTCCCTTGCTCTG | 1119 |
参照美国临床和实验室标准协会(CLSI)推荐的微量二倍液体稀释法[13]，对解甘露醇罗尔斯顿菌分离株进行药敏试验，实验中采用金黄色葡萄球菌ATCC25923株和大肠埃希菌ATCC25922株作为质控菌株。
1.5 头孢硝噻吩纸片法检测β-内酰胺酶采用CLSI推荐的头孢硝噻吩纸片法[13]。用灭菌接种环挑取解甘露醇罗尔斯顿菌分离株涂布于头孢硝噻吩纸片上，即刻观察纸片颜色变化，若出现红色判为阳性。
1.6 纸片法检测超广谱β-内酰胺酶(ESBL)采用CLSI推荐的纸片法[13]。0.05麦氏浊度解甘露醇罗尔斯顿菌分离株涂布于M-H血琼脂平板上，贴上头孢他啶、头孢他啶/克拉维酸、头孢噻肟、头孢噻肟/克拉维酸药物纸片，37 ℃孵育24 h，头孢他啶/克拉维酸或头孢噻肟/克拉维酸纸片抑菌环直径较头孢他啶或头孢噻肟纸片抑菌环直径不小于5 cm表明该菌株产ESBL。实验中分别以不产ESBL大肠埃希菌ATCC25922株和产ESBL肺炎克雷伯菌ATCC700603株作为阴性和阳性对照。
1.7 Hodge法检测碳青酶烯酶采用CLSI推荐的Hodge法[13]。0.05麦氏浊度不产碳青酶烯酶大肠埃希菌ATCC25922株涂布于M-H血琼脂平板上，平板中央贴上美罗培南纸片，挑取解甘露醇罗尔斯顿菌分离株从纸片外缘向平板边缘划直线接种，35 ℃孵育24 h，美罗培南抑菌圈外缘与分离株接种线交界处大肠埃希菌呈矢状生长者表明受试菌株产碳青霉烯酶。
1.8 β-内酰胺酶基因扩增与测序解甘露醇罗尔斯顿菌分离株基因组DNA提取及其浓度和纯度测定同上。有文献报道解甘露醇罗尔斯顿菌有5个产物注释为β-内酰胺酶基因(编号TK49_09850、TK49_12955、TK49_14470、TK49_14495和TK49_18990)，但其序列与肠杆菌科细菌β-内酰胺酶基因序列同源性很低，故采用文献报道的引物(表 1)以及PCR检测解甘露醇罗尔斯顿菌分离株上述β-内酰胺酶基因[14]。PCR体积和各试剂同上。PCR参数：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s、50或52 ℃ 30 s、72 ℃ 120 s，35个循环；72 ℃ 10 min。采用溴乙锭预染色1.5%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物并委托上海英骏生物技术有限公司测序。
1.9 hemH基因扩增与测序解甘露醇罗尔斯顿菌分离株基因组DNA提取及其浓度和纯度测定同上。根据解甘露醇罗尔斯顿菌SN82F48株全基因组(基因库登录号CP010799)中原卟啉亚铁螯合酶基因序列，采用Primer Premier 5.0软件设计PCR引物(表 1)。PCR体积和各试剂同上。PCR参数：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s、56 ℃ 30 s、72 ℃ 1 min，30个循环；72 ℃ 10 min。采用溴乙锭预染色1.5%琼脂糖凝胶电泳和凝胶成像系统检测PCR产物并委托上海英骏生物技术有限公司测序。
1.10 生物信息学软件分析hemH的结构和功能采用SignalP 4.1和TMHMM软件分析解甘露醇罗尔斯顿菌分离株hemH基因表达产物hemH跨膜区和信号肽序列，采用TargetP Server v1.01软件预测hemH亚细胞定位，采用SWISS-MODEL软件模拟其三维空间结构，采用CDD和MEROPS/NCBI软件分析解甘露醇罗尔斯顿菌原卟啉亚铁螯合酶功能结构域，采用CDTree软件绘制其系统进化树并分析其垂直进化关系[15-16]。
2 结果 2.1 菌株鉴定结果菌株革兰染色后在普通光学显微镜下显示为无规则排列的革兰阴性短杆菌，全自动细菌检测分析系统及其革兰阴性细菌鉴定卡鉴定为解甘露醇罗尔斯顿菌，鉴定值为99%，鉴定编码为4003611303500001，D-葡萄糖、D-麦芽糖、D-甘露糖、D-甘露醇、柠檬酸盐、丙二酸盐、乳酸盐、琥珀酸盐、L-苹果酸盐、吡咯烷基芳胺酶、γ-谷氨酰转移酶、L-脯氨酸芳胺酶、酪氨酸芳胺酶和尿素酶试验结果阳性。甘露醇罗尔斯顿菌分离株16S rRNA基因片段PCR结果阳性(图 1)，其序列与基因库中相应基因片段(登陆号CP010799)的相似度高达99.5%(397/399)。
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| M：DNA标准带；1：甘露醇罗尔斯顿菌分离株16S rRNA基因片段扩增条带(399 bp)；2：空白对照 图 1 甘露醇罗尔斯顿菌分离株16S rRNA基因片段PCR结果 Fig. 1 PCR result of 16S rRNA gene segment in Ralstonia mannitolilytica isolate |
受试的16种抗菌药物中，解甘露醇罗尔斯顿菌分离株对头孢唑啉、头孢替坦、头孢他啶、氨苄西林、头孢哌酮/舒巴坦、亚胺培南、美罗培南、氨曲南耐药，但对头孢曲松、头孢吡肟以及其他六种非β-内酰胺类抗菌药物敏感(表 2)。
| 抗菌药物 | 最小抑菌浓度(mg/mL) | 结果判断 |
| 头孢曲松 | ≤1 | 敏感 |
| 头孢吡肟 | 2 | 敏感 |
| 头孢唑啉 | ≥64 | 耐药 |
| 头孢替坦 | ≥64 | 耐药 |
| 头孢他啶 | 16 | 耐药 |
| 氨苄西林 | ≥32 | 耐药 |
| 头孢哌酮/舒巴坦 | 44 | 耐药 |
| 亚胺培南 | 8 | 耐药 |
| 美罗培南 | 14 | 耐药 |
| 氨曲南 | ≥64 | 耐药 |
| 庆大霉素 | ≤1 | 敏感 |
| 妥布霉素 | ≤1 | 敏感 |
| 阿米卡星 | ≤2 | 敏感 |
| 环丙沙星 | ≤0.25 | 敏感 |
| 左氧氟沙星 | ≤0.25 | 敏感 |
| 复方磺胺甲噁唑 | ≤20 | 敏感 |
解甘露醇罗尔斯顿菌分离株涂布的头孢硝噻吩纸片由黄色转变为红色，表明该菌株产β-内酰胺酶；对解甘露醇罗尔斯顿菌分离株抑菌环直径头孢他啶和头孢他啶/克拉维酸均为12 mm、头孢噻肟和头孢噻肟/克拉维酸均为22 mm，头孢他啶/克拉维酸或头孢噻肟/克拉维酸抑菌环直径与头孢他啶或头孢噻肟抑菌环直径之差小于5 mm，表明该菌株不产ESBL；美罗培南抑菌圈外缘与解甘露醇罗尔斯顿菌分离株接种线交界处未见大肠埃希菌呈矢状生长，表明该菌株不产碳青酶烯酶。
2.4 β-内酰胺酶基因PCR和测序结果解甘露醇罗尔斯顿菌分离株DNA中可扩增出全长TK49_09850、TK49_12955、TK49_14470、TK49_14495、TK49_18990 β-内酰胺酶基因片段，见图 2。测序与分析结果显示，其与基因库中甘露醇罗尔斯顿菌SN82F48株相应β-内酰胺酶基因(登录号CP010799)核苷酸和氨基酸序列相似度均分别高达97.3%~100.0%。
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| M：DNA标准带；1~5：甘露醇罗尔斯顿菌分离株TK49_09850(786 bp)、TK49_12955(861 bp)、TK49_14470(795 bp)、TK49_14495(1005 bp)、TK49_18990(828 bp)β-内酰胺酶基因扩增条带；6：空白对照 图 2 甘露醇罗尔斯顿菌分离株β-内酰胺酶基因PCR结果 Fig. 2 PCR results of β-lactamase-encoding genes in Ralstonia mannitolilytica isolate |
解甘露醇罗尔斯顿菌分离株基因组DNA中可扩增出全长hemH基因(图 3)。测序结果显示，该菌hemH基因核苷酸和氨基酸序列与基因库中相应基因序列相似性分别高达99.9%和100.0%，表明其序列非常保守。
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| M：DNA标准带；1：甘露醇罗尔斯顿菌分离株全长hemH基因片段扩增条带(1119 bp)；2：空白对照 图 3 甘露醇罗尔斯顿菌分离株hemH基因PCR结果 Fig. 3 PCR result of hemH gene in Ralstonia mannitolilytica isolate |
解甘露醇罗尔斯顿菌分离株hemH基因表达产物无信号肽、无跨膜区(图 4、5)，TargetP Server v1.01软件预测结果提示hemH也为非分泌性胞内蛋白。hemH具有2个Ⅱ类螯合酶超家族原卟啉亚铁螯合酶功能结构域(图 6)。hemH空间构型为富含α螺旋和β折叠的二聚体酶(图 7)，含11个活性中心保守位点(L24、Y38、F42、L43、S44、T152、T153、H218、R223、W266、E299)和24个域接口位点(N23、K75、I79、Y94、Q98、M146、Q149、Y150、S151、G152、H180、H182、D229、P230、Y231、E234、T238、G292、P294、A295、D296、L298、E302、E327)。解甘露醇罗尔斯顿菌hemH与脑膜炎奈瑟菌原卟啉亚铁螯合酶进化距离最近(序列重叠率93%，相似度50%)，与希瓦菌(序列重叠率90%，相似度47%)、大肠埃希菌(序列重叠率88%，相似度47%)、铜绿假单胞菌(序列重叠率87%，相似度41%)、恶性疟原虫(序列重叠率90%，相似度34%)原卟啉亚铁螯合酶进化距离依次变远(图 8)。
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| 图 4 甘露醇罗尔斯顿菌分离株hemH无信号肽序列 Fig. 4 No signal peptide sequence in hemH of Ralstonia mannitolilytica isolate |
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| 图 5 甘露醇罗尔斯顿菌分离株hemH无跨膜区序列 Fig. 5 No transmembrane region sequence in hemH of Ralstonia mannitolilytica isolate |
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| 图 6 甘露醇罗尔斯顿菌分离株hemH功能结构域 Fig. 6 Functional domains in hemH of Ralstonia mannitolilytica isolate |
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| 图 7 甘露醇罗尔斯顿菌分离株hemH空间构型 Fig. 7 Spatial configuration of hemH from Ralstonia mannitolilytica isolate |
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| 图 8 甘露醇罗尔斯顿菌分离株hemH系统发生树 Fig. 8 hylogenetic tress of hemH from Ralstonia mannitolilytica isolate |
新发传染病是全人类共同面临的重大健康和生命安全问题。解甘露醇罗尔斯顿菌曾名为托马斯假单胞菌(Pseudomonas thomasii)或皮氏罗尔斯顿菌生物3型(Ralstonia pickettii biovar 3)，后改名为解甘露醇罗尔斯顿菌，归属于伯克菌科罗尔斯顿菌属[1]。近年来，解甘露醇罗尔斯顿菌感染病例报道日趋增多，甚至出现医疗器材污染引起解甘露醇罗尔斯顿菌感染暴发流行事件[17-18]。2011年，我国首次报道一例慢性阻塞性肺病患者解甘露醇罗尔斯顿菌感染病例[8]。因此，解甘露醇罗尔斯顿菌被认为是全球流行的新发机会感染性疾病的病原体[2]。本研究中的病例为外伤后感染中老年患者，有发热以及外周血白细胞数、中性粒细胞比例和C反应蛋白显著升高等细菌性感染指征，两份外周血标本均仅分离出解甘露醇罗尔斯顿菌一种细菌，表明解甘露醇罗尔斯顿菌确为该患者感染的病原体。
β-内酰胺类抗菌药物主要分为青霉素、头孢菌素和碳青酶烯类药物，另还有单酰胺环类β-内酰胺类抗菌药物，其中青霉素类和头孢菌素类为临床治疗细菌感染性疾病的首选药物。已知细菌对β-内酰胺类抗菌药物耐药的主要机制是药物水解酶，如水解青霉素和头孢菌素类抗菌药物的β-内酰胺酶、ESBL以及水解碳青酶烯类抗菌药物的碳青酶烯酶[19]。药敏试验结果显示，解甘露醇罗尔斯顿菌分离株对头孢曲松、头孢吡肟敏感，但对其余青霉素类(氨苄西林)、头孢菌素类(头孢唑啉、头孢替坦、头孢他啶、头孢哌酮)、碳青酶烯类(亚胺培南、美罗培南)和单酰胺环类(氨曲南)β-内酰胺抗菌药物耐药，对氨基糖苷类抗菌药物庆大霉素、妥布霉素、阿米卡星和喹诺酮类抗菌药物环丙沙星、左氧氟沙星替加环素敏感，可用于临床治疗。上述解甘露醇罗尔斯顿菌对β-内酰胺类抗菌药物独特的耐药谱与寿晓岚等[14]报道几乎完全相同，尤其是该菌对新型高效广谱碳青酶烯类和单酰胺环类抗菌药物耐药值得临床医师高度关注。β-内酰胺酶、ESBL和碳青酶烯酶确证试验结果显示，该菌株产β-内酰胺酶，不产ESBL和碳青酶烯酶。已有研究发现，解甘露醇罗尔斯顿菌具有β-内酰胺酶基因，但其序列与病原性球菌和肠道杆菌β-内酰胺酶基因差异很大，常用的引物无法扩增出该菌β-内酰胺酶基因片段[14]。我们采用该文献报道的引物，扩增出5个解甘露醇罗尔斯顿菌全长β-内酰胺酶基因片段。舒巴坦是临床常用的细菌β-内酰胺酶和ESBL抑制剂，但药敏试验结果显示，解甘露醇罗尔斯顿菌分离株对头孢哌酮/舒巴坦高度耐药。上述资料提示，解甘露醇罗尔斯顿菌β-内酰胺酶结构和功能极可能与常见细菌β-内酰胺酶有较大差异，值得深入研究。
螯合酶超家族分别为ATP依赖异三聚体Ⅰ类、ATP非依赖单体或二聚体Ⅱ类和兼有脱氢酶活性Ⅲ类螯合酶超家族，原卟啉亚铁螯合酶属于Ⅱ类螯合酶超家族成员，是血红蛋白生物合成途径中的末端酶，能催化亚铁进入原卟啉Ⅸ而形成有功能的血红蛋白分子[20]。血红蛋白作为哺乳类细胞多种生物酶类辅助因子，在哺乳类细胞能量代谢、氧化应激、气体交换和储存、信号转导过程中发挥重要作用[21]。但近年研究发现，不仅非致病性谷氨酸棒状杆菌、枯草芽孢杆菌和希瓦菌，机会致病性大肠埃希菌、铜绿假单胞菌以及致病性金黄色葡萄球菌、脑膜炎奈瑟菌也能产生原卟啉亚铁螯合酶[22-25]。早年研究证实，致病性流产布鲁菌产生的原卟啉亚铁螯合酶对该菌宿主细胞内生存和毒力极为重要，若其基因被敲除，流产布鲁菌不仅无法在胞内生存，同时也失去了致死小鼠的能力[26]。如前所述，原卟啉亚铁螯合酶表达下调可使原卟啉底物堆积并通过光毒性反应产生大量单线态氧和过氧化物自由基等活性氧，导致组织细胞损伤并引发炎症[10]。PCR和测序结果显示，解甘露醇罗尔斯顿菌分离株具有编码原卟啉亚铁螯合酶hemH基因；生物信息学分析结果显示，该基因产物为含两个Ⅱ类螯合酶超家族原卟啉亚铁螯合酶功能结构域的二聚体酶，与致病性脑膜炎奈瑟菌原卟啉亚铁螯合酶亲缘关系最近。解甘露醇罗尔斯顿菌属为革兰阴性杆菌，故除其细胞壁脂多糖内毒素外，hemH基因表达产物原卟啉亚铁螯合酶也可能是该菌感染宿主时机体组织细胞损伤和炎症反应中发挥重要致病作用的毒力因子，其致病机制有待于进一步研究。
| [1] | DE BAERE T, STEYAERT S, WAUTERS G, et al. Classification of Ralstonia pickettii biovar 3/'thomasii' strains (Pickett 1994) and of new isolates related to nosocomial recurrent meningitis as Ralstonia mannitolytica sp. nov[J]. Int J Syst Evol Microbiol, 2001, 51(Pt 2): 547–558. |
| [2] | RYAN M P, ADLEY C C. Ralstonia spp.:emerging global opportunistic pathogens[J]. Eur J Clin Microbiol Infect Dis, 2014, 33(3): 291–304. doi:10.1007/s10096-013-1975-9 |
| [3] | SHOU X L, HU W L, SHAO H Y, et al. Isolation and identification of Ralstonia mannitolilytica strains from a patient with septicaemia and analysis of their drug resistance genes[J]. Chin J Microbiol Immun, 2016, 36(1): 57–63. |
| [4] | ZHANG D C, XIA J J, FANG X Q. Clinical analysis of 36 elderly patients with hospital-acquired pneumonia caused by Ralstonia mannitolilytica[J]. Chin J Health Care Med, 2013, 15(1): 6–8. |
| [5] | VANEECHOUTTE M, DE BAERE T, WAUTERS G, et al. One case each of recurrent meningitis and hemoperitoneum infection with Ralstonia mannitolilytica[J]. J Clin Microbiol, 2001, 39(12): 4588–4590. doi:10.1128/JCM.39.12.4588-4590.2001 |
| [6] | MUKHOPADHYAY C, BHARGAVA A, AYYAGARI A. Ralstonia mannitolilytica infection in renal transplant recipient:first report[J]. Indian J Med Microbiol, 2003, 21(4): 284–286. |
| [7] | DOTIS J, PRINTZA N, ORFANOU A, et al. Peritonitis due to Ralstonia mannitolilytica in a pediatric peritoneal dialysis patient[J]. New Microbiol, 2012, 35(4): 503–506. |
| [8] | ZONG Z Y, PENG C H. Ralstonia mannitolilytica and COPD:a case report[J]. Eur Respir J, 2011, 38(6): 1482–1483. doi:10.1183/09031936.00046011 |
| [9] | DAROY M L, LOPEZ J S, TORRES B C, et al. Identification of unknown ocular pathogens in clinically suspected eye infections using ribosomal RNA gene sequence analysis[J]. Clin Microbiol Infect, 2011, 17(5): 776–779. doi:10.1111/j.1469-0691.2010.03369.x |
| [10] | OBORNÍK M, GREEN B R. Mosaic origin of the heme biosynthesis pathway in photosynthetic eukaryotes[J]. Mol Biol Evol, 2005, 22(12): 2343–2353. doi:10.1093/molbev/msi230 |
| [11] | SAMBROOK J, FRITSCH E F, MANIATIS T. Molecular cloning:a laboratory manual[M]. 2nd ed. New York: Cold Sping Harbor Labooratory Press, 2001: 19-544. |
| [12] | COENYE T, VANDAMME P, LIPUMA J J. Infection by Ralstonia species in cystic fibrosis patients:identification of R.pickettii and R.mannitolilytica by polymerase chain reaction[J]. Emerg Infect Dis, 2002, 8(7): 692–696. doi:10.3201/eid0807.010472 |
| [13] | Clinical and Laboratory Standards Institute. M100-S25 Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing, Twenty-fifth Informational Supplement[S]. Wayne, PA:Clinical and Laboratory Standards Institute, 2015. |
| [14] | 寿晓岚, 胡玮琳, 邵泓瑜, 等. 一例败血症患者解甘露醇罗尔斯顿菌的分离与鉴定及其耐药相关基因分析[J]. 中华微生物学和免疫学杂志, 2016, 36(1): 57–63. SHOU Xiaolan, HU Weilin, SHAO Hongyu, et al. Isolation and identification of Ralstonia mannitolilytica strains from a patient with septicaemia and analysis of their drug resistance genes[J]. Chinese Journal of Microbiology and Immunology, 2016, 36(1): 57–63. (in Chinese) |
| [15] | PETERSEN T N, BRUNAK S, VON H G, et al. SignalP 4.0:discriminating signal peptides from transmembrane regions[J]. Nat Methods, 2011, 8(10): 785–786. doi:10.1038/nmeth.1701 |
| [16] | MARCHLER-BAUER A, BO Y, HAN L, et al. CDD/SPARCLE:functional classification of proteins via subfamily domain architectures[J]. Nucleic Acids Res, 2017, 45(D1): D200–D203. doi:10.1093/nar/gkw1129 |
| [17] | JHUNG M A, SUNENSHINE R H, NOBLE-WANG J, et al. A national outbreak of Ralstonia mannitolilytica associated with use of a contaminated oxygen-delivery device among pediatric patients[J]. Pediatrics, 2007, 119(6): 1061–1068. doi:10.1542/peds.2006-3739 |
| [18] | GRÖBNER S, HEEG P, AUTENRIETH I B, et al. Monoclonal outbreak of catheter-related bacteraemia by Ralstonia mannitolilytica on two haemato-oncology wards[J]. J Infect, 2007, 55(6): 539–544. doi:10.1016/j.jinf.2007.07.021 |
| [19] | 孙爱华, 方佳琪, 严杰. 病原菌耐药信号传导机制及多抗原肽疫苗研究进展与发展趋势[J]. 浙江大学学报(医学版), 2013, 42(2): 125–130. SUN Aihua, FANG Jiaqi, YAN Jie. Advance and development in research of bacterial drug-resistance signaling mechanism and multiple antigenic peptide-based vaccines[J]. Journal of Zhejiang University (Medical Sciences), 2013, 42(2): 125–130. (in Chinese) |
| [20] | ROMÃO C V, LADAKIS D, LOBO S A, et al. Evolution in a family of chelatases facilitated by the introduction of active site asymmetry and protein oligomerization[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2011, 108(1): 97–102. doi:10.1073/pnas.1014298108 |
| [21] | IOLASCON A, De FALCO L, BEAUMONT C. Molecular basis of inherited microcytic anemia due to defects in iron acquisition or heme synthesis[J]. Haematologica, 2009, 94(3): 395–408. doi:10.3324/haematol.13619 |
| [22] | FRUNZKE J, GÄTGENS C, BROCKER M, et al. Control of heme homeostasis in Corynebacterium glutamicum by the two-component system HrrSA[J]. J Bacteriol, 2011, 193(5): 1212–1221. doi:10.1128/JB.01130-10 |
| [23] | HANSSON M D, KARLBERG T, RAHARDJA M A, et al. Amino acid residues His183 and Glu264 in Bacillus subtilis ferrochelatase direct and facilitate the insertion of metal ion into protoporphyrin Ⅸ[J]. Biochemistry, 2007, 46(1): 87–94. doi:10.1021/bi061760a |
| [24] | MIELCAREK A, BLAUENBURG B, MIETHKE M, et al. Molecular insights into frataxin-mediated iron supply for heme biosynthesis in Bacillus subtilis[J]. PLoS One, 2015, 10(3): e0122538–0122552. doi:10.1371/journal.pone.0122538 |
| [25] | LOBO S A, SCOTT A, VIDEIRA M A, et al. Staphylococcus aureus haem biosynthesis:characterisation of the enzymes involved in final steps of the pathway[J]. Mol Microbiol, 2015, 97(3): 472–487. doi:10.1111/mmi.2015.97.issue-3 |
| [26] | ALMIRÍN M, MATÍNEZ M, SANJUAN N, et al. Ferrochelatase is present in Brucella abortus and is critical for its intracellular survival and virulence[J]. Infect Immun, 2001, 69(10): 6225–6230. doi:10.1128/IAI.69.10.6225-6230.2001 |