慢性脑缺血是指各种原因所致的脑血管狭窄或低灌注，脑血流长期供应不足导致脑代谢障碍和功能衰退的一个慢性过程，通常伴发于血管性痴呆、阿尔茨海默病、脑动脉粥样硬化等多种脑血管病的病理过程中，最终可导致持久或进展性认知和神经功能障碍[1]。目前对于慢性脑缺血导致的认知功能障碍与信号通路相关的机制研究相对较少。已有研究表明，慢性脑缺血引起的能量代谢障碍、蛋白质合成异常、胆碱受体缺失、神经递质改变、突触异常、神经元缺失和脑白质损害等改变，是导致慢性脑缺血患者认知和神经功能障碍的病理生理学基础[2]。
哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)信号通路是调控细胞生长增殖和蛋白质合成的重要信号通路，在神经突触可塑性、神经冲动传导、轴突生长和棘突形态改变等方面发挥重要作用。诸多研究表明，mTOR信号通路参与了脑缺血再灌注损伤，其中部分研究表明, 上调mTOR信号通路有神经保护作用[3-4]，但也有数据显示, 抑制mTOR信号通路可降低梗死体积、减少神经功能障碍[5-6]。这些不同结果可能因缺血时间、再灌注时间或动物品系的差异所致。为了明确mTOR信号通路激活在脑缺血导致认知功能损害中的作用及可能机制，本研究通过结扎右颈总动脉制备小鼠慢性脑缺血模型，观察mTOR信号通路在小鼠慢性脑缺血模型中的变化和应用抑制剂雷帕霉素的效应，并从凋亡和自噬着手对其机制进行初步探讨。
1 材料与方法 1.1 实验动物和试剂出生后6周龄的ICR小鼠126只购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，实验动物许可证：SCXK 2007-0005。动物实验及相关处理严格参照浙江大学动物管理委员会的规定执行。动物的饲养条件为温度(24±1)℃，湿度40%~60%，昼、夜各12 h。
雷帕霉素购自大连美仑生物技术有限公司；mTOR、磷酸化mTOR、S6激酶(S6K)、磷酸化S6K、S6、磷酸化S6、LC3 Ⅰ/Ⅱ、Beclin、β-actin抗体购自美国CST公司；Fluoro-jade B粉末购自美国Chemicon公司；BCA蛋白浓度测定试剂盒、辣根过氧化物酶标记的二抗、PEG400、吐温80购自南京碧云天生物技术有限公司；ECL化学发光试剂盒购自德国Millipore公司。
1.2 慢性脑缺血动物模型的建立和分组小鼠通过大脑中动脉梗死制备慢性脑缺血模型，手术过程如下：小鼠采用10%水合氯醛以300 mg/kg的剂量麻醉后，置于37 ℃恒温手术台上，取颈部正中切口，分离周围组织，暴露右颈总动脉。分离右颈总动脉，将其结扎，以造成慢性脑缺血。手术对照组不结扎，其他手术过程均相同。
在观察脑缺血对mTOR信号通路影响的实验中，小鼠被随机分为手术对照组和模型对照组(每组27只)，分别在缺血后1、3、6、24 h，3、7 d，2、4、6周共九个时间点进行蛋白质印迹法检测。在观察雷帕霉素的效应实验中，小鼠被随机分成手术对照组、模型对照组和雷帕霉素组(每组24只)。手术对照组给予与模型对照组等量的溶剂(0.1 μL/10 g体质量)，雷帕霉素组在造模24 h后腹腔注射雷帕霉素(3.0 mg/kg)，隔天给药，直至动物处死。雷帕霉素用无水乙醇溶解至30 g/L的浓度于-20℃保存，临用前用含5%吐温，80%、5%PEG400和4%乙醇(手术对照组和模型对照组注射用溶剂)新鲜配制。
1.3 蛋白质印迹法检测mTOR信号通路和自噬相关蛋白水平实验动物处死后分离大脑皮层和海马组织，用超声波粉碎仪裂解后离心取上清液，用BCA法测定蛋白质浓度。组织蛋白经SDS-PAGE分离和转膜，置于5%脱脂牛奶中室温封闭，封闭完成后分别使用相应抗体孵育，使用ECL发光剂并在暗室用胶片进行曝光，最后用Image软件分析其灰度，计算磷酸化蛋白与总蛋白或与β-actin的比值。
1.4 Fluoro-Jade B(FJB)染色检测神经元凋亡情况小鼠经水合氯醛0.5 g/kg麻醉，经心脏灌流后取出大脑，置于4%多聚甲醛中固定。先后在15%和30%的蔗糖-PBS溶液中4 ℃脱水，OCT包埋，冰冻切片机作冠状冰冻切片，存放于-20℃待用。取存放于-20 ℃的脑组织切片，自然晾干后将切片置于含1%氢氧化钠的80%乙醇溶液中，孵育5 min，然后依次转入70%乙醇和50%乙醇各浸泡2 min和去离子水洗涤2 min，置于0.06%锰酸钾溶液中避光孵育10 min后，去离子水洗涤2 min，最后放入含0.1%醋酸的0.001% FJB溶液中，避光孵育20 min，经去离子水洗脱三次，每次1 min。切片经风干后封片于荧光显微镜下观察，选定皮层和海马区分别计数，计算单位面积内FJB阳性细胞数量。
1.5 Morris水迷宫试验检测小鼠学习记忆情况水迷宫水池平均分为四个象限。训练时将平台置于其中一个象限，然后将小鼠面朝池壁放入，开启录像系统记录小鼠找到平台的游泳时间(潜伏期)和游泳路径。找到平台后让小鼠在平台上停留20 s，若无法找到平台，则由实验人员引导上台停留30 s，按最大值90 s记录潜伏期。每只小鼠每天重复四次试验，分别从四个不同象限放入，取平均值作为当日的成绩，持续4 d。第5天测试时将小鼠从对侧象限放入，记录小鼠的平台潜伏期、穿越平台次数和游泳距离。
1.6 Y迷宫试验检测小鼠学习记忆情况小鼠先行训练4 d再进行测试。训练时，将测试小鼠放入起步区给予电刺激逃至安全区，灯光持续20 s，熄灯休息30 s。然后将旧的安全区转换为起步区，同时重设安全区，开始下一轮操作。每次试验的每只小鼠重复20次为一轮，凡是小鼠一次性从起步区逃至安全区的反应称为“正确反应”。第5日进行测试，记录20次内每只小鼠的正确反应次数，计算正确反应率。
1.7 统计学方法采用SPSS 16.0软件进行统计分析。计量资料用均数±标准差(x±s)表示，多组间比较用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD检验，P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 模型对照组大脑皮层和海马组织中mTOR信号通路被激活与手术对照组比较，模型对照组大脑皮层组织中磷酸化mTOR/总mTOR、磷酸化S6K/总S6K、磷酸化S6/总S6在缺血后6 h开始上升，并持续至6周(图 1、2)。海马组织与大脑皮层中的检测结果一致，提示慢性脑缺血后组织mTOR信号通路被激活。
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| 1：手术对照组，2：模型对照组. 图 1 模型对照组术后不同时期大脑皮层组织mTOR、S6K、S6蛋白及其磷酸化蛋白的电泳图 Fig. 1 Electrophorogram of mTOR, S6K, S6 and phosphorylated proteins in cerebral cortex from mice after rUCCAO |
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| 与手术对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01. 图 2 模型对照组术后不同时期大脑皮层中S6、S6K、mTOR蛋白磷酸化水平(n=3) Fig. 2 p-mTOR/t-mTOR, p-S6K/t-S6K and p-S6/t-S6 in cerebral cortex from mice after rUCCAO (n=3) |
检测雷帕霉素给药1周和4周时小鼠大脑皮层组织中mTOR信号通路的激活情况。结果显示，与手术对照组比较，模型对照组磷酸化mTOR/总mTOR、磷酸化S6K/总S6K、磷酸化S6/总S6均显著增高，而雷帕霉素给药后可显著逆转上述蛋白的磷酸化水平，见图 3、4。小鼠海马组织与大脑皮层中的检测结果一致。结果提示雷帕霉素可以逆转由慢性脑缺血导致的mTOR信号通路异常激活。
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| 1：手术对照组; 2：模型对照组; 3：雷帕霉素组. 图 3 雷帕霉素给药1周和4周时模型小鼠大脑皮层mTOR、S6K、S6蛋白及其磷酸化蛋白的电泳图 Fig. 3 Electrophorogram of mTOR, S6K, S6 and phosphorylated proteins in cerebral cortex from rUCCAO mice one and four weeks after rapamycin administration |
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| 与手术对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与模型对照组比较，#P＜0.05. 图 4 雷帕霉素给药1周和4周时模型小鼠大脑皮层组织mTOR、S6K和S6蛋白磷酸化水平(n=6) Fig. 4 p-mTOR/t-mTOR, p-S6K/t-S6K and p-S6/t-S6 in cerebral cortex from rUCCAO mice one and four weeks after rapamycin administration (n=6) |
造模后1周和4周，与手术对照组比较，模型对照组大脑皮层组织中自噬蛋白Beclin1和LC3-Ⅱ的表达显著增加(均P＜0.05)，但雷帕霉素组自噬蛋白Beclin1和LC3-Ⅱ的表达较模型对照组显著减少(均P＜0.05)，见图 5、6。小鼠海马组织与大脑皮层中的检测结果一致。提示雷帕霉素可抑制慢性脑缺血不同时期的自噬增加。
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| 1：手术对照组; 2：模型对照组; 3：雷帕霉素组. 图 5 雷帕霉素给药1周和4周时模型小鼠大脑皮层组织Beclin1和LC3-Ⅱ蛋白表达的电泳图 Fig. 5 Electrophorogram of Beclin1 and LC3-Ⅱ in cerebral cortex from rUCCAO mice one and four weeks after rapamycin administration |
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| 与手术对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与模型对照组比较，#P＜0.05. 图 6 雷帕霉素给药1周和4周时模型小鼠大脑皮层组织Beclin1和LC3-Ⅱ蛋白表达水平(n=6) Fig. 6 Expression of Beclin1 and LC3-Ⅱ in cerebral cortex from rUCCAO mice one and four weeks after rapamycin administration (n=6) |
造模后1周时神经元细胞凋亡检测结果显示，与手术对照组比较，模型对照组在皮层组织(16.2±4.8和146.1±16.3，P＜0.01)和海马组织(12.4±4.6和87.5±13.5，P＜0.01)中FJB阳性细胞数量均增加，但雷帕霉素组大脑皮层和海马组织中FJB阳性细胞数(分别为84.5±9.6和42.0±17.2)较模型对照组均减少(均P＜0.05)，见图 7。提示雷帕霉素能够有效地抑制慢性脑缺血后的神经细胞凋亡。
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| 标尺=100 μm. 图 7 雷帕霉素给药1周时FJB染色观察小鼠大脑皮层和海马组织中神经元细胞凋亡情况 Fig. 7 Rapamycin suppresses cell apoptosis in cerebral cortex and hippocampus of rUCCAO mice one week after rapamycin administration |
Morris水迷宫和Y迷宫试验结果显示，与手术对照组比较，模型对照组平台潜伏期长，穿越平台次数少，游泳距离长(均P＜0.05)，正确反应率低(P＜0.05)；而雷帕霉素组平台潜伏期显著缩短，穿越平台次数增加，游泳距离减少(均P＜0.05)，正确反应率升高(P＜0.05)，见表 1。提示雷帕霉素能有效改善模型小鼠慢性脑缺血所致的学习记忆能力下降。
| (x±s) | |||||
| 组别 | n | 平台潜伏期(s) | 穿越平台次数 | 游泳距离(cm) | 正确反应率(%) |
| 手术对照组 | 12 | 5.7±1.4 | 6.1±0.8 | 504.9±87.6 | 58.4±12.2 |
| 模型对照组 | 12 | 11.1±2.3* | 2.8±0.9* | 672.8±128.5* | 38.5±9.2* |
| 雷帕霉素组 | 12 | 8.1±1.8# | 5.2±0.8# | 558.2±124.9# | 64.9±7.9# |
| 与手术对照组比较，*P＜0.05；与模型对照组比较，#P＜0.05. | |||||
mTOR信号通路参与神经系统多种功能的调节，其在局灶性脑缺血中的变化及意义亦有诸多研究报道。但是，是抑制还是激活mTOR信号通路对脑缺血有改善作用目前尚存在争论。有研究表明，上调mTOR信号通路可以减轻脑缺血损伤，但也有研究认为抑制mTOR信号通路对脑缺血有保护作用[7-11]。其原因可能与实验动物品系、脑缺血模型的建立方式和脑损伤的严重程度等有关。为了明确慢性脑缺血模型中mTOR信号通路的变化规律及其在脑缺血导致认知功能损害中的作用，本研究建立了右颈总动脉结扎小鼠模型，发现小鼠大脑组织mTOR信号通路在慢性脑缺血模型造模后6 h开始升高，并持续维持在高水平直到观察终止的6周时，提示右颈总动脉结扎模型小鼠大脑组织mTOR信号通路被激活。而且，mTOR抑制剂雷帕霉素可明显逆转慢性脑缺血所致的mTOR信号通路激活，并能显著缓解学习记忆障碍，提示在小鼠右颈总动脉结扎模型，抑制脑组织mTOR信号通路对脑缺血损伤有保护作用。
mTOR信号通路对自噬有调节作用[12]。自噬在缺血性脑卒中广泛存在并起重要作用，但其作用同样存在双面性[13]。适度自噬能有效清除异常和变性的细胞，但过度自噬又会导致神经元死亡、加剧神经功能损害。如Xu等[14]发现，新生低氧脑缺血大鼠中因脑组织自噬增加导致神经功能损害，大鼠成年后学习记忆能力下降。同样，Koike等[15]发现，在小鼠缺血缺氧模型中脑组织自噬激活，LC3-Ⅱ蛋白显著增加，加重神经功能损伤。刘辉玉等[16]在小鼠间歇性低氧模型中也发现脑组织自噬增加，诱导神经细胞损伤加剧。然而，Shi等[17]发现在再灌注前抑制自噬可显著增加神经元死亡。一般认为雷帕霉素抑制mTOR信号通路可诱导自噬[18-19]。但是，也有学者发现短暂性前脑缺血时mTOR信号通路和自噬相关蛋白均表达增高，雷帕霉素通过抑制mTOR信号通路激活和自噬对神经细胞损伤起保护作用[20]。本研究结果表明，慢性脑缺血后1周和4周时Beclin1和LC3-Ⅱ蛋白水平明显增加，mTOR抑制剂雷帕霉素可降低自噬相关蛋白的表达，提示在小鼠慢性脑缺血过程中自噬激活并导致神经细胞损害，雷帕霉素可抑制慢性脑缺血中诱发的过度自噬。然而，对慢性脑缺血所导致的自噬改变以及与mTOR信号通路相关的机制有待进一步研究。
缺血性脑卒中导致大量神经元会随着细胞凋亡而死亡，导致神经元损失以及学习记忆能力减退。雷帕霉素通过抑制mTOR激酶的活性影响细胞周期和细胞增殖，从而减少细胞凋亡[21-22]。本研究中FJB染色结果显示，慢性脑缺血后小鼠大脑皮层和海马组织有大量细胞凋亡，学习记忆能力下降，给予雷帕霉素后细胞凋亡减少，学习记忆能力改善。与以往诸多研究结果相同，雷帕霉素对脑缺血所致的神经细胞凋亡有保护作用。
综上所述，在小鼠慢性脑缺血中mTOR信号通路被长时间激活。抑制mTOR信号通路可减少自噬和细胞凋亡，最终减轻神经细胞损害。
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