脑白质疏松在磁共振T2加权或液体衰减反转恢复(FLAIR)序列上表现为双侧侧脑室周围或皮质下白质多发的点状、斑片状或融合性高信号病灶，又称为脑白质高信号(white matter hyperintensity)。脑白质高信号是脑卒中和痴呆的重要危险因素[1]。脑微出血(cerebral microbleeds)在梯度回波(gradient recalled echo)T2*序列或磁敏感加权成像(susceptibility weighted imaging)序列上显示为脑实质内边缘清晰的微小、圆形低信号病灶，是原发性脑实质出血和脑梗死后出血转化的危险因素[2-3]。前瞻性随访研究发现，伴有严重脑白质高信号的脑卒中患者再发脑梗死的风险大，而同时伴有严重脑白质高信号和脑微出血患者再发脑出血的风险更大[4]。
研究发现，同型半胱氨酸(homocysteine)是脑白质高信号和脑微出血的危险因素，而叶酸参与体内同型半胱氨酸的代谢[5-6]。一项安慰剂对照临床研究结果显示，补充叶酸、维生素B12和维生素B6能够有效延缓重度脑白质高信号的病灶进展[7]，但该研究未评估用药前后血清同型半胱氨酸水平的变化，故无法明确疗效是得益于同型半胱氨酸水平下降还是叶酸、维生素B12或维生素B6的直接作用。一项meta分析结果提示，补充叶酸可以改善血管内皮功能，且该效应可能独立于血清同型半胱氨酸水平的改变[8]。近年研究发现，叶酸水平与人体外周血或脑脊液的炎症状态、氧化应激水平及抗氧化能力等密切相关，可能具备独立的血管内皮保护功能[9]。本研究通过回顾性分析连续收集的脑白质高信号患者的临床资料，探讨血清叶酸水平与脑白质高信号严重程度以及合并脑微出血的相关性，为脑小血管病的防治寻找潜在的可干预因素。
1 对象与方法 1.1 研究对象回顾性分析2011年7月至2016月2月浙江大学医学院附属第二医院神经内科连续收集的317例脑白质高信号患者的临床资料。患者入选标准：①年龄不小于40岁；②经头颅MRI(T2-Flair序列)证实存在脑白质高信号，且符合疑似血管源性脑白质高信号的影像学诊断标准[10]；③签署书面知情同意书。排除标准：①其他原因所致的脑白质高信号，如外伤、免疫、炎症、代谢、中毒、感染及明确诊断的伴皮质下梗死及白质脑病的常染色体显性遗传性脑动脉病等；②既往有脑出血、蛛网膜下腔出血、血管畸形以及颅内手术病史；③头颅MRI检查证实存在皮层梗死或皮层下非腔隙性梗死灶；④近期叶酸用药史或叶酸水平高于正常范围上限。排除未测定血清叶酸水平者83例、入组前服用叶酸者3例和基因检测确诊为伴皮质下梗死和白质脑病的常染色体显性遗传性脑动脉病患者3例，最终228例患者纳入本研究。
228例脑白质高信号患者中，女性103例(45.18%)，重度脑白质高信号者149例(65.35%)。共有183例脑白质高信号患者完成脑微出血的评估，其中脑白质高信号伴脑微出血患者88例(48.09%)。
按照血清叶酸水平，将患者分为叶酸缺乏组(＜6.80 nmol/L)、低叶酸组(6.80~＜15.68 nmol/L)和高叶酸组(≥15.68 nmol/L)；血清同型半胱氨酸>20 μmol/L定义为高同型半胱氨酸血症；血清维生素B12＜156 pmol/L定义为维生素B12缺乏。
在高叶酸组、低叶酸组和叶酸缺乏组中，存在重度脑白质高信号的比例分别为52.88%、73.33%和89.47%，合并脑微出血的比例分别为36.25%、55.81%和64.71%，存在高同型半胱氨酸血症的比例分别为4.81%、12.50%和55.56%。
1.2 临床资料收集和整理收集患者的年龄，性别，常见脑血管危险因素如高血压、糖尿病、高脂血症、吸烟和饮酒史等，以及实验室检查结果如血常规、肝肾功能、血糖、血脂、凝血功能、同型半胱氨酸、叶酸和维生素B12水平等。
1.3 多模式MRI检查及参数所有序列均在Signa Excite HD 3.0 T磁共振成像系统(美国通用电气公司)上完成。SWI序列参数如下：平行前联合至后联合(AC-PC)连线的轴向扫描，使用包含11个等距回波时间的三维梯度回波，参数如下：重复时间/回波时间=58/4.5 ms，视野=24 cm×24 cm；矩阵大小=256 mm×256 mm，翻转角=20°，层厚=2.0 mm，无层间距，分辨率=(0.4688 mm×0.4688 mm)/像素。T2-Flair序列参数如下：重复时间/回波时间=8400/152 ms，反转时间=2100 ms，翻转角=90°，层厚=4.0 mm，无层间距，矩阵大小=256 mm×256 mm，视野=24 cm×24 cm。
1.4 脑白质高信号严重程度、腔隙性脑梗死、脑微出血的评估使用Fazekas量表(0~6分)[11]：在T2-Flair序列上分别评估脑室旁和深部脑白质高信号病灶，并将两部分得分相加得到总分。脑室旁脑白质高信号评分：无病变为0分；帽状或者铅笔样薄层病变为1分；病变呈光滑晕圈为2分；不规则的脑室旁高信号，延伸到深部白质为3分。深部脑白质高信号评分：无病变为0分；点状病变为1分；病变开始融合为2分；病变大面积融合为3分。根据Fazekas总分，将患者分为轻度脑白质高信号组(0~3分)和重度脑白质高信号组(4~6分)。
陈旧性腔隙性脑梗死定义为穿支动脉病变所致的陈旧性小梗死灶，直径3~15 mm，位于半卵圆中心、基底节、丘脑、脑干或小脑等部位，在T2-Flair序列上信号与脑脊液类似，病灶周围可伴高信号[10]。新近腔隙性脑梗死定义为弥散加权序列(DWI)上述部位所见直径不大于20 mm的高信号病灶。腔隙性脑梗死包括上述陈旧性腔隙性脑梗死和新近腔隙性脑梗死。
脑微出血参考以下标准[12]：①磁敏感加权成像序列上均一的低信号(黑色)病灶，确保病灶是顺磁性物质以及可能含有血液降解成分；②呈圆形或卵圆形(而非线性)，以除外血管；③直径通常为5~10 mm；④T1、T2序列上无高信号表现，排除海绵状血管瘤、转移性黑色素瘤等；⑤病灶被脑实质包绕至少一半，除外非常浅表的病灶；⑥排除外伤等继发可能。
本研究对脑白质高信号严重程度以及是否存在腔隙性脑梗死和脑微出血的评估由两名有经验的神经科专业的博士研究生独立完成，若评估结果不一致，则需商议后取得共识。两人均不知晓评估对象的病情和临床资料。
1.5 统计学方法用SPSS 21.0软件进行统计学分析。正态分布的计量资料用均数±标准差(x±s)表示，行独立样本t检验；不符合正态分布的计量资料用中位数(四分位数区间)[M(Q1~Q3)]表示，采用Mann-Whitney U检验。计数资料用n(%)表示，行卡方检验，统计学显著性水平定义为双侧检验。单因素分析中P≤0.1的变量进入二元logistic回归分析模型(后退法)，其中年龄和高血压以连续变量形式，叶酸、维生素B12和同型半胱氨以分类变量形式强制纳入多因素分析。P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 血清叶酸水平与脑白质高信号的相关性分析单因素分析发现，与轻度脑白质高信号组比较，重度脑白质高信号组叶酸、维生素B12和血红蛋白水平低，而同型半胱氨酸和血肌酐水平高，存在腔隙性脑梗死的比例也高，见表 1。二元logistic回归分析发现，叶酸水平与脑白质高信号的严重程度相关，低叶酸和叶酸缺乏的患者更容易出现重度脑白质高信号，见表 2。
| [(x±s)或n(%)或M(Q1~Q3)] | ||||
| 相关因素 | 轻度脑白质高信号组(n=79) | 重度脑白质高信号组(n=149) | 检验值 | P值 |
| 年龄(岁) | 67±8 | 68±10 | -1.464 | ＞0.1 |
| 女性 | 37(46.84) | 66(44.30) | 0.134 | ＞0.1 |
| 高血压 | 52(65.82) | 109(73.15) | 1.337 | ＞0.1 |
| 糖尿病 | 21(26.58) | 39(26.17) | 0.004 | ＞0.1 |
| 高脂血症 | 15(19.00) | 27(18.12) | 0.026 | ＞0.1 |
| 腔隙性脑梗死 | 26(32.91) | 79(53.02) | 8.403 | ＜0.01 |
| 吸烟史 | 11(13.92) | 31(20.81) | 1.627 | ＞0.1 |
| 饮酒史 | 11(13.92) | 22(14.77) | 0.030 | ＞0.1 |
| 血糖水平(mmol/L) | 5.8±1.9 | 5.5±1.6 | 1.267 | ＞0.1 |
| 血红蛋白水平(g/L) | 133±14 | 129±15 | 1.976 | ＜0.05 |
| 血小板数(×109/L) | 190±61 | 184±57 | 0.697 | ＞0.1 |
| 叶酸水平(nmol/L) | 17.46(11.8~24.23) | 13.82(8.87~19.10) | -3.490 | ＜0.01 |
| 同型半胱氨酸水平(μmol/L) | 11.50(9.70~14.20) | 12.95(10.50~16.40) | -2.775 | ＜0.01 |
| 维生素B12水平(pmol/L) | 330.5(251.50~451.25) | 294.00(213.00~381.00) | -2.057 | ＜0.05 |
| 血肌酐水平(μmol/L) | 64±16 | 70±20 | -2.337 | ＜0.05 |
| 总胆固醇水平(mmol/L) | 4.5±1.1 | 4.4±1.0 | 1.147 | ＞0.1 |
| 三酰甘油水平(mmol/L) | 1.7±0.9 | 1.5±0.8 | 0.957 | ＞0.1 |
| 低密度脂蛋白水平(mmol/L) | 2.6±0.9 | 2.5±0.8 | 0.288 | ＞0.1 |
| 高密度脂蛋白水平(mmol/L) | 1.1±0.5 | 1.2±0.7 | -0.825 | ＞0.1 |
| 国际标准化比值 | 1.02±0.07 | 1.00±0.13 | 0.743 | ＞0.1 |
| 相关因素 | OR值 | 95%CI | P值 |
| 年龄 | 1.015 | 0.981~1.049 | ＞0.05 |
| 高血压 | 1.305 | 0.669~2.546 | ＞0.05 |
| 血红蛋白 | 0.974 | 0.951~0.997 | ＜0.05 |
| 血肌酐 | 1.019 | 0.998~1.041 | ＞0.05 |
| 低叶酸 | 2.109 | 1.112~4.001 | ＜0.05 |
| 叶酸缺乏 | 6.383 | 1.168~34.866 | ＜0.05 |
| 高同型半胱氨酸血症 | 0.685 | 0.228~2.060 | ＞0.05 |
| 维生素B12缺乏 | 0.791 | 0.211~2.962 | ＞0.05 |
| 腔隙性脑梗死 | 1.997 | 1.055~3.783 | ＜0.05 |
单因素分析显示，与不伴脑微出血组比较，脑白质高信号伴脑微出血组血清叶酸和总胆固醇水平低，而血肌酐高、吸烟史、重度脑白质高信号和腔隙性脑梗死比例高，见表 3。二元logistic回归分析显示，脑白质高信号合并脑微出血与女性、高同型半胱氨酸血症、总胆固醇水平、重度脑白质高信号和腔隙性脑梗死独立相关，但血清叶酸水平与脑白质高信号合并脑微出血无独立相关性，见表 4。
| [(x±s)或n(%)或M(Q1~Q3)] | ||||
| 相关因素 | 伴脑微出血(n=95) | 不伴脑微出血(n=88) | 检验值 | P值 |
| 年龄(岁) | 68±10 | 67±10 | -0.545 | ＞0.05 |
| 女性 | 55(57.89) | 31(35.23) | 9.423 | ＜0.01 |
| 高血压 | 65(68.42) | 69(78.41) | 2.324 | ＞0.05 |
| 糖尿病 | 20(21.05) | 26(29.89) | 1.751 | ＞0.05 |
| 高脂血症 | 21(22.11) | 12(13.64) | 2.217 | ＞0.05 |
| 腔隙性脑梗死 | 35(36.84) | 57(64.77) | 14.256 | ＜0.01 |
| 重度脑白质高信号 | 46(48.42) | 72(81.82) | 22.247 | ＜0.01 |
| 吸烟史 | 13(13.68) | 23(26.14) | 4.483 | ＜0.05 |
| 饮酒史 | 11(11.58) | 15(17.05) | 1.120 | ＞0.05 |
| 血糖水平(mmol/L) | 5.46±1.47 | 5.68±1.79 | 0.887 | ＞0.05 |
| 血红蛋白水平(g/L) | 130±14 | 131±17 | 0.169 | ＞0.05 |
| 血小板数(×109/L) | 187±65 | 185±56 | -0.245 | ＞0.05 |
| 叶酸水平(nmol/L) | 16.51(10.89~23.60) | 13.42(9.09~16.40) | -3.213 | ＜0.01 |
| 同型半胱氨酸水平(μmol/L) | 12.00(10.10~14.60) | 13.30(10.50~17.00) | -2.524 | ＜0.05 |
| 维生素B12水平(pmol/L) | 313.00(221.75~458.00) | 307.00(217.00~383.00) | -0.608 | ＞0.10 |
| 血肌酐水平(μmol/L) | 63±17 | 72±20 | 3.551 | ＜0.01 |
| 总胆固醇水平(mmol/L) | 4.6±1.0 | 4.2±1.0 | -3.105 | ＜0.01 |
| 三酰甘油水平(mmol/L) | 1.6±0.9 | 1.5±0.7 | -1.392 | ＞0.10 |
| 低密度脂蛋白水平(mmol/L) | 2.7±0.8 | 2.5±0.8 | -1.573 | ＞0.10 |
| 高密度脂蛋白水平(mmol/L) | 1.15±0.26 | 1.11±0.28 | -1.004 | ＞0.10 |
| 国际标准化比值 | 1.02±0.16 | 1.00±0.07 | 0.339 | ＞0.10 |
| 相关因素 | OR值 | 95%CI | P值 |
| 年龄 | 0.973 | 0.938~1.009 | ＞0.05 |
| 女性 | 0.436 | 0.202~0.942 | ＜0.05 |
| 高血压 | 1.619 | 0.705~3.719 | ＞0.05 |
| 总胆固醇 | 0.582 | 0.387~0.877 | ＜0.05 |
| 低叶酸 | 1.362 | 0.618~3.000 | ＞0.05 |
| 叶酸缺乏 | 0.889 | 0.216~3.658 | ＞0.05 |
| 高同型半胱氨酸血症 | 4.732 | 1.371~16.336 | ＜0.05 |
| 维生素B12缺乏 | 0.475 | 0.101~2.244 | ＞0.05 |
| 腔隙性脑梗死 | 3.021 | 1.427~6.397 | ＜0.01 |
| 重度脑白质高信号 | 4.434 | 1.989~9.886 | ＜0.01 |
脑白质高信号和脑微出血并存给脑卒中一级或二级预防中抗血小板或抗凝药物的使用带来巨大困扰。明确脑白质高信号和脑微出血的发生机制及相关影响因素，对于延缓或预防其发生非常重要。既往研究显示，脑白质高信号和脑微出血与患者血清同型半胱氨酸的水平相关：Wong等[5]对57例脑小血管病相关卒中患者的研究发现，在校正了年龄和叶酸水平后，高同型半胱氨酸血症与脑白质高信号相关；Han等[6]对缺血性脑卒中患者的研究发现，同型半胱氨酸水平与脑微出血的发生风险正相关；另有研究表明，高同型半胱氨酸血症可通过N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受体介导引起细胞间黏附及紧密连接等结构的改变，从而导致血脑屏障的通透性增加[13]，而血脑屏障的破坏可能是脑微出血的重要发病机制[14]。本研究也证实，高同型半胱氨酸血症与脑白质高信号合并脑微出血存在独立相关性，与之前研究报道的结果一致。
有研究显示，同型半胱氨酸水平与机体内的叶酸水平密切相关。叶酸的重要生理功能之一是以四氢叶酸的形式作为甲基供体，在辅酶维生素B12的共同参与下，实现同型半胱氨酸向蛋氨酸的生理转化，同时降低同型半胱氨酸水平[9]。本文资料显示，叶酸缺乏组存在高同型半胱氨酸血症的患者比例高达55.5%，是高叶酸组的10倍以上，证实了叶酸水平与同型半胱氨酸水平呈负相关，与以往的研究结果相符。
叶酸水平与脑白质高信号和脑微出血是否也具有相关性呢？既往以中年抑郁症患者为研究对象的小样本研究结果提示，脑白质高信号的严重程度与叶酸缺乏独立相关，但与高同型半胱氨酸血症和维生素B12缺乏无显著相关性[15]，这与我们的研究结果一致。文中资料还提示，即便叶酸水平处于正常生理范围，低叶酸组发生重度脑白质高信号的风险仍为高叶酸组的两倍以上。我们推测这可能与叶酸本身具有保护血管内皮功能，降低炎症反应和氧化应激水平等作用有关[9, 16]。同时，叶酸作为一碳单位循环的重要中间供体参与各种甲基化过程，可能也为髓鞘的再生和修复等生理过程直接或间接所需。补充叶酸是否可延缓脑白质高信号的进展，有待前瞻性干预研究的进一步探讨。
在关于叶酸水平与脑白质高信号伴脑微出血的相关性研究中，单因素分析结果显示脑白质高信号伴脑微出血组的叶酸水平显著高于无脑微出血组，但在校正了高同型半胱氨酸血症后，叶酸水平与脑白质高信号伴脑微出血并未显示独立相关性。分析原因可能是脑白质高信号和脑微出血的发生和发展涉及不同的炎症过程缘故。最近的一项大样本临床研究发现，伴脑微出血者的TNF受体水平显著增高，而伴严重脑白质高信号者则以细胞间黏附分子1和脂蛋白相关磷脂酶A2的水平升高更明显[17]。此外还有研究发现，脑白质高信号是由于穿支动脉管壁的增厚和管腔狭窄导致脑灌注不足引起[18]，而脑微出血的发生则是由于血脑屏障破坏和血管壁的脆性增加所致[14]。尽管叶酸具有血管内皮保护功能，但其内在的分子生物学机制尚不明确。因此，血清叶酸水平与脑微出血之间的相关性仍需进一步研究证实。
我们的研究存在不足之处。首先，横断面研究难以明确相关结论的因果联系，后续的随访研究将进一步明确基线叶酸水平与脑白质高信号进展风险的相关性。其次，本研究的对象均为就诊的脑白质高信号患者，无健康的社区人群，故存在一定的选择性偏倚。如本研究未发现年龄和高血压与脑白质高信号严重程度及脑微出血的相关性，可能由于组间比较的是轻度与重度脑白质高信号患者，而不是以无脑白质高信号的健康人群作对照，这可能会弱化组间差异从而造成阴性结论的偏倚，但不会影响阳性结果的可靠性。
总之，本研究表明血清叶酸水平低与重度脑白质高信号独立相关。未来补充叶酸或许有助于延缓脑白质高信号的进展，而该过程伴随同型半胱氨酸水平的下降又能进一步降低脑白质高信号并发脑微出血的风险。
| [1] | DEBETTE S, MARKUS H S. The clinical importance of white matter hyperintensities on brain magnetic resonance imaging:systematic review and meta-analysis[J]. BMJ, 2010, 341: c3666. doi:10.1136/bmj.c3666 |
| [2] | LEE S H, BAE H J, KWON S J, et al. Cerebral microbleeds are regionally associated with intracerebral hemorrhage[J]. Neurology, 2004, 62(1): 72–76. doi:10.1212/01.WNL.0000101463.50798.0D |
| [3] | CHARIDIMOU A, SHOAMANESH A. Clinical relevance of microbleeds in acute stroke thrombolysis:Comprehensive meta-analysis[J]. Neurology, 2016, 87(15): 1534–1541. doi:10.1212/WNL.0000000000003207 |
| [4] | NAKA H, NOMURA E, TAKAHASHI T, et al. Combinations of the presence or absence of cerebral microbleeds and advanced white matter hyperintensity as predictors of subsequent stroke types[J]. AJNR Am J Neuroradiol, 2006, 27(4): 830–835. |
| [5] | WONG A, MOK V, FANY H, et al. Hyperhomocysteinemia is associated with volumetric white matter change in patients with small vessel disease[J]. J Neurol, 2006, 253(4): 441–447. doi:10.1007/s00415-005-0022-x |
| [6] | HAN S, LIEBESKIND D S, OVBIAGELE B, et al. Serum homocysteine levels are associated with the presence of cerebral microbleeds in ischemic stroke and TIA patients[J]. Neurology, 2009, 72(11): A196. |
| [7] | CAVALIERI M, SCHMIDT R, CHEN C, et al. B vitamins and magnetic resonance imaging-detected ischemic brain lesions in patients with recent transient ischemic attack or stroke:the VITAmins TO Prevent Stroke (VITATOPS) MRI-substudy[J]. Stroke, 2012, 43(12): 3266–3270. doi:10.1161/STROKEAHA.112.665703 |
| [8] | DE BREE A, VAN MIERLO L A, DRAIJER R. Folic acid improves vascular reactivity in humans:a meta-analysis of randomized controlled trials[J]. Am J Clin Nutr, 2007, 86(3): 610–617. |
| [9] | GUEST J, BILGIN A, HOKINB, et al. Novel relationships between B12, folate and markers of inflammation, oxidative stress and NAD(H) levels, systemically and in the CNS of a healthy human cohort[J]. Nutr Neurosci, 2015, 18(8): 355–364. doi:10.1179/1476830515Y.0000000041 |
| [10] | WARDLAW J M, SMITH E E, BIESSELS G J, et al. Neuroimaging standards for research into small vessel disease and its contribution to ageing and neurodegeneration[J]. Lancet Neurol, 2013, 12(8): 822–838. doi:10.1016/S1474-4422(13)70124-8 |
| [11] | FAZEKAS F, CHAWLUK J B, ALAVI A, et al. MR signal abnormalities at 1.5 T in Alzheimer's dementia and normal aging[J]. AJR Am J Roentgenol, 1987, 149(2): 351–356. doi:10.2214/ajr.149.2.351 |
| [12] | GREENBERG S M, VERNOOIJ M W, CORDONNIER C, et al. Cerebral microbleeds:a guide to detection and interpretation[J]. Lancet Neurol, 2009, 8(2): 165–174. doi:10.1016/S1474-4422(09)70013-4 |
| [13] | BEARD R S, REYNOLDS J J, BEARDEN S E. Hyperhomocysteinemia increases permeability of the blood-brain barrier by NMDA receptor-dependent regulation of adherens and tight junctions[J]. Blood, 2011, 118(7): 2007–2014. doi:10.1182/blood-2011-02-338269 |
| [14] | CHARIDIMOU A, WERRING D J. Cerebral microbleeds:detection, mechanisms and clinical challenges[J]. Future Neurol, 2011, 6(5): 587–611. doi:10.2217/fnl.11.42 |
| [15] | IOSIFESCU D V, PAPAKOSTAS G I, LYOOI K, et al. Brain MRI white matter hyperintensities and one-carbon cycle metabolism in non-geriatric outpatients with major depressive disorder (Part Ⅰ)[J]. Psychiatry Res, 2005, 140(3): 291–299. doi:10.1016/j.pscychresns.2005.09.003 |
| [16] | CHENG F, LAN J, XIA W, et al. Folic acid attenuates vascular endothelial cell injury caused by hypoxia via the inhibition of ERK1/2/NOX4/ROS pathway[J]. Cell Biochem Biophys, 2016, 74(2): 205–211. doi:10.1007/s12013-016-0723-z |
| [17] | SHOAMANESH A, PREIS S R, BEISERA S, et al. Inflammatory biomarkers, cerebral microbleeds, and small vessel disease:Framingham Heart Study[J]. Neurology, 2015, 84(8): 825–832. doi:10.1212/WNL.0000000000001279 |
| [18] | PANTONI L. Pathophysiology of age-related cerebral white matter changes[J]. Cerebrovasc Dis, 2002, 13 Suppl 2: 7–10. |