2. 蚌埠市第三人民医院普外肿瘤科, 安徽 蚌埠 233000;
3. 蚌埠医学院生物化学与分子生物学教研室, 安徽 蚌埠 233000;
4. 蚌埠医学院生物技术教研室, 安徽 蚌埠 233000
2. Department of Surgical Oncology, Bengbu Third People's Hospital, Bengbu 233000, China;
3. Department of Biochemistry & Molecular Biology, Bengbu Medical College, Bengbu 233000, China;
4. Department of Biotechnology, Bengbu Medical College, Bengbu 233000, China
乳腺癌是当今中国女性最常见的癌症。了解乳腺癌发生、发展和转移的分子生物学机制对于乳腺癌治疗策略研究非常关键。研究表明，CXC趋化因子受体4(CXC chemokine receptor 4，CXCR4)在包括乳腺癌在内的多种肿瘤细胞中表达上调[1-4]，其表达异常与乳腺癌的转移也密切相关[5]。大量研究显示：S期激酶相关蛋白2(S-phase kinase-associated protein 2，Skp2)在约50%的乳腺癌患者细胞中高表达, 且其在细胞周期的进展中发挥重要作用，能特异性地识别磷酸化底物并介导其泛素化降解[6-7]。CXCR4介导的乳腺癌发生发展是否与Skp2介导的细胞周期调控有关，尚未见文献报道。本研究旨在研究CXCR4对Skp2表达的调控作用及与乳腺癌细胞周期的影响，完善CXCR4促进乳腺癌进展的机制，为乳腺癌的预防及临床治疗提供新的靶点和思路。
1 材料与方法 1.1 材料人乳腺癌细胞株SKBR-3和MDA-MB-231购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心；ABI 7500 Fast实时荧光定量PCR仪购自美国应用生物系统公司；FBS购自美国Hyclone公司；DMEM培养基购自美国Gibco公司；TRIzol试剂和Lipofectamine 2000购自美国Invitrogen公司；逆转录试剂盒购自美国Fermentas公司；荧光定量PCR试剂盒购自宝生物工程(大连)有限公司；兔抗人CXCR4、Skp2、Akt、ERK抗体购自英国Abcam公司；P21、P27、FOXO1抗体及LY294002(工作浓度25 μmol/L)购自美国Cell Signaling Technology公司；c-Myc、CyclinD1、磷酸化Akt、磷酸化ERK抗体购自美国Proteintech公司；β-actin抗体购自美国Santa Cruz公司；U0126(工作浓度10 μmol/L)购自上海碧云天生物技术有限公司；辣根过氧化物酶(HRP)标记山羊抗兔IgG购自北京中杉金桥生物技术有限公司；聚偏二氟乙烯(PVDF)膜、电化学发光(ECL)试剂盒购自美国Millipore公司。所有引物合成和DNA序列测定由南京金斯瑞生物科技有限公司完成；过表达CXCR4的MDA-MB-231细胞株(过表达CXCR4细胞)和干扰CXCR4的SKBR-3细胞株(干扰CXCR4细胞)由本项目组构建并筛选保存[8]。
1.2 细胞培养将人乳腺癌细胞株SKBR-3和MDA-MB-231接种于含10%FBS的新鲜DMEM培养液中，置37 ℃、5%二氧化碳、饱和湿度培养箱中培养，2~3 d传代一次，所有实验均采用对数生长期细胞。
1.3 实时定量PCR检测Skp2及其下游相关基因的表达TRIzol法提取总RNA，根据逆转录试剂说明书进行逆转录反应，按照荧光定量试剂盒说明书用实时定量PCR仪进行实时定量PCR检测。以GAPDH为内参，所用的引物序列见表 1。相对表达量计算公式为2-ΔΔCT，相关基因表达的ΔΔCT=CT值(实验组目的基因-实验组GAPDH)-CT值(对照组目的基因-对照组GAPDH)；结果数据利用GraphPad Prism 5作图及统计学分析。
| 引物名称 | 上游(5′→3′) | 下游(5′→3′) |
| Skp2 | TGCTAAGCAGCTGTTCCAGA | AAGATTCAGCTGGGTGATGG |
| P21 | GCGGAACAAGGAGTCAGACAT | CCCAATACTCCAAGTACACTAAGCA |
| P27 | TGCAACCGACGATTCTTCTACTCAA | CAAGCAGTGATGTATCTGATAAACAAGG |
| FOXO1 | TGTCCCTACACAGCAAGTTCA | CACCCTCTGGATTGAGCATC |
| c-Myc | GCGACTCTGAGGAGGAACA | TGAGGACCAGTGGGCTGT |
| CyclinD1 | GTGGCCTCTAAGATGAAGGAGA | GGAAGTGTTCAATGAAATCGTG |
| GAPDH | CAGCCTCAAGATCATCAGCA | TGTGGTCATGAGTCCTTCCA |
胰蛋白酶消化对数生长期细胞，加入蛋白裂解液(RIPA:PMSF=99:1)，充分吹打混匀，冰上放置30 min，4 ℃离心取上清液；采用蛋白质二喹啉甲酸法(BCA法)进行蛋白定量分析；10% SDS-PAGE，蛋白样品上样量为25 μg，蛋白标记物上样量为5 μL；电泳结束后转至PVDF膜，5%脱脂奶粉室温封闭3 h，孵育一抗4 ℃过夜(Skp2、P21、P27、FOXO1、c-Myc、CyclinD1、磷酸化Akt、磷酸化ERK工作浓度为1:1000，Akt、ERK工作浓度为1:2000，β-actin工作浓度为1:3000)，TBST缓冲液洗膜三次，每次10 min；HRP标记的相应二抗(羊抗兔/鼠IgG 1:5000)37 ℃孵育2 h后，TBST缓冲液洗膜三次，每次10 min；PVDF膜化学发光显影，BIO-RAD成像系统拍照，AlphaVIEW SA凝胶成像分析软件灰度扫描，定量分析各蛋白含量。
1.5 碘化丙啶(PI)染色检测细胞周期分布取对数生长期SKBR-3和干扰CXCR4细胞用胰蛋白酶消化，离心收集细胞，4 ℃预冷PBS洗涤细胞两次，弃上清液；加入4 ℃预冷的70%乙醇重悬细胞，4 ℃固定过夜；离心收集固定完全的细胞，弃去70%乙醇；4 ℃预冷的PBS洗涤细胞两次，弃上清液后各组加入500 μL 4 ℃预冷的PI染色液(5 mg PI+2 mg RNaseA+0.1 mL 1.0% Trition X-100+3.7 mg EDTA+10 mL PBS，棕色瓶4 ℃保存，工作浓度为50 μg/mL)重悬细胞，避光染色30 min；流式细胞仪检测，结果采用ModFit LT 3.0软件进行分析。每组实验重复三次。
1.6 统计学方法所有数据采用SPSS 13.0统计软件处理，正态分布的计量资料以均数±标准差(x±s)表示，均数间差异比较用t检验，多组样本均数之间差异采用方差分析，P＜0.05表示差异有统计学意义。
2 结果 2.1 CXCR4调控乳腺癌细胞Skp2的表达检测过表达和干扰CXCR4细胞中Skp2的mRNA及蛋白表达, 结果显示，相对于SKBR-3和MDA-MB-231细胞，干扰CXCR4的细胞中Skp2的mRNA表达明显下降(分别为1.00±0.15和0.30±0.06，P＜0.01)，而过表达CXCR4的细胞中Skp2的mRNA表达水平明显升高(分别为1.00±0.14和1.54±0.15，P＜0.05)；蛋白表达变化与mRNA表达一致(图 1)。提示CXCR4信号通路可能调控Skp2的表达。
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| 1：SKBR-3，2：干扰CXCR4细胞，3：MDA-MB-231，4：过表达CXCR4细胞. 图 1 干扰及过表达CXCR4后乳腺癌细胞Skp2蛋白表达的电泳图 Fig. 1 Electrophorogram of Skp2 expression changes in CXCR4-downregulated and upregulated strains |
干扰CXCR4表达后, Akt、ERK的磷酸化水平明显降低; 而过表达CXCR4后，Akt、ERK的磷酸化水平明显升高(图 2)。在SKBR-3细胞中干扰CXCR4与PI3K/Akt通路抑制剂LY294002和ERK通路抑制剂U0126联合作用后，降低Skp2的效果更加显著(图 3)。提示CXCR4可能通过Akt、ERK信号通路调控Skp2的表达。
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| 1：SKBR-3，2：干扰CXCR4细胞，3：MDA-MB-231，4：过表达CXCR4细胞. 图 2 干扰及过表达CXCR4后乳腺癌细胞相关信号蛋白的表达变化 Fig. 2 Electrophorogram of the expression of signaling proteins in CXCR4-downregulated and upregulated strains |
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| 1：SKBR-3，2：干扰CXCR4细胞，3：干扰CXCR4细胞+LY294002，4：干扰CXCR4细胞+U0126. 图 3 干扰CXCR4与LY294002、U0126联合作用后乳腺癌细胞Skp2的表达变化 Fig. 3 Effects of CXCR4 plus LY294002 or U0126 on the expression of Skp2 |
干扰CXCR4表达后，P21、P27、FOXO1的mRNA及蛋白水平较空白对照组明显升高，c-Myc、CyclinD1的mRNA及蛋白水平明显下降；过表达CXCR4后，结果与上述相反，见图 4、5。提示CXCR4可能通过对Skp2的调控影响其下游相关基因的表达。
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| 1：SKBR-3，2：干扰CXCR4细胞，3：MDA-MB-231，4：过表达CXCR4细胞. 图 4 干扰及过表达CXCR4后乳腺癌细胞Skp2下游相关基因表达的电泳图 Fig. 4 Electrophorogram of the expression of Skp2 downstream related genes in CXCR4-downregulated and upregulated strains |
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| A:干扰CXCR4后Skp2下游基因mRNA表达变化; B:过表达CXCR4后Skp2下游基因mRNA表达变化.与空白对照组(SKBR-3和MDA-MB-231)比较, *P＜0.05, **P＜0.01. 图 5 干扰及过表达CXCR4后细胞Skp2下游相关基因mRNA表达水平的改变 Fig. 5 mRNA expression of Skp2 downstream related genes in CXCR4-downregulated and upregulated strains |
相对于空白对照组，干扰CXCR4后SKBR-3细胞G0/G1期细胞比例增加，S期、G2/M期细胞比例下降; 与LY294002及U0126联合作用后，G0/G1期阻滞更加明显(图 6、7)。提示CXCR4可通过PI3K/Akt、ERK调控Skp2，从而对细胞周期产生影响。
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| A：干扰CXCR4细胞及LY294002对细胞周期的影响; B:干扰CXCR4细胞及U0126对细胞周期的影响. 图 6 流式细胞术检测CXCR4及LY294002、U0126作用后SKBR-3细胞周期分布 Fig. 6 Cell cycles of SKBR-3 with the influence of CXCR4, LY294002 and U0126 |
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| 与SKBR-3比较, *P＜0.05;与干扰CXCR4细胞比较，#P＜0.05. 图 7 CXCR4及LY294002、U0126作用后SKBR-3细胞周期分布的变化 Fig. 7 Effect of CXCR4, LY294002 and U0126 on SKBR-3 cell cycle |
CXCR4为七次跨膜的G蛋白偶联受体，通过与CXCL12(SDF-1α)结合，激活细胞内的一系列信号转导通路及效应分子，从而诱发肿瘤细胞的增殖、侵袭、迁移及血管形成，在肿瘤的进展中发挥重要作用[9-11]。我们前期研究证实了CXCR4表达是乳腺癌细胞侵袭和转移的关键调控因子[8]。下调CXCR4的表达可诱导细胞周期阻滞，G0/G1期比例增加，S期、G2/M期比例相应下降，从而抑制细胞的增殖[12-13]。我们前期也证实了CXCR4抑制性多肽可通过靶向阻断CXCR4信号，阻滞SDF-1α诱导的细胞周期[14]，表明SDF-1α/CXCR4生物轴可通过Akt和ERK信号通路调控乳腺癌的细胞周期。
Skp2是由Demetrick等[15]发现的一种连接S期激酶Cdk2/CyclinA的蛋白，是细胞周期的一个重要F-box蛋白[16]。Skp2是泛素连接酶E3的重要组成部分[17]，与SCF(Skp1-cullin-F-box蛋白)组成复合物能够特异性地识别多种磷酸化底物并介导其泛素化降解，从而正向调控G1/S期。目前已经发现Skp2与细胞周期相关的底物有CyclinD1、c-Myc、P21、P27、P57等[18-20]。Skp2过表达于多种肿瘤细胞，发挥癌基因的作用[21-22]，且与肿瘤的分化程度、恶性进程和临床预后密切相关[23-24]。前期研究发现，在乳腺癌耐药细胞中干扰Skp2的表达，可以有效地抑制细胞的迁移和侵袭，并逆转上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)表型[25]，且可能与CXCR4的表达呈正相关[26]。本研究发现干扰CXCR4表达后，Skp2的表达下调，细胞周期阻滞在G0/G1期，其下游周期相关蛋白P21、P27、FOXO1表达上调，而CyclinD1、c-Myc表达下调；过表达CXCR4出现相反的效应，表明CXCR4可以通过调控Skp2进而对细胞周期进行调控。
研究表明，PI3K/Akt通路可调控Skp2的表达，Akt可直接磷酸化Skp2并与之相互作用，促进SCF复合体形成并增强E3连接酶活性[27]。在乳腺癌细胞系中Skp2表达与Akt活性呈正相关，抑制Akt活性可使Skp2表达下调，表明其可能是导致乳腺癌中Skp2上调的主要因素[28]。我们前期研究发现，CXCR4抑制剂可通过抑制Akt及ERK1/2信号通路发挥抗乳腺癌细胞的增殖并诱发凋亡的作用[29]，并可调控PDGFRα活性，发挥逆转EMT的作用[8]，提示CXCR4表达可能通过PI3K/Akt和ERK信号通路调控Skp2的表达。为了进一步阐明Akt和ERK信号通路在CXCR4-Skp2调控中的作用，本研究利用LY294002及U0126处理后分析其对细胞周期的影响。研究发现，干扰CXCR4的表达后，Akt和ERK的磷酸化水平下调，Skp2表达受到抑制，细胞周期阻滞显著，且与LY294002及U0126具有联合效应，表明乳腺癌细胞中CXCR4可能通过PI3K/Akt信号途径调控Skp2表达，从而发挥对细胞周期的调控作用。
综上所述，CXCR4/PI3K/Akt/Skp2和CXCR4/ERK/Skp2信号通路在乳腺癌细胞周期活性调控中发挥重要的作用，靶向膜表面趋化因子受体CXCR4可阻滞细胞周期，从而延缓细胞进入增殖周期，减少细胞分裂增殖。本研究结果为针对CXCR4靶点的乳腺癌治疗提供了理论基础。
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