2. 杭州师范大学医学院附属杭州市萧山区第一人民医院肿瘤中心, 浙江 杭州 311200;
3. 浙江中医药大学附属第一医院肿瘤科, 浙江 杭州 310006
2. Center of Oncology, Xiaoshan First people's Hospital Affiliated to the Medical College, Hangzhou Normal University, Hangzhou 311200, China;
3. Department of Oncology, the First Affiliated Hospital of Zhejiang Chinese Medical University, Hangzhou 310006, China
微小RNA(microRNA，miRNA)存在于多种生物基因组内，是一类由20~23个碱基组成的非编码单链RNA，具有序列特异性调节基因表达的功能，主要与mRNA非翻译区域的碱基互补配对来调控蛋白质的翻译[1-3]。大量研究证实，miRNA能够参与调控多种与恶性肿瘤相关的信号通路，从而对肿瘤的增殖、侵袭和转移以及耐药等恶性生物学行为发挥调控作用[4-7]；其表达失控与肿瘤发生密切相关，在肿瘤发生过程中可起促癌基因或抑癌基因的作用[8]。2003年，Dostie等[9]在人神经元细胞中证实存在miRNA-29b，之后陆续有研究证实其在多种肿瘤中扮演着抑癌基因的作用：当其表达量下降时，可通过解除对一系列靶基因表达的抑制作用，导致靶基因的表达失调，从而影响细胞的正常生物学功能[10-11]。
乳腺癌作为目前我国女性最常见的恶性肿瘤, 患病人数每年呈上升趋势且总体存活率不理想[12-13]。因此，对新的有效诊疗靶点的筛查确认，有望提高乳腺癌的诊疗水平并改善乳腺癌患者的预后。本研究构建了miRNA-29b重组慢病毒表达载体，并通过感染乳腺癌细胞MCF-7，研究过表达miRNA-29b对乳腺癌细胞增殖、迁移等生物学行为的影响及分子生物学机制，以期为深入了解乳腺癌的发生发展机制及药物研发提供新的思路和靶点。
1 材料与方法 1.1 材料、试剂和仪器人乳腺癌细胞MCF-7、人胚胎肾细胞293T购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心。MCF-7细胞用含10% FBS的1640培养基培养，293T细胞使用含有10% FBS的高糖DMEM培养基培养。
携带增强绿色荧光蛋白的慢病毒表达载体lenti-miRNA-29b、pHelper1.0、pHelper2.0和siRNA-RTKN购自上海吉玛制药技术有限公司；感受态大肠埃希菌DH50t菌株、质粒DNA提取试剂盒和DNA胶回收试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司；M-MLV反转录试剂盒、Lipofectamine 2000、DMEM(高糖)、FBS、0.25%胰蛋白酶购自美国Invitrogen公司；TRIzol购自日本TaKaRa公司；DAB显色试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司；Transwell小室购自美国Corning公司；CCK-8试剂购自德国Qiagen公司；助转剂聚凝胺(polybrene)购自上海翊圣生物科技有限公司；Dual-Luciferase Reporter Assay System购自美国Promega公司。
倒置荧光显微镜购自日本Olpymus公司；LC-480荧光定量PCR仪购自美国罗氏公司；Nanodrop ND-1000分光光度计购自美国Nanodrop公司；电泳槽、电泳仪和电转仪购自美国Bio-Rad公司；低温高速离心机购自美国Beckman公司。
1.2 miRNA-29b慢病毒包装取对数生长期293T细胞，以1×106/mL密度接种于六孔板。在细胞移植前，将4′, 6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)以100 ng/mL加入培养基中，与细胞共同孵育过夜，用PBS缓冲液漂洗至少六次以洗掉未结合的DAPI，再用酶消化后离心收集细胞。根据说明书配置试剂(lenti-miRNA-29b 10 μg，pHelper1.05 μg和pHelper2.010 μg)，使用DMEM调整试剂总体积至3 mL；加入3 mL浓度为5%的Lipofectamine 2000转染试剂，加入到六孔板中的293T细胞培养12 h；弃培养基，更换成完全培养基培养12 h。24 h后收集上清液，4 ℃下11 000×g离心10 min，过滤后得到miRNA-29b慢病毒浓缩液。
1.3 miRNA-29b慢病毒感染乳腺癌细胞将MCF-7细胞按照106/孔的密度接种于六孔板。DAPI染色同上，将助转剂聚凝胺稀释至100 μg/mL，稀释病毒浓缩液，加至乳腺癌细胞中进行感染(感染复数=30)。培养12 h去除原培养基并更换为完全培养基，培养3 d后向细胞中加入终浓度为2 μg/mL的嘌呤霉素试剂筛选48 h，收取细胞，计算感染效率。
1.4 实时定量PCR检测miRNA-29b及其下游靶基因RTKN mRNA的表达水平收集lenti-miRNA-29b组、空载体转染组和空白对照组的MCF-7细胞，使用TRIzol提取总RNA，测定浓度，按TRIzol说明书操作。M-MLV(Invitrogen)逆转录RNA获得cDNA，所用引物：β-actin为5′-AAAATGTAAAGCGCTCACTGAATTTG-3′，miRNA-29b为5′-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACAACACTG-3′，按M-MLV逆转录试剂盒说明书操作。取2 μg cDNA，采用实时荧光定量PCR二步法检测lenti-miR-29b的表达水平，所得结果采用2-ΔΔCt计算其相对定量值。RTKN mRNA的检测的β-actin引物同上，收集乳腺癌细胞MCF-7，提取mRNA，逆转录，并使用以下引物进行PCR扩增：miRNA-RTKN上游引物5′-AATGAATTGCAGGAAGGACCAC-3′，下游引物5′-GAGGCAGACACACAGTACCC-3′，具体方法同上。PCR引物合成和质粒测序由上海吉玛制药技术有限公司完成。
1.5 CCK-8实验检测细胞的增殖能力将感染后的乳腺癌细胞按105/孔的密度种于96孔板中，培养24、48、72和96 h后每孔加入100 μL的CCK-8试剂，放入培养箱避光静置30 min，使用酶标仪检测波长450 nm的吸光度值。
1.6 Transwell实验检测细胞的迁移能力使用DMEM培养基将MCF-7细胞稀释至106/mL。在Transwell上室每孔中加入200 μL细胞悬液，下室每孔加入600 μL的完全DMEM培养基，然后放入细胞培养箱中孵育24 h。PBS清洗三次，加入4%多聚甲醛固定30 min；再使用PBS清洗三次，去除PBS及悬浮死细胞，加入100 μL的吉姆萨染色试剂，室温静置20 min，再次使用PBS清洗三次；放置于显微镜下观察计数，每个小室随机选取10个视野(×100)计算穿过滤膜的细胞数，实验重复三次。
1.7 生物信息学方法预测miRNA-29b调控的下游靶基因使用TargetScan、MiRanda和PicTar生物学信息学软件对miRNA的下游靶基因进行预测，三者交集预测miRNA种子区(seed region)的结合。种子区指的是miRNA上进化最为保守的片段，从第2个到第8个核苷酸，通常与mRNA 3'-UTR上的靶位点完全互补。结合相关基因库对下游靶基因进行分析。
1.8 双荧光素酶检测验证靶基因构建带有miRNA-29b特异性结合位点的RTKN 3'UTR的双荧光素酶报告基因质粒载体。转染按照Lipofectamine 2000试剂说明书进行，通过Lipofectamine 2000将psi-CHECK-RTKN-WT野生型、psi-CHECK-RTKN-MUT突变型分别与lenti-miRNA-29b或空载体以共转染的方式进入乳腺癌细胞中，转染后放回培养箱6 h。使用Dual-Luciferase Reporter Assay System对各组转染后的乳腺癌细胞的荧光素酶活性进行检测，具体操作根据说明书进行。
1.9 蛋白质印迹法检测RTKN蛋白的水平将从MCF-7细胞蛋白中纯化的RTKN蛋白分别进行凝胶跑样，然后进行转膜，经处理后加入HRP标记的山羊抗鼠IgG二抗，化学发光法显色，扫描仪记录结果。
1.10 siRNA-RTKN干扰RTKN表达及其对细胞增殖和转移的影响含有目的质粒载体的siRNA-RTKN由上海吉玛制药技术有限公司购入，24孔板中细胞密度超过80%后进行转染(无抗生素，含FBS)；去除培养板培养液，加入已经配置好的siRNA-RTKN转染液200 mL/孔，同时建立阴性对照组，然后将两组细胞置于培养箱中；18~24 h细胞20%~40%融合后加入1 mL的MEM培养基，再加入两倍的正常血清和抗生素浓度，细胞增殖至细胞密度超过50%后，消化传代。取30%的细胞进行转染效率的检测。蛋白质印迹法、CCK-8及Transwell实验方法同上。
1.11 统计学方法采用GraphPad Prism 5.0软件进行统计分析。计量资料用均数±标准差(x±s)表示，组间比较采用配对t检验。P＜0.05为差异具有统计学意义。
2 结果 2.1 重组慢病毒包装及感染乳腺癌细胞的效率构建的重组慢病毒表达质粒lenti-miRNA-29b在293T细胞中包装产生慢病毒颗粒，由于慢病毒表达质粒携带有绿色荧光蛋白基因，故可通过观察绿色荧光强度检测包装时的感染效率。倒置荧光显微镜观察发现，90%以上的细胞都带有绿色荧光标记(图 1)。感染乳腺癌细胞MCF-7后，lenti-miRNA-29b组和空载体转染组分别有90%和60%左右的细胞出现绿色荧光，而空白对照组无绿色荧光表达，证实miRNA-29b重组慢病毒载体感染成功(图 2)。
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| A：空白对照组；B：空载体转染组；C：lenti-miRNA-29b组.蓝色荧光为细胞核DAPI染色，绿色荧光为慢病毒载体荧光.标尺=200 μm. 图 1 例置显微镜下观察重组慢病毒包装MCF-7细胞结果 Fig. 1 Packaging of recombinant lentivirus |
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| A：空白对照组；B：空载体转染组；C：lenti-miRNA-29b组.蓝色荧光为细胞核DAPI染色，绿色荧光为慢病毒载体荧光.标尺=200 μm. 图 2 例置显微镜下观察重组慢病毒感染MCF-7细胞结果 Fig. 2 MCF-7 cells infected with recombinant lentivirus |
实时定量PCR检测结果显示，空白对照组、空载体转染组和lenti-miRNA-29b组MCF-7细胞中miRNA-29b的表达水平分别为1.36±0.75、1.39±0.71和34.16±0.67。其中，lenti-miRNA-29b组miRNA-29b的表达水平是空载体转染组的24.63倍，是空白对照组的25.12倍，差异均有统计学意义(均P＜0.05)，提示lenti-miRNA-29b能够稳定上调MCF-7细胞中miRNA-29b的表达水平。
2.3 miRNA-29b过表达MCF-7细胞的增殖能力变化CCK-8实验结果显示，lenti-miRNA-29b组MCF-7细胞的增殖能力较空载体转染组明显减弱，自培养第3天起差异有统计学意义(均P＜0.05)，见图 3。提示miRNA-29b能够抑制MCF-7细胞的增殖。
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| 与lenti-miRNA-29b组比较，*P＜0.05. 图 3 过表达miRNA-29b对MCF-7细胞增殖的影响 Fig. 3 Effect of miRNA-29b overexpression on the proliferation of MCF-7 cells |
Transwell实验结果显示，lenti-miRNA-29b组的MCF-7细胞在血清的诱导下迁移通过聚碳酸酯膜的细胞数量显著少于空载体转染组，见图 4，细胞计数分别为70±10和153±12(P＜0.05)。提示miRNA-29b过表达会抑制乳腺癌细胞的迁移能力。
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| A：空载体转染组；B：lenti-miRNA-29b组.标尺=100 μm. 图 4 miRNA-29b过表达对MCF-7细胞迁移能力的影响 Fig. 4 Cell migration ability effect of miRNA-29b overexpression in MCF-7 cells |
生物信息学预测结果，在RTKN的基因编码3'UTR区中具有miRNA-29b的结合位点，表明RTKN可能是miRNA-29b的调控靶点(图 5)，筛选RTKN作为下游靶点开展后续研究。
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| 图 5 miRNA-29b与RTKN 3'UTR结合靶点预测 Fig. 5 Target prediction of miRNA-29b combined with RTKN 3'UTR |
将lenti-miRNA-29b或空载体转染、野生型RTKN-WT-3'UTR或突变型RTKN-MUT-3'UTR报告基因载体共转染MCF-7乳腺癌细胞野生型RTKN-WT-3'UTR报告基因载体与lenti-miRNA-29b共转染MCF-7细胞后可使荧光素酶的活性显著下降(0.70±0.11, P＜0.05)，而其他三组共转染MCF-7细胞后荧光素酶的活性差异无统计学意义(1.00±0.10, 1.00±0.20, 1.20±0.12)。提示miRNA-29b能与RTKN 3'UTR区的结合位点结合，RTKN是miRNA-29b调控的下游直接靶基因。
2.6 miRNA-29b过表达MCF-7细胞RTKN mRNA和蛋白表达结果实时定量PCR检测miRNA-29b过表达的MCF-7细胞中RTKN mRNA表达水平，结果RTKN mRNA和蛋白表达水平均下降(均P＜0.01)，见表 1和图 6。结果提示，miRNA-29b能够抑制乳腺癌MCF-7细胞RTKN的表达，RTKN是miRNA-29b调控的下游靶基因。
| (x±s) | ||
| 组 别 | mRNA | 蛋白 |
| 空载体转染组 | 2.74±0.76 | 2.12±0.31 |
| Lenti-miRNA-29b组 | 1.37±0.64 | 1.05±0.24 |
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| 图 6 miRNA-29b过表达抑制MCF-7细胞中RTKN蛋白的表达 Fig. 6 miRNA-29b overexpression inhibits protein expression of RTKN in MCF-7 cells |
设计三对RTKN的siRNA及空白对照组。检测结果显示，转染siRTKN的三组细胞中RTKN蛋白表达水平显著降低，其中siRTKN-3抑制RTKN的效率最高，差异具有统计学意义(P＜0.05)，见图 7。因此，将siRTKN-3用于后续的实验研究。
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| 与空白对照组比较，*P＜0.05；**P＜0.01. 图 7 转染siRNA后各组MCF-7细胞中RTKN蛋白表达比较 Fig. 7 Protein expression of RTKN in MCF-7 cells transfected with siRNA-RTKN |
CCK-8实验结果显示，干扰RTKN表达后的MCF-7细胞增殖能力显著降低(P＜0.05)，见图 8；Transwell实验结果显示，与空白对照组比较，干扰RTKN表达后的MCF-7细胞的迁移能力显著减弱(细胞计数分别为130±16和75±11，P＜0.05)，见图 9。证实RTKN表达下调能够抑制乳腺癌细胞的功能。
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| 与空白对照组比较，*P＜0.05. 图 8 RTKN表达下调抑制MCF-7细胞的增殖能力 Fig. 8 RTKN inhibits proliferation of MCF-7 cells |
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| 标尺=100 μm. 图 9 RTKN表达下调抑制乳腺癌细胞的迁移能力 Fig. 9 RTKN inhibits migration ability of MCF-7 cells |
miRNA是一类调控性的小分子非编码RNA，它通过与编码基因的3'UTR结合实施调控[14-16]。近年来研究结果显示，miRNA对肿瘤的多种生物学功能都有重要作用。miRNA-29b是miRNA中的重要一员，多数情况下扮演着抑癌基因的角色[17-18]。如有研究者发现，miRNA-29b在大多数乳腺癌组织和细胞中表达下降[19-20]。但是，Wang等[21]发现，miRNA-29b在部分乳腺癌细胞株中表达升高，表现为促癌作用，这可能与不同的乳腺癌细胞系具有不同的基因分子分型和生长转移特性有关。miRNA-29b在间质表型乳腺癌细胞系MDA-MB-231和MDA-MB-451中的表达显著高于上皮表型MCF-7和T47D[22]，这对于乳腺癌分子靶向精准调控具有重要意义。
乳腺癌的发生、发展是多因素影响下的多基因、多步骤的恶性增殖的动态过程[23]。研究发现，miRNA-29b具有调控多种下游信号通路和靶基因的作用[24]，且miRNA-29b的表达水平与肿瘤患者的预后密切相关，可用于预测肿瘤患者的预后[25]。本研究旨在探明miRNA-29b在乳腺癌细胞中的具体功能，从而深入探索乳腺癌发生发展的分子调控机制。
首先，我们构建了miRNA-29b重组慢病毒载体，通过包装共转染293T细胞获得稳定表达miRNA-29b的慢病毒颗粒。感染乳腺癌MCF-7细胞后，约90%以上的MCF-7细胞出现绿色荧光，同时MCF-7细胞中miRNA-29b表达水平显著增加，其表达量是空载体转染组的24.63倍，是空白对照组的25.12倍，证实构建了miRNA-29b重组慢病毒表达载体并感染成功。本文资料显示，miRNA-29b过表达MCF-7细胞的增殖能力明显下降，细胞迁移能力亦受到抑制，提示内源性的miRNA-29b能够抑制乳腺癌细胞的增殖和迁移等生物学行为。
用生物信息学预测软件筛选miRNA-29b可能的下游靶基因，结果在众多潜在的靶基因中，RTKN排名最靠前且交集最多；进一步分析发现在RTKN基因编码3'UTR区中具有miRNA-29b的结合位点，表明RTKN可能是miRNA-29b的调控靶点。采用双荧光素酶报告基因实验验证RTKN为miRNA-29b调控的下游靶基因。实时定量PCR和蛋白质印迹法检测发现，MCF-7细胞中miRNA-29b过表达后能够显著降低RTKN mRNA和蛋白的表达水平。通过siRNA-RTKN下调RTKN水平观察MCF-7细胞的增殖和迁移情况，其与miRNA-29过表达后的结果一致，进一步证实了miR-29b抑制MCF-7细胞的生长和迁移能力是通过抑制RTKN表达实现的。
目前研究发现，miRNA-29b具有调控多种下游信号通路和靶基因的作用[26]。Wang等[27]发现，C1q和TNF相关蛋白6(C1QTNF6)、SPARC和COL4A2都是miRNA-29b的靶点，下调它们的mRNA表达会促进人乳腺癌MCF-7细胞的侵袭。Chou等[28]研究显示，miRNA-29b表达缺失促进肿瘤转移和肿瘤上皮间质转化, 而CATA3可以提高乳腺癌细胞miRNA-29b的水平。本文资料提示，RTKN可能是miRNA-29b调控乳腺癌细胞生物学行为的新靶点，可为乳腺癌的治疗和研究提供新的思路。
综上所述，miRNA-29b上调对乳腺癌细胞的增殖和迁移产生较大的影响。本研究完善了miRNA-29b在乳腺癌发生发展过程中的分子生物学机制研究，证实了RTKN为miRNA-29b调控乳腺癌细胞生物学行为的新靶点，为基于miRNA-29b的基因诊断和治疗提供了依据和支持。
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