CD97蛋白是血管内皮生长因子七次跨膜蛋白(epidermal growth factor-seven-span-transmembrane，EGF-TM7)家族Ⅱ类受体成员之一[1]，其结构类似于G蛋白偶联受体家族中的分泌素受体，相对分子质量为75 000~90 000。EGF-TM7受体包括一个信号肽、N-末端不同数目的EGF作用功能域、一段具有保守切割位点的茎杆样结构(stalk)、七次跨膜形成黏液素样茎环结构和C端一个短小的胞内段[2]。研究显示，CD97蛋白与CD55分子相互作用形成蛋白复合体，发挥细胞间黏附作用，并参与多种上皮性来源恶性肿瘤细胞的浸润和转移进程[3-5]。CD97EGF和CD97Stalk免疫表位由于N-端糖基化作用位点数量不同，与配体结合后影响细胞信号传导能力导致肿瘤细胞生物学行为差异[6]。研究表明，乳腺癌组织中CD97EGF和CD97Stalk免疫表位表达和分布不同，其中CD97EGF表达强度可作为判断乳腺癌患者预后的指标[7]。为进一步证实CD97EGF和CD97Stalk免疫表位对乳腺癌细胞生物学行为的影响，我们通过蛋白质印迹法筛选高表达CD97的乳腺癌细胞株，根据CD97蛋白基因序列(Gene Bank NM_001025160.2)，应用siCatchTM siRNA design软件设计CD97免疫表位CD97EGF和CD97Stalk小干扰RNA(siRNA)，筛选免疫表位高敏感CD97siRNA序列，并观察CD97EGFsiRNA和CD97StalksiRNA转染对乳腺癌细胞生物学行为的影响。
1 材料与方法 1.1 实验材料人乳腺癌细胞株MDA-MB231、MDA-468、MCF-7和T47D购自浙江大学肿瘤研究所。DMEM培养基和FBS购自美国HyClone公司；蛋白提取液购自美国Pierce公司；蛋白显色液购自美国Santa Cruz公司；siRNA riboFECTTMCP转染试剂购自广州锐博生物科技有限公司；CD97多克隆抗体购自美国Abnova公司；抗CD97Stalk单克隆抗体(MEM-180)购自美国BD PharMingen公司；抗CD97EGF单克隆抗体(VIM-3b)购自美国Abcam公司；GAPDH购自美国Technology公司；β-actin抗体购自德国Sigma公司；胰蛋白酶消化液(trypsin-EDTA)购自美国Sigma公司；MTT细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司；TUNEL细胞凋亡试剂盒购自美国Promega公司；Transwell培养板购自美国Corning公司；Annexin V-FITC/PI细胞凋亡试剂盒购自美国Yeasen公司。
1.2 细胞培养乳腺癌细胞株MDA-MB231、MDA-468、MCF-7、T47D分别置于含10%FBS的DMEM培养液中(内含100 U/mL青霉素和100 U/mL链霉素), 37 ℃、5%二氧化碳饱和湿度条件下常规培养。待细胞生长至70%~80%融合时，将细胞转移至无血清的培养基中，每隔7 d以胰蛋白酶消化液消化并传代一次。
1.3 蛋白质印迹法检测乳腺癌细胞株的蛋白水平取低温冷冻保存的乳腺癌细胞株T47D、MDA-MB231、MDA-468和MCF-7，1.0 mL PBS缓冲液漂洗，4 ℃低温1500×g离心5 min，移去上清液，加入两倍体积的蛋白提取液中混匀。再次放入4 ℃低温6000×g离心15 min。离心后取1.5 mL管内上清液转移至1.5 mL离心管内，95 ℃加热蛋白变性，滴定蛋白浓度并调整细胞株蛋白至相同浓度，10%SDS-PAGE进行电泳并转移至聚偏氟乙烯膜上。5%脱脂牛奶封闭2 h，浸入稀释后加一抗(β-actin浓度为1:1000，CD97多克隆抗体浓度为1:400)，室温平衡120 min，TBST缓冲液洗膜三次，每次10 min；加二抗(辣根过氧化酶标记羊抗兔IgG浓度为1:5000)中室温平衡60 min，TBST缓冲液洗膜三次，每次10 min，电化学发光(ECL)液暗室发光显影。图像处理系统分析各细胞株的灰度值，以CD97与β-actin蛋白条带的灰度峰比值代表CD97的相对表达量。
1.4 CD97Stalk和CD97EGFsiRNA靶序列设计应用siCatchTM siRNA design软件设计CD97EGF和CD97Stalk干扰序列(广州锐博生物科技有限公司设计合成)。以CD97基因数据库NM_001025160.2序列(1~3353 bp)为准，针对CD97EGF(440~1120 bp)区域和CD97stalk(1150~1750 bp)区域设计siRNA干扰序列(表 1)，并通过质谱检测系统优化siRNA干扰靶点特异性。
| 干扰片段 | 正义序列(5′→3′) | 反义序列(3′→5′) | 片段长度(bp) |
| CD97EGF siRNA-1 | ACCCCGACGGAGACUUGUGACGACAUCAACACGTT dTdT | dTdT UGGGGCUGCCUCUGAACACUGCUGUAGUUGUGCU TT | 550~700 |
| CD97EGF siRNA-2 | UCUUACUCUCGCUCUUGUGGACAGUUCUACATT dTdT | UGGACGGUCACGGACGGACCGAAGUUCAAGU dTdT | 700~850 |
| CD97EGF siRNA-3 | AGACGUGUCUACACCUGCUCACGUCGAGGCCC TT dTdT | GAAGUUGUGGCACCCAAGUAUGUCGACGGCGACAAG TTdTdT | 850~950 |
| CD97Stalk siRNA-1 | CCGUGGAGUAUCGGUGGGUCGACGAGUUUGGTT dTdT | CUUGUGUCUCGACGAGGACUACUAGGUCCUCGCCC TTdTdT | 1200~1350 |
| CD97Stalk siRNA-2 | CCUCGGCUCCUAGGUCCGGGGCGGCACCGCCCGUAGGAGA TTdTdT | GGUAGGUCUUGUACUGCUGAACGACCGGUUAC TT dTdT | 1400~1550 |
| CD97Stalk siRNA-3 | CCUUGAGUUGAGGGGGUAAGAAAAGCGGAAGAGG TT dTdT | UCCUGCACUACGGACCCGGUGCCGUGAGGCTTdTdT | 1600~1700 |
转染前一天接种1×105 MDA-MB231细胞至24孔板培养孔，转染的细胞密度达到50%~80%后均匀培养于培养基表面。取30 μL riboFECTTMCP缓冲液加入到1.25 μL 20 μmol/L siRNA中制备混合液，加入3 μL riboFECTTMCP提取试剂吹打混匀，室温孵育15 min。将riboFECTTMCP混合液加入465.75 μL细胞培养基混匀。各组MDA-MB231细胞培养板置于37 ℃的二氧化碳培养箱中培养。复苏培养传代乳腺癌细胞株MDA-MB231进行siRNA细胞转染，常规培养72 h。siRNACD97Stalk(1~3)、siRNACD97EGF(1~3)以及siRNA阳性对照组和阴性对照组共八组通过乳腺癌细胞株蛋白质印迹法筛选高敏感CD97Stalk siRNA和CD97EGF siRNA，步骤同1.3节，其中抗CD97EGF单克隆抗体的浓度为1:200，抗CD97Stalk单克隆抗体的浓度为1:400。
1.6 倒置显微镜观察siRNA转染后乳腺癌细胞的计数转染后每日观察乳腺癌细胞株生长情况，并在1、3、5、7 d用0.25%的胰蛋白酶消化乳腺癌细胞株制成单细胞悬液，倒置显微镜下应用计数板计算四角大方格未着色细胞数(细胞数/mL=四边角大格细胞数之和×104/4)，重复三次。
1.7 四唑盐(MTT)法检测siRNA转染后乳腺癌细胞的增殖活性96孔板按5000/孔的密度接种乳腺癌细胞株，每组选10个复孔，分组为CD97EGFsiRNA组、CD97StalksiRNA组、阴性对照组和阳性对照组，37 ℃温箱培养24 h。加入20 μL MTT(5 mg/mL)，4 h后加100μL DMSO溶解紫色结晶，使用酶标仪检测波长490 nm处的吸光度值。
1.8 细胞划痕实验检测乳腺癌细胞的转移能力按CD97EGFsiRNA组和CD97StalksiRNA组在六孔板中加5×105个细胞培养24 h至底部铺满，与阴性对照组和阳性对照组对比观察。垂直于底部横线划痕，PBS液清洗划痕细胞，加无血清培养，0、12、24、48 h观察划痕边缘细胞迁移距离分析比较肿瘤细胞侵袭转移能力。
1.9 Transwell实验检测乳腺癌细胞的迁移能力采用Transwell培养板(孔径8 μm，直径为24孔)构建共培养体系，在Transwell小室中预先加入600 μL 20%FBS的1640培养基，37 ℃平衡1 h。分CD97EGFsiRNA组、CD97StalksiRNA组、阴性对照组和阳性对照组进行细胞培养观察。取转染后的乳腺癌细胞株至上室，37 ℃、5%二氧化碳培养48 h后取出Transwell小室，棉签吸净未穿透微孔滤膜细胞，4%甲醛溶液固定后用倒置相差显微镜观察穿过滤膜乳腺癌细胞，取五个视野进行计数。
1.10 TUNEL法检测siRNA转染后乳腺癌细胞的凋亡情况培养48 h后采用TUNEL试剂盒完成乳腺癌细胞预处理。收集上清细胞和胰蛋白酶消化贴壁细胞，PBS清洗, 离心收集重悬细胞，每管细胞加入5 μL的Annexin V-FITC和10 μL的PI混匀后室温避光孵育5 min，流式细胞仪检测各组细胞的凋亡率。
1.11 流式细胞术检测siRNA转染后乳腺癌细胞的周期培养48 h后完成转染后乳腺癌细胞株预处理。收集上清细胞和胰蛋白酶消化贴壁细胞，PBS清洗离心收集细胞，每组样本1×PBS 0.25 mL重悬细胞加0.75 mL -20 ℃无水乙醇，-20 ℃固定过夜离心细胞，常温PBS液清洗离心，加1 mL DNA染色液，混匀后室温避光孵育30 min，流式细胞仪检测各组细胞周期。
1.12 统计学方法应用GraphPad Prism 5.0软件进行数据处理，计量资料采用均数±标准差(x±s)表示，多组间比较采用单因素方差分析，两组间比较采用配对t检验，相关性检验采用Spearman法，P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 CD97在各乳腺癌细胞株中的表达量比较蛋白质印迹法检测结果显示，CD97蛋白在MDA-MB231、MDA-468、MCF-7乳腺癌细胞株中均有表达，但在T47D中表达不明显(图 1)。根据实验结果选择MDA-MB231作为后续实验的细胞株。
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| 1：MDA-MB231；2：MCF-7；3：MDA-468；4：T47D. 图 1 各乳腺癌细胞株CD97蛋白表达电泳图 Fig. 1 Electrophorograms of CD97 protein expression in breast cancer cell lines |
蛋白质印迹法检测结果显示，CD97EGFsiRNA-1组、CD97EGFsiRNA-2组和CD97EGFsiRNA-3组中CD97EGF的相对表达量分别为0.25、0.42和0.48，CD97StalksiRNA-1组、CD97StalksiRNA-2组和CD97StalksiRNA-3组中CD97Stalk的相对表达量分别为0.72、0.43和0.34(图 2、3)。其中，CD97EGFsiRNA-1和CD97StalksiRNA-3中蛋白表达水平降低最为显著，遂选择这两组进行后续实验。
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| 1：siRNA阴性对照；2：siRNA阳性对照；3：CD97EGFsiRNA-1组；4：CD97EGFsiRNA-2组；5：CD97EGFsiRNA-3组；6：CD97Stalk siRNA-1组；7：CD97Stalk siRNA-2组；8：CD97Stalk siRNA-3组. 图 2 siRNA转染MDA-MB231细胞株后CD97蛋白表位表达电泳图 Fig. 2 Electrophorograms of CD97 in MDA-MB231 cells transfected with targeted CD97EGF siRNA and CD97Stalk siRNA |
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| 与siRNA阴性对照组比较，*P＜0.01；与siRNA阳性对照组比较，#P＜0.01. 图 3 siRNA转染MDA-MB231细胞株后各组CD97蛋白表达水平比较 Fig. 3 Expression of CD97 in MDA-MB231 cells transfected with targeted CD97EGF siRNA-1, -2, -3, CD97Stalk siRNA-1, -2, -3 |
CD97EGFsiRNA和CD97StalksiRNA转染组细胞的生长速率均明显低于阴性对照组，且CD97StalksiRNA组细胞的生长数量在第3、5、7天明显低于CD97EGFsiRNA组(P＜0.05)，见图 4。
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| 与siRNA阴性对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01;与CD97EGF siRNA组比较，#P＜0.05. 图 4 CD97siRNA转染后MDA-MB231细胞的生长曲线 Fig. 4 Comparison of the growth of MDA-MB 231 cell after CD97 siRNA transfection |
MTT法检测结果显示，CD97EGFsiRNA和CD97StalksiRNA组的细胞增殖活性明显低于阳性对照组和阴性对照组，且CD97StalksiRNA组细胞的增殖活性在24 h和48 h明显低于CD97EGFsiRNA组(均P＜0.05)，见图 5。
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| 与阴性对照组比较，*P＜0.05；与阳性对照组比较，#P＜0.05；与CD97StalksiRNA组比较，△P＜0.05. 图 5 CD97 siRNA转染后MDA-MB231细胞的增殖活性比较 Fig. 5 Comparison of CD97 siRNA transfection on proliferation of MDA-MB231 cells |
划痕试验结果显示，CD97EGFsiRNA组和CD97StalksiRNA组12、24、48 h划痕两侧细胞相对移动速率明显慢于阳性对照组和阴性对照组(均P＜0.01)，且CD97StalksiRNA组细胞相对移动速率明显低于CD97EGFsiRNA组(P＜0.05)，见图 6、7。试验结果提示CD97StalksiRNA转染对MDA-MB231细胞株侵袭性的影响效果明显强于CD97EGFsiRNA组。
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| 图 6 CD97siRNA转染MDA-MB231细胞后划痕试验结果 Fig. 6 Microscopic images of migration distance comparison in wound scratch assay of transfected MDA-MB231 cells |
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| 与阴性对照组比较，*P＜0.05；与阳性对照组比较，#P＜0.05；与CD97StalksiRNA组比较，△P＜0.05. 图 7 CD97 siRNA转染后MDA-MB231细胞迁移距离比较 Fig. 7 Comparison of migration distances of CD97 siRNAs transfected MDA-MB231 cells |
Transwell试验结果显示，CD97EGFsiRNA组、CD97StalksiRNA组、阴性对照组、阳性对照组48 h时从Transwell上室迁移过膜的细胞数量分别为(75.5±5.0)×103、(48.6±3.5)×103、(180±11.0)×103、(209±5.0)×103个，其中CD97StalksiRNA组上室迁移过膜细胞数目明显少于其他三组(均P＜0.05)，见图 8。结果提示CD97StalksiRNA调节肿瘤细胞运动迁移能力较CD97EGFsiRNA更有效。
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| 标尺=200 μm. 图 8 CD97 siRNA转染后MDA-MB231细胞Transwell迁移试验结果 Fig. 8 Transwell experiment of CD97siRNA transfected MDA-MB231 cells |
CD97EGFsiRNA组、CD97StalksiRNA组、阳性对照组和阴性对照组转染MDA-MB231细胞株48 h后细胞的凋亡率分别为2.67%、2.90%、3.37%和3.44%各组间细胞凋亡差异不显著，见图 9。提示CD97 siRNA转染对细胞凋亡无显著影响。
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| 图 9 流式细胞仪检测CD97 siRNA转染后MDA-MB231细胞凋亡情况 Fig. 9 Apoptosis of MDA-MB231 cells transfected with CD97 siRNA |
转染后48 h，CD97EGFsiRNA组和CD97StalksiRNA组G0/G1期细胞所占比例明显减小，S期细胞所占比例增加，且CD97StalksiRNA组细胞G0/G1期、S期分布变化较CD97EGFsiRNA组明显(均P＜0.05)，表 2。结果提示，CD97 siRNA转染后MDA-MB231细胞周期增殖速度明显减慢，且CD97StalksiRNA对细胞周期的影响较CD97EGFsiRNA更明显。
| (%) | |||
| 组 别 | G0/G1 | S | G2/M |
| 阳性对照组 | 83.01 | 9.13 | 7.86 |
| 阴性对照组 | 82.54 | 9.84 | 7.61 |
| CD97EGFsiRNA组 | 65.39*# | 25.08*# | 9.53*# |
| CD97StalksiRNA组 | 39.92*#△ | 46.15*#△ | 13.93*# |
| 与阴性对照组比较，*P＜0.05；与阳性对照组比较，#P＜0.05；与CD97EGFsiRNA组比较，△P＜0.05. | |||
肿瘤的形成是细胞生长与增殖调控发生紊乱所导致的复杂过程[8-9]。肿瘤细胞的增殖过程包括肿瘤细胞分离、迁移、侵袭和转移，以及肿瘤新生血管形成和细胞外基质成分转化等[10]。细胞外信号通过细胞内特定分子和受体结合，引发细胞内生长和增殖信号传导分子有序相互作用[11]，包括调节细胞周期相关基因的转录，促进因子的转录，最终产生肿瘤细胞的分裂和增殖效应等细胞生物学行为改变[12]。
CD97蛋白作为七次跨膜G蛋白偶联受体参与肿瘤细胞的调控[13]。CD97具有两种不同的抗原表位，即CD97EGF和CD97Stalk。N端糖基化位点突变或位点缺失可有效干扰CD97Stalk和CD97EGF单克隆抗体与CD55蛋白结合的免疫反应源性。单克隆抗体检测结果显示，CD97免疫表位具有不同染色模式，实体肿瘤细胞可表达CD97Stalk和CD97EGF，而在弥散转移的肿瘤细胞中CD97Stalk表达较CD97EGF表达更为明显[14]，提示CD97Stalk可能与细胞的运动能力和收缩能力有关。
为明确CD97免疫表位CD97EGF和CD97Stalk在乳腺癌细胞生物学行为中的作用，我们依据CD97蛋白基因序列(Gene Bank NM_001025160.2)，应用siCatchTM siRNA design软件设计CD97蛋白胞外区免疫表位CD97EGF和CD97Stalk干扰序列，通过系统优化和质谱检测选择CD97EGF(440~1120 bp区域)和CD97stalk(1150~1750 bp区域)设计siRNA序列。实验首先筛选出高表达CD97蛋白的乳腺癌细胞株MDA-MB231作为后续研究的实验细胞株。实验结果显示，CD97siRNA转染MDA-MB231乳腺癌细胞株后可引起乳腺癌细胞生长和增殖活性下降，抑制和降低MDA-MB231乳腺癌细胞株细胞的运动迁移和侵袭能力，同时CD97siRNA转染导致乳腺癌细胞株细胞周期G0/G1期、S期肿瘤细胞数量分布的变化，细胞增殖周期延长。提示CD97蛋白分子可能参与乳腺癌细胞株的生长、增殖、迁移和侵袭等生物学行为。实验中CD97siRNA对乳腺癌细胞株MDA-MB231细胞凋亡率影响不明显的原因可能与siRNA实验存在时间浓度依赖性和细胞凋亡信号mRNA特异靶向性缺乏有关。
CD97蛋白在与相应配体发生特异性结合需要进一步对CD97蛋白多肽修饰发挥功能，在细胞表面形成重复EGF结构域和七次跨膜结构组成异二聚体分子结构而发挥细胞功能信号传导。CD97蛋白分子胞外区CD97EGF区域和CD97Stalk区域8个N-端甲基化位点在糖基化作用下形成不同的免疫表位[6]，N-端糖基化位点是蛋白水解酶重要的G蛋白偶联受体裂解部位[15]，靶向于CD97免疫表位的siRNA干扰抑制导致CD97蛋白N-端甲基化位点数量变化而影响CD97蛋白异二聚体稳定性和传导强度，从而进一步影响CD97蛋白介导乳腺癌细胞株MDA-MB231细胞生物学行为信号传导通路。本文资料显示，CD97免疫表位CD97StalksiRNA组较CD97EGFsiRNA组对上述细胞生物学行为影响更为明显，分析原因可能与CD97Stalk区域N-甲基化位点多于CD97EGF区域有关。
综上所述，CD97蛋白可参与MDA-MB231乳腺癌细胞的增殖、迁移侵袭及细胞周期分化等多种细胞生物学行为，这为后续MDA-MB231细胞生物学行为的机制研究方面提供方向和思路。
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