近年来,乙型肝炎治疗取得了较大进展,继拉米夫定在临床上广泛应用后,又发现一批新的具有抗乙型肝炎病毒作用的核苷类药物,其中部分已进入临床研究阶段.免疫调节剂的使用经验更为丰富,在剂型上也有较大的改进.此外,对乙型肝炎在抗纤维化治疗、基因治疗和中医中药治疗方面均有所进展.

目的:构建人乙型肝炎肝硬化组织cDNA文库,为筛查与乙型肝炎肝硬化的发生特异相关的基因及探讨乙型肝炎肝硬化的发病机制奠定基础.方法:用Trizol方法提取人乙型肝炎肝硬化组织总RNA,并用mRNA纯化试剂盒进行mRNA纯化;反转录合成单链cDNA,长距离PCR方法合成双链cDNA;PCR产物经蛋白酶K水解、纯化后,用Sfi I酶切;将酶切产物进行分级分离,回收0.4 kb以上的cDNA组分,并与λTripl Ex2载体连接;连接产物经体外蛋白包装,产生未扩增文库;鉴定文库的滴度和重组效率后,进行文库扩增;鉴定扩增文库的滴度和重组效率;随机挑取11个噬菌斑,用载体克隆位点两端的通用引物进行PCR扩增,以检测所构建的cDNA文库的质量.结果:未扩增文库滴度为1.03×106 pfu/ml,重组效率为97.24;,扩增后文库滴度为1.36×109 pfu/ml,重组效率为99.02;;用载体两端的通用引物进行PCR鉴定,插入片段平均长度为1.02 kb,含1 kb以上的占36.36;,0.5～1 kb的占63.64;.结论:已成功构建一高质量的人乙型肝炎肝硬化组织cDNA文库,为筛查与乙型肝炎肝硬化的发生特异相关的基因及探讨乙型肝炎肝硬化的发病机制奠定了基础.

目的:研究质粒介导的RNA干扰效应对HBcAg基因表达的抑制作用.方法:设计并构建针对HBcAg基因的小发夹RNA表达载体,将构建好的shRNA表达载体和HBcAg-增强型绿荧光蛋白融合蛋白表达载体共转染人胚肾细胞株AD293,以空载体组以及针对无关序列的shRNA表达载体组为阴性对照,流式细胞术和实时荧光定量PCR法检测RNAi的抑制效果.结果:构建的特异性shRNA表达载体可以抑制HBcAg基因在AD293细胞中的表达,流式细胞仪检测抑制率可达76;,实时荧光定量PCR 法检测HBcAg基因的mRNA,抑制率可达58.6;.结论:质粒介导的RNAi可以有效抑制HBcAg基因的表达,为利用RNAi进行抗乙型肝炎病毒复制研究提供了一个可供选择的方法.

目的:利用增强型绿荧光蛋白(EGFP)和小发夹RNA(shRNA)表达载体技术,建立一种行之有效且相对经济的验证siRNA的方法.方法:将HBV S基因融合到EGFP中,建立HBs-GFP融合基因表达载体;同时构建带U6+27 RNA转录启动子的shRNA表达载体pAVU6+4sh357.二载体共转染HepG2细胞后,流式细胞仪检测HBs-GFP蛋白的荧光强度;同时RT-PCR和实时定量PCR法检测HBs-GFP mRNA水平的改变.结果:小干扰RNA有效抑制目的基因的表达,共转染后第72 h荧光蛋白抑制率为55.4;;HBs-GFP 融合基因的RNA表达受到显著抑制,抑制率达到90;.结论:载体法表达的小干扰RNA体外显著抑制HBs-GFP融合基因的表达.

目的:探讨与鸭乙型肝炎病毒多聚酶(DHBVP)特异结合的结合肽,对鸭乙型肝炎病毒(DHBV)感染的原代鸭肝细胞中DHBV复制的抑制作用.方法:应用噬菌体表面展示技术(PDT)筛选出与DHBVP特异结合的结合肽,经测序得知其核苷酸序列,推论出其氨基酸序列,据此合成结合肽,将其作用于体外感染DHBV的鸭肝原代培养细胞,分时段检测细胞核、细胞浆及培养上清中的DHBV-DNA.结果:应用噬菌体展示技术筛选3轮后共筛到7条结合肽,根据推论出的氨基酸序列合成结合肽,作用于体外感染DHBV的鸭肝原代培养细胞,其中3号肽、6号肽的培养上清及胞浆中的DHBV-DNA含量低于对照组(P<0.05).结论:与DHBVP特异结合的结合肽对DHBV的复制有抑制作用.

目的:探讨联合应用胸腺肽α1(Tα1)和拉米夫定对樱桃谷鸭乙型肝炎病毒(DHBV)复制的抑制作用.方法:以DHBV阳性血清感染1日龄樱桃谷鸭,制备鸭乙型肝炎模型.用拉米夫定治疗12 w后,联用Tα1治疗8 d,以拉米夫定治疗为对照组,半定量PCR法检测鸭血清中DHBV,常规病理学方法观察鸭肝组织病理变化情况.结果:和生理盐水对照组比较,拉米夫定治疗后鸭血清中DHBV水平显著降低(4483.2±5193.4 vs 9351.8±5059.6),联合Tα1治疗后抗DHBV效果更加明显(1692.2±589.2).拉米夫定治疗可减轻肝细胞变性(3.2±0.8 vs 4.6±0.5)和炎症反应程度(6.2±3.3 vs 8.6±2.8),联合Tα1治疗后肝脏炎症反应有所加强(9.0±5.2).结论:拉米夫定可抑制DHBV复制,联用Tα1抗病毒效果更好,而且有加强肝脏内免疫功能的作用.

目的:探讨谷胱甘肽转硫酶(GSTs)M1基因多态性与乙型肝炎相关性肝细胞癌及其与HBV感染引起的慢性乙型肝炎和肝硬化的相关性.方法:采用病例-对照流行病学研究方法,选取了91例原发性肝癌(HCC)患者、58例肝硬化(LC)患者、63例慢性乙型肝炎(CHB)患者和134例正常对照者.以多重PCR技术,检测GSTM1缺失情况.结果:正常组GSTM1基因缺失率(46.92;)与HCC组(61.53;)差异有显著性(P<0.05),与LC组(45.61;)、CHB组(49.18;)差异无显著性.携带GSTM1空白基因型者比非空白基因型者患原发性肝癌的风险高1.81倍(OR=1.81,95; CI=1.05～3.12).携带的55岁前发病的HCC病人GSTM1空白基因型分布明显较55岁后发病者高(P<0.05).结论:GSTM1空白基因型与肝癌易感性有关,且与其发病年龄有关,与肝硬化和慢乙肝无明显相关.

目的:研究淫羊藿苷(icariin,ICA)及其衍生物淫羊藿素(icaritin,ICT)和去甲淫羊藿素(desmethyli-caritin,DICT)的雌激素样作用及其相关的构效关系.方法:ICA经纤维素酶水解成ICT,进一步在BBr3和CH2Cl2的体系中反应生成DICT;用不同浓度的化合物与雌激素敏感性人乳腺癌细胞株MCF-7和T47D分别共培养6 d和9 d,MTT法检测其对细胞的促增殖率,以此评价化合物雌激素样作用的强弱.结果:ICT、DICT促细胞增殖作用显著,10-6 mol/L浓度时促MCF-7细胞增殖作用分别是雌二醇(10-9 mol/L)的90.0;和94.0;(P<0.01);促T47D细胞增殖作用分别是雌二醇的65.6;,50.0;(P<0.01).ICA未呈现促MCF-7细胞和T47D细胞增殖作用.ICT、DICT的促细胞增殖作用被10-7 mol/L雌激素受体完全拮抗剂ICI 182、780完全抑制.结论:ICT和DICT具有促MCF-7细胞和T47D细胞增殖的雌激素样作用,而ICA未体现该作用.

目的:探讨新型抗变态反应药N-对氟苄基-3-[(N-4-吡啶)-乙酰胺]-吲哚-45 (acetamide-45)对电场刺激引起的大鼠离体气管/支气管收缩,及醋氯甲胆碱引起的豚鼠离体气管收缩的影响.方法:以acetamide-45预处理标本后,①记录电场刺激引起胆碱能神经兴奋所致的标本收缩,观察acetamide-45的作用;②以累积剂量法给予醋氯甲胆碱,观察acetamide-45对醋氯甲胆碱量效曲线的影响,气管张力的变化通过换能器转变为电信号并由记录仪记录.结果:Acetamide-45 (1～30 μmol·L-1)能浓度依赖性地抑制电场刺激引起的大鼠气管/支气管的胆碱能收缩,其在气管的IC50(95;可信限)为10.74(8.87～13.00)μmol·L-1,在支气管的IC50(95;可信限)为18.83(14.57～24.33)μmol·L-1.Acetamide-45浓度依赖地抑制醋氯甲胆碱引起的豚鼠离体气管收缩,3～30 μmol·L-1 acetamide-45使醋氯甲胆碱的量效曲线的最大效应下降24.6;～43.2;,EC50增大3.1～21.4倍.结论:acetamide-45抑制离体气道平滑肌收缩的作用,可能是通过非特异性抑制乙酰胆碱和胆碱能受体结合而产生的.

目的:SELDI-TOF建立和评估区分脑胶质瘤与非脑肿瘤、脑胶质瘤与脑良性肿瘤的脑脊液蛋白指纹图诊断模型.方法:收集脑胶质瘤、脑良性肿瘤和轻度脑外伤患者的脑脊液共75份,其中50份胶质瘤和非脑肿瘤脑脊液标本,随机分为训练组33份(17例胶质瘤,16例非脑肿瘤)和盲法测试组17份(5例胶质瘤,12例非脑肿瘤),检测结合在H4蛋白芯片上的蛋白质,获得脑肿瘤和非脑肿瘤的蛋白表达质谱图,用matlab操作平台的人工神经网络分析收集的数据,建立了区分脑胶质瘤与非脑肿瘤的脑脊液蛋白指纹图诊断模型.脑胶质瘤和脑良性肿瘤47份标本,随机分为训练集31份(13例胶质瘤,18例脑良性肿瘤)和盲法测试集16份(9例胶质瘤,7例脑良性肿瘤),运用同样方法分析收集的数据,建立了区分脑胶质瘤与脑良性肿瘤的蛋白指纹图诊断模型.同时运用支持向量机对上述人工神经网络的结果进行验证,二者结果非常相似.结果:①建立了区分胶质瘤与非脑肿瘤的脑脊液蛋白指纹图诊断模型,盲法测试胶质瘤诊断的敏感性和特异性分别为100;和91.7;.②建立了区分胶质瘤与脑良性肿瘤的脑脊液蛋白指纹图诊断模型,盲法测试胶质瘤诊断的敏感性和特异性分别为88.9;和100;.结论:研究建立的诊断模型为胶质瘤的临床诊断尤其是定性诊断提供了一条崭新的途径.

目的:构建一种具有生物学活性的血管活性肠肽(VIP)的真核表达质粒.方法:利用RT-PCR从小鼠胸腺淋巴细胞中克隆有信号肽序列的VIP cDNA,插入真核表达载体pcDNA3.1,构建含VIP的重组质粒pcDNA3.1-VIP,转染COS-7细胞,用ELISA和Western blot鉴定表达的蛋白,细胞因子释放抑制法测定生物学活性.结果:经酶切和基因测序证实,克隆的基因片段为带有信号肽序列的VIP基因;经转染的COS-7细胞表达VIP蛋白,并能有效地抑制巨噬细胞的TNF-α释放.结论:成功构建了能够表达具有生物学活性的真核表达质粒pcDNA3.1-VIP.

目的:探讨肌成纤维细胞对糖尿病肾病发生发展的意义.方法:链脲佐菌素诱导SD大鼠糖尿病模型,病程1、2、4、8周,利用组织学检查观察肾组织结构的改变,免疫组化法测定肾组织αSMA和Ⅳ型胶原(C-Ⅳ)的表达,同时用双抗体夹心法检测肾皮质αSMA含量.结果:糖尿病大鼠肾皮质αSMA含量在各观察时点均高于正常对照组(P<0.05).同时,8周内糖尿病大鼠肾组织C-Ⅳ的染色始终较正常对照组强(P<0.05),且与αSMA表达呈正相关.结论:糖尿病早期大鼠肾脏αSMA表达增高,预示肌成纤维细胞的形成,它可能参与C-Ⅳ等细胞外基质的堆积.

目的:探讨差异显示PCR技术(DD-PCR)在念珠菌基因表达研究中的方法学要点.方法:将临床阴道来源的白色念珠菌氟康唑敏感菌株435体外诱导氟康唑耐药性,于诱导80d得到耐药子代435-2,采用长引物差异扩增、银染显示差异条带、反式点杂交预筛选及非放射性法标记探针的改良的DD-PCR,比较435与435-2在有药及无药培养基中的表达差异.结果:在435-2含药培养组中得到较435-2、435无药培养组表达明显增强的片段N2、N3、N12,分别与数据库中白色念珠菌的醇脱氢酶基因ADH1、拓扑异构酶基因TOP2及多药耐药基因CDR1基因有高度同源性;半定量RT-PCR中证实了ADH1、CDR1基因在耐药株中的高表达.结论:ADH1、CDR1基因的高表达与白色念珠菌氟康唑耐药性形成相关,ADH1可能是新的耐药基因;改良的DD-PCR技术降低了假阳性率的产生,使确证步骤更加便捷,在念珠菌研究领域有很好的应用前景.

目的:观察冠心病患者外周血内皮祖细胞(endothelial progenitor cells,EPC)数量和功能的改变.方法:选择冠心病患者和非冠心病患者各20例,用密度梯度离心法从外周血获取单个核细胞,将其接种在人纤维连接蛋白(fibronectin)包被培养板,培养7d后贴壁细胞进行细胞化学分析.激光共聚焦显微镜鉴定FITC-UEA-Ⅰ和DiI-acLDL双染色阳性细胞为正在分化的EPC.采用MTT比色法、改良的Boyden 小室和粘附能力测定实验,观察EPC的增殖能力和迁移能力及粘附能力.结果:冠心病患者外周血EPC数量明显减少(31.8±7.7 vs 59.5±10.6 EPCs/×200视野,P<0.05),且冠心病患者外周血EPC的粘附能力和迁移能力及增殖能力也明显受损.结论:冠心病患者外周血内皮祖细胞数量减少、功能减退.

目的:研制异硫氰酸荧光素(Fluorescein isothiocyanate,FITC)标记的直标单克隆抗体2F9-FITC,用于白血病的免疫分型诊断.方法:2F9杂交瘤细胞的亚克隆,2F9腹水的制备、纯化、纯度鉴定按照常规方法进行;参考改良Marsshall氏法,制备FITC标记的2F9-FITC单抗;通过流式细胞术鉴定单抗亚型,比较2F9-FITC和标准CD14-FITC在不同类型白血病细胞上的表达情况.结果:制备了大量高纯度的IgG1κ亚型2F9单抗,成功研制了直标单抗2F9-FITC,A495/A280比值为0.44;2F9-FITC与CD14-FITC在单核细胞上反应的阳性细胞百分数分别为84.50;及90.08;,而在淋巴细胞仅为0.52;和1.01;;2F9-FITC与标准CD14-FITC在各类白血病细胞上的阳性细胞百分数的差异不显著(n=23,t=0.922,P=0.367).结论:研制的2F9-FITC能够替代进口的同类高质量单抗试剂,用于单核细胞相关性白血病的免疫诊断.

目的:比较性别对阿尔茨海默病(AD)、轻度认知损害(MCI)的脑干听觉诱发电位(BAEP)、事件相关电位(ERP)P300的影响.方法:对38例MCI、26例AD患者、20例健康老年人(HC)进行BAEP和P300检查,根据性别的不同,进行组间和组内的比较.结果:组内BAEP比较,MCI组在左侧Ⅲ、Ⅴ波潜伏期差异有显著性(P<0.01);HC组在左侧Ⅳ、Ⅴ波潜伏期差异有显著性(P<0.01);AD组组内比较,差异无显著性;P300比较,MCI潜伏期女性比男性延长,差异有显著性(P<0.01);AD和HC组差异无显著性.组间BAEP比较,AD与MCI仅男性左侧Ⅰ、Ⅱ差异有显著性.AD与HC比较,男性在左侧Ⅰ、Ⅲ～Ⅴ和右侧Ⅳ波,女性在左右两侧Ⅰ～Ⅴ差异有显著性.MCI与HC比较,男性在左侧Ⅲ、Ⅴ和右侧Ⅰ、Ⅳ、Ⅴ波,女性在右侧Ⅰ、Ⅱ、Ⅴ波差异有显著性.P300检查发现,男性AD的潜伏期比MCI显著延长.AD和HC比较,无论男女在潜伏期的Fz、Cz、Pz点差异有显著性.MCI与HC比较,女性在潜伏期的Fz、Cz、Pz点,差异有显著性.结论:性别对MCI的BAEP和P300检查均有影响,而对AD检查未显示明显的影响.相同性别的AD、MCI和HC的BAEP和P300的表现也有不同,可能对三者的鉴别有意义.

目的:研究β受体阻断剂在大鼠小肠段的吸收速率常数与分子结构参数的相关性.方法:用分子力学MM+法得到β受体阻断剂分子的优化几何构型,用Monte Carlo法计算分子体积,用半经验自洽场分子轨道CNDO/2法计算原子净电荷,相关分析采用逐步多元回归分析法.结果:β受体阻断剂在大鼠空肠和大鼠回肠的吸收速率常数与分子中所有氢原子净电荷之和(ΣQH)和分子体积(V)具有很好的线性相关性,ΣQH值和分子体积较小的β受体阻断剂在大鼠空肠和大鼠回肠的吸收速率常数均较大.结论:β受体阻断剂在大鼠小肠段的吸收速率常数主要与化合物的脂溶性、形成氢键能力和分子大小有关,脂溶性较大、形成氢键能力较弱和分子体积较小的β受体阻断剂在大鼠小肠段的吸收速率常数较大.

目的:分析大肠杆菌T蛋白是否拥有独立的调节结构域,并确定其在氨基酸序列上的定位.方法:利用分段克隆法克隆了11个大肠杆菌T蛋白的片段,检测各片段的调节活性.结果:发现大肠杆菌T蛋白的调节结构域定位于C末端约270个氨基酸,并与其预苯酸脱氢酶结构域密不可分.结论:大肠杆菌T蛋白没有独立的调节结构域.

目的:通过对苯丙酮尿症(PKU)疾病的筛查,了解浙江省遗传性代谢病苯丙酮尿症疾病的发病情况及临床类型.方法:取出生72 h后并喂足高蛋白奶6次以上的726 998例新生儿足跟末梢血,应用荧光定量法测定血苯丙氨酸(phe)水平.结果:在726 998例新生儿中检出phe增高(phe>121.0 μmol/L)的可疑者152例,经血清氨基酸分析(其中宁波可疑10例,确诊7例),确诊PKU患儿32例,其中经典型PKU 26例,高苯丙氨酸血症5例,四氢生物喋呤(BH4)缺乏症1例.确诊治疗最早时间为16 d,最晚为105 d,中位数为32 d.结论:浙江省苯丙酮尿症检出率为1/22 718.

目的:通过超声心动图诊断6例成人孤立性心肌致密化不全(INVM),探讨早期诊断该病的重要性.方法:超声心动图多切面扫查,采用HP5500彩色超声仪,探头频率2～4MHz,重点观察近心尖1/3的心室心肌及心内膜.结果:6例患者UCG特点,均为受累的心室腔内可探及大量突出的肌小梁和深陷的小梁间隐窝.病变心肌包括两层结构:其一为心外膜侧的薄而致密的心外膜层,其二为心内膜侧厚而致密化不全的心内膜层.病变部位明显增厚并呈节段性运动减弱.结论:UCG无创且特异性强,目前仍是诊断该病的首选方法.INVM应被单独归为一类特殊的心肌病.

线粒体通透性转变孔(mitochondrial permeability transition pore,MPTP)位于线粒体内外膜之间,由多个蛋白质组成,与细胞凋亡密切相关.在多种凋亡信号如促凋亡蛋白Bax、Bad、Bid和Ca2+、活性氧类等的作用下开放,使线粒体通透性发生转变,线粒体肿胀,线粒体跨膜电位降低,线粒体呼吸链受损,ATP合成受抑制,线粒体释放凋亡诱导因子及细胞色素C,通过不同信号转导途径,激活Caspase级联反应或其他凋亡相关蛋白,使DNA断裂,产生凋亡小体,细胞凋亡.Bcl-2、Bcl-xL、环孢菌素A、米酵菌酸等则可通过不同途径对抗凋亡.通过对MPTP开放机制以及对线粒体膜钾通道和解偶联蛋白调控的研究,可能会为细胞保护提供重要依据.