基因骨髓移植,预后中等者取决于基因表达情况.难治复发性白血病的治疗策略是联合未使用过的药物或加大阿糖胞苷的剂量,使用二联或三联药物.急性早幼粒白血病的预后主要决定于发病时白细胞的数量,高白细胞患者缓解后应给予中、大剂量的阿糖胞苷巩固治疗.

目的:研究嵌合型溶瘤腺病毒(CRAd)SG235的抗白血病作用.方法:用流式细胞术(FACS)检测原代白血病细胞CD46的表达和SG235对多种白血病细胞株的感染率,MTT法研究SG235对Kasumi-1细胞的生长抑制,Annexin-V/PI染色和TUNEL法观察SG235诱导白血病细胞凋亡的作用,Western blot检测CRAd对磷酸化Akt蛋白表达的影响.结果:大多数急性白血病患者原代白血病细胞表达CD46.用50病毒感染复数(MOI)的SG235-EGFP感染Mutz-1、Kasumi-1、K562、HL60、Molt-4、RPMI8226、L428、Jurkat细胞,感染率分别为45.1%、35.7%、54.2%、37.0%、30.1%、67.1%、17.2%、33.1%.SG235对Kasumi-1细胞有显著的生长抑制作用,作用24 h和48 h IC50值分别为79.0 MOI、38.4 MOI.SG235能诱导多种白血病细胞株凋亡,而且呈剂量依赖性;并能抑制Kasumi-1细胞磷酸化Akt活性.结论:嵌合型溶瘤腺病毒SG235能有效地感染白血病细胞,并能抑制白血病细胞的生长,诱导其凋亡.

目的:研究白细胞介素-24(IL-24)增强溶瘤腺病毒(CRAd)ZD55抗白血病作用的机制.方法:用流式细胞仪检测ZD55对白血病细胞株Mutz-1的感染率;分别用ZD55、ZD55-IL-24和携带IL-24的非增殖型腺病毒(Ad-IL-24)处理白血病细胞(实验组),对照组为PBS.Western blot检测CRAd对白血病细胞血管内皮生长因子(VEGF)蛋白表达的影响;用免疫组化检测Mutz-1白血病荷瘤模型经CRAd治疗后肿瘤病理组织CD31和VEGF表达.结果:用10、100病毒感染复数(MOI)的ZD55感染白血病细胞48 h,感染率分别为5.1%和42.3%.ZD55-IL-24使VEGF蛋白表达显著下降,而Ad-IL-24感染后未能使VEGF明显下调.ZD55对VEGF蛋白表达有轻度抑制作用.免疫组化结果显示,Ad-IL-24有轻度抑制血管新生作用,ZD55治疗组有明显的抑制血管新生作用,而ZD55-IL-24治疗组血管新生几乎消失.结论:IL-24通过抑制VEGF表达和血管新生增强ZD55在体外和动物实验中的抗白血病作用.

目的:探讨t(8;21)急性髓系白血病(acute myeloid leukemia,AML)的遗传学特点.方法:回顾性分析浙江大学医学院第一附属医院血液科154例t(8;21) AML的遗传学、免疫学和分子生物学资料.为便于分析染色体核型与FAB分型的关系,把患者分为单纯t(8;21)组(69例)、单纯伴性染色体丢失组(54例)和其他附加染色体组(31例).结果:按FAB分型:M2 127例(82.5%)、M5 15例(9.7%)、M4 6例(3.9%)、M1 4例(2.6%)、M0 2例(1.3%);附加染色体异常85例(55.2%),其中-Y 43例,占男性核型的44.1%;-X 17例,占女性核型的27.9%;9q- 9例,占总例数5.8%;+8 5例,占3.4%,+4 3例,占2.0%;其他类型染色体异常17例,占11.4%;其他附加染色体异常组有非M2(M0、M1、M4、和M5)病例11例,占该组35.5%,高于单纯t(8;21)组的17.4%,差异有统计学意义(P<0.05);伴性单纯染色体丢失组有4例(7.4%),低于单纯t(8;21)组,差异无统计学意义(P>0.05).结论:t(8;21) AML常伴有其他染色体异常,主要见于M2型,除性染色体丢失以外附加染色体异常更易见于非M2型AML.

目的:研究伴3q异常的急性髓系白血病(acute myeloid leukemia,AML)的临床及实验室特征. 方法:采用R带常规显带技术进行染色体检查,对657例AML患者的核型进行分析.结果:在657例AML患者中检出3q异常患者24例,检出率3.7%;在24例患者中,涉及3q21或3q26异常18例(75.0%),其中3q21q26异常11例(45.8%),包括9例 t(3;3)及2例inv(3);其余伴3q异常的6例患者,2例为t(1;3),t(2;3)、t(3;7)、t(3;11)及t(3;14)各1例.11例3q21q26异常的AML患者,其中3例从骨髓增生异常综合征转化而来,10例患者血小板正常或增高,骨髓形态学为巨核细胞异常增殖.而在其余7例伴3q21或3q26异常的患者中均未见有血小板增高及骨髓巨核细胞的增殖.24例涉及3q异常的AML患者化疗疗效差,仅4例患者获得短期缓解,中位生存仅6.7个月.结论:AML的3q异常以3q21q26最为常见,且涉及3q异常的AML患者,无论是3q21q26还是其他异常的患者治疗效果差,预后不良.

自噬是胞浆大分子物质和细胞器在膜包囊泡中降解的生物学过程,具有多种生理功能.在某些情况下,自噬可以导致细胞死亡,即自噬性细胞死亡.近年研究表明,自噬和恶性肿瘤发生、发展有密切关系.靶向自噬途径有可能成为治疗肿瘤的新方法.

慢性淋巴细胞性白血病(CLL)是成人白血病中最常见的一种.IGVH基因的突变状态是CLL患者最重要的预后标记,而Zeta链相关蛋白激酶(ZAP-70)可作为IGVH突变状态的替代标记.CD38是一种促使B细胞活化和增殖的Ⅱ类跨膜糖蛋白,能提高CLL细胞的生存率,促进其增殖,也可作为CLL的独立预后指标.另外,超过80%的CLL患者存在染色体畸变,最常见的异常是染色体的丢失,其中13q14缺失最为常见(35%);而最常见的染色体增加为12q的三体性(23%).人类白细胞抗原G (HLA-G)表达增高预示CLL的恶性进展及其生存期的缩短.Toll样受体是天然免疫的重要组成部分,TLR激动剂与放化疗、单克隆抗体,以及肿瘤疫苗联合应用将给CLL的治疗带来重大突破.

目的:构建COL1A1特异小干扰RNA(siRNA)表达载体,体外评价其对胃癌细胞BGC-823增殖迁移的影响.方法:根据文献获得3个COL1A1的siRNA靶序列,设计能转录短发夹状RNA(short hairpin RNAs,shRNA)的DNA序列,并与pSilencerTM 4.1- CMV neo线性质粒载体连接,连接产物转化感受态大肠杆菌DH5α,筛选获得重组质粒;经DNA测序鉴定重组体DNA序列正确后转染胃癌BGC-823细胞,利用G418筛选稳定表达COL1A1-shRNA的BGC-823细胞株.通过实时荧光定量RT-PCR及Western blot检测转染后细胞COL1A1在mRNA及蛋白质水平的表达;MTT法及Transwell法检测COL1A1干扰后胃癌细胞增殖及迁移能力的变化.结果:序列测定表明成功构建3个COL1A1-shRNA表达载体.实时荧光定量RT-PCR及Western blot检测显示,COL1A1-shRNA转染胃癌BGC-823细胞的COL1A1 mRNA及蛋白表达水平明显降低(P<0.05);MTT试验及Transwell迁移试验显示,转染后细胞增殖及迁移能力明显降低(P<0.05).结论:COL1A1-shRNA转染胃癌BGC-823细胞能有效抑制细胞COL1A1的表达及癌细胞的增殖迁移.

目的:从苦瓜籽中克隆HIV-1整合酶抑制剂MAP30,构建其表达载体,并在大肠杆菌中进行表达,用于MAP30在细胞内的转运机理研究.方法:从成熟苦瓜种子中提取基因组DNA,通过PCR的方法扩增出MAP30基因的全长,并将其克隆进入原核表达载体pET-30a,转化Eoli.BL21(DE3),IPTG诱导表达,Ni-NTA亲和纯化,梯度咪唑洗脱.MTT法分析生物学活性.结果:测序发现插入的MAP30基因序列正确,SDS-PAGE鉴定表达产物分子量正确,且MAP30主要以可溶形式表达.MTT法测定重组的MAP30具有生物学活性,且对肿瘤细胞的毒性远远大于对正常细胞的毒性.结论:本研究成功地构建了MAP30的表达系统,并实现了MAP30的可溶性表达,表达后的蛋白具有生物学活性,可用于抗体-毒素的肿瘤靶向药物的合成.

目的:观测甲醛吸入对海马神经细胞形态和谷氨酸(Glu)、γ-氨基丁酸(GABA)、一氧化氮合酶(NOS)含量的影响,探讨甲醛影响学习记忆的可能机制.方法:20只大鼠随机分成2组,每组10只,对照组通以正常空气;甲醛染毒组连续7 d 静态吸入(12.5 mg/m3,4 h/d)甲醛.实验结束立即处死大鼠,制作嗅球和海马的冰冻切片进行尼氏染色、免疫组化,实施全蛋白免疫印迹分析,观察两组大鼠嗅球、海马的神经细胞形态,测定其Glu、GABA、NOS含量的变化.结果:甲醛染毒组的大鼠嗅球和海马切片的尼氏染色显示,神经细胞排列混乱、胞体皱缩;免疫组化和蛋白印迹显示, Glu和NOS的阳性细胞数以及染色强度和蛋白含量有不同程度的降低,GABA蛋白含量也下降.结论:甲醛吸入能改变大鼠嗅球和海马的神经细胞形态,使嗅球和海马的Glu、GABA、NOS合成量改变,进而影响大鼠的学习记忆.

目的:通过检测肺癌组织与肺癌细胞株代谢过程中产生的挥发性有机化合物(volatile organic compounds,VOCs),寻找肺癌特征性的气体标记物,为呼吸气体检测在肺癌早期诊断中的应用提供实验依据.方法:利用固相微萃取联合气相色谱质谱联用技术(solid-phase microextraction and gas chromatography-mass spectroscopy,SPME-GCMS)检测18例原发性肺癌患者的手术标本及A549、NCI-H446、SK-MES-1、BEAS-2B 4种细胞株培养液顶空气体中的VOCs,从中筛选与肺癌相关的特征性VOCs组分.结果:2-十五烷酮和十九烷在肺癌细胞株A549、NCI-H446、SK-MES-1中均有表达,2-十五烷酮的表达量分别为(1.382±0.171 )×10-5 mg/L、(1.681±0.190)×10-4 mg/L和(2.835±0.401)×10-6 mg/L;十九烷的表达量分别为(8.382±0.606 )×10-6 mg/L、(1.845±0.130)×10-5 mg/L和(6.220±0.362)×10-6 mg/L;二十烷在肺癌细胞株A549和NCI-H446中有表达,表达量分别为(8.313±1.130)×10-6 mg/L、(1.020±0.141)×10-5 mg/L;而此3种VOCs在对照组BEAS-2B中无表达.在18例肺癌组织中,癸烷、2-十五烷酮、十九烷、二十烷等12种VOCs高表达,其中2-十五烷酮的表达量为5.421×10-6 mg/L～3.621×10-5 mg/L,十九烷为5.805×10-6 mg/L～1.830×10-5 mg/L,二十烷为2.730×10-6 mg/L～2.343×10-5 mg/L;其表达水平与肿瘤分化程度无关(P>0.05).二十烷在非鳞癌中的表达高于鳞癌,此结果与肺癌细胞株的表达情况相符.结论:2-十五烷酮、十九烷、二十烷、癸烷等12种VOCs在肺癌组织中高表达,其中2-十五烷酮、十九烷、二十烷与肺癌细胞株结果相符,提示上述物质可能为肺癌潜在的特征性标志物.

目的:研究在常规免疫抑制剂条件下,肾移植联合骨髓细胞输注(donor bone marrow transfusion,DBMT)对于近期(术后1年)及远期(术后1年以上)移植肾功能的影响情况.方法:选择1999年5月至2004年5月在本中心进行肾移植联合骨髓细胞输注的联合移植(联合移植组)及其同一供体来源单纯肾移植的患者(对照组),2组各有74例患者纳入研究.2组患者术后常规应用免疫抑制剂方案为:激素+霉酚酸酯(MMF)+环孢素(CSA)或激素+霉酚酸酯(MMF)+他克莫司(FK506);随访24～108个月,中位随访时间为69.5个月.结果:联合移植组及对照组患者术后1年、3年、5年的血肌酐水平分别为(105±23.9)μmol/L、(107.5±32.4)μmol/L、(115±26.6)μmol/L和(114.7±28)μmol/L、(116.5±27.6)μmol/L、(125±32.6)μmol/L,相应肾小球滤过率(glomerular filtration rate,GFR)(MDRD法)水平分别为(70.2±24.4)ml/min、(74.3±24.1)ml/min、(73.5±22.4)ml/min和(62.4±15.8)ml/min、(63.9±18.7)ml/min、(61.9±20.3)ml/min.其中,上述2组术后第1年GFR水平有显著性差异(P=0.01),术后5年联合移植组与对照组尿蛋白阳性分别为37人(50%)和57人(77%),2组比较也有显著性差异(P<0.01).术后联合移植组有3例发生慢性移植肾肾病(chronic allograft nephropathy,CAN),对照组中有12例发生慢性移植肾肾病,联合移植组随访中CAN发生率较配对组明显下降(P<0.05).结论:肾移植联合骨髓细胞输注对术后近期及远期移植肾功能都有一定的保护作用,可能与供体骨髓细胞输注能诱导嵌合体产生,并增加联合移植受者对供体器官的免疫耐受,从而减少排异反应的发生有关.

目的:探讨以颗粒酶B为靶向的磁共振造影剂(gadolinium-diethylenetriaminepentaacetic-granzyme B monoclonal antibody,Gd-DTPA-GB mAb)的制备方法及反应条件.方法:采用颗粒酶B单抗制成颗粒酶B靶向造影剂Gd-DTPA-GB mAb;通过基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(matrix assisted laser desorption ionisation time-of-flight mass spectrometry,MALDI-TOF-MS)计算其相关参数,采用MTT法检测其细胞毒性,以及免疫组化法判定其免疫活性.结果:MALDI-TOF-MS鉴定结果显示:颗粒酶B单抗的质荷比高峰主要出现在133986.41处,连接Gd-DTPA后高峰主要在139736.06的位置;根据质谱结果计算得每分子抗体可以连接20个左右的Gd3+;MTT法结果显示:Gd、DTPA、Gd-DTPA,以及Gd-DTPA-GB mAb组在浓度逐渐递增的情况下对于细胞活性没有明显影响,且4组间比较差异无统计学意义(P>0.05);免疫组化结果显示:靶向造影剂(1∶175)与阳性对照组(1∶150)比较,具有较高的免疫活性.结论:在体外,本实验室设定的条件能够合成磁共振靶向造影剂Gd-DTPA-GB mAb,而且该造影剂具有良好的免疫活性,无明显细胞毒性.

目的:制备一种新型的双功能化胶体金纳米探针,并考察其特异性.方法:选择二硫化物分子和甲型流感病毒(H1N1亚型)HA基因中特异性的23 mer寡核苷酸片段组装到胶体金颗粒表面,制成双功能化胶体金纳米探针(识别探针,颜色呈酒红色);利用磁性微球作为固相支持物,偶联另一段特异性H1N1寡核苷酸片段制成捕捉探针;两者与靶DNA(完全匹配DNA)结合,形成无色的捕捉探针-靶DNA-识别探针("三明治"夹心式复合物),并采用基质辅助激光解析离子化飞行时间质谱(MALDI TOF MS)测定.同时,在选择向体系中分别加入超纯水(作为空白对照)、完全匹配DNA、不完全匹配DNA及2条仅有1个碱基错配的DNA片段作为靶目标进行实验,观察体系颜色变化及质谱测定,考察探针的特异性.结果:捕捉探针和识别探针只能与完全匹配DNA结合,形成夹心式复合物,反应体系颜色由酒红色转变为无色,充分洗涤后加热去杂交,则由无色复呈酒红色,质谱检测出现信号(m/z 693);而其他靶目标(不完全匹配DNA及2条仅有1个碱基错配的DNA片段)和空白对照实验,不能与2种探针形成夹心式复合物,反应体系均没有颜色变化(仍呈现酒红色),充分洗涤后体系呈无色,加热去杂交体系仍呈无色,质谱检测未见信号(m/z 693).这说明胶体金纳米探针的特异性很高,可区分仅有1个碱基错配的靶目标.结论:本研究建立了一种新型的自组装双功能化胶体金纳米探针,其制备过程简单、特异性很高.此类型胶体金纳米探针在核酸分析,尤其是疾病早期诊断,寡核苷酸多态性分型等方面将有广泛的应用前景.

目的:建立一种快速简便的嗜肺军团菌分子检测方法.方法:运用环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,LAMP),设计一套引物特异性识别嗜肺军团菌毒力基因--mip基因的6个特殊区域,在恒温条件下,对8株嗜肺军团菌和5株其它细菌进行检测,并与普通PCR方法进行比对,验证该方法的特异性和灵敏度.结果:所有嗜肺军团菌扩增产物均产生肉眼可见的白色沉淀,而其它不同菌株均不产生沉淀;加入荧光染料smart green后,嗜肺军团菌扩增产物均产生强绿色荧光,其它菌株呈弱荧光.与普通PCR(检出限约为57.6 pg,)比,LAMP扩增反应的灵敏度大100倍左右,基因组DNA检出限为576 fg,阳性水样检出限为8 cfu/ml.结论:LAMP技术可在简易的实验环境中快速、特异、灵敏地检测嗜肺军团菌.

目的:利用AdEasy腺病毒载体系统,构建小鼠降钙素基因相关肽(calcitonin gene-related peptide,CGRP)基因重组腺病毒载体,并验证其在心肌细胞中的表达.方法:采用RT-PCR方法扩增出含有小鼠CGRP全长cDNA的基因片段,并将其插入PUC57载体,经EcoRⅤ和SalⅠ双酶切,将小鼠CGRP基因亚克隆至穿梭质粒pShuttle-CMV,形成重组质粒pShuttle-CMV-CGRP.经PmeⅠ酶切线性化后,在大肠杆菌BJ5183中与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1同源重组产生重组腺病毒质粒AdEasy-pShuttle-CGRP.重组腺病毒质粒在XL-Gold 细胞中扩增,经PacⅠ酶切线性化后,转染人胚肾293细胞进行重组腺病毒的包装,并经氯化铯纯化得到重组腺病毒AdEasy-pShuttle-CGRP.用纯化后的重组腺病毒转染原代培养的乳鼠心肌细胞,荧光显微镜下观察转染效果.通过尾静脉导入重组腺病毒7 d后,放免法测定心肌中CGRP的表达量.结果:测序证实PUC57 -CGRP重组质粒中含有小鼠CGRP基因的cDNA;重组穿梭质粒pShuttle-CMV-CGRP经双酶切鉴定后可见约7.5 kb和423 bp片段;重组腺病毒质粒AdEasy-pShuttle-CGRP经Pac Ⅰ酶切可见长约3 kb与30 kb DNA片断.转染293细胞进行包装,7 d后细胞出现病变效应,回收病毒重复感染293细胞,在荧光显微镜下可见绿色荧光蛋白表达.提取病变293细胞中重组腺病毒进行目的基因的PCR鉴定为阳性.构建好的重组腺病毒经纯化后具有很高的滴度,并且成功转染了原代培养的乳鼠心肌细胞.通过放免法证实,该载体可以显著增加小鼠心脏中CGRP的表达.结论:成功构建携带CGRP基因的重组腺病毒载体,该重组腺病毒载体AV-CGRP可以显著增加心脏中CGRP的表达量,为进一步研究CGRP基因治疗奠定了基础.

目的:观察口腔石膏模型经二氧化氯(SCD)浸泡消毒后尺寸精度的变化.方法:采用特制母模灌注石膏Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ型各90个,各型分成9组,每组10个,每组经浓度为3.71 mmol/L、7.41 mmol/L、11.12 mmol/L的SCD消毒液浸泡5 min、10 min、15 min后,用外径千分尺测量石膏模型消毒前后的尺寸,所得均数差值进行统计学分析.结果:3种常用石膏模型的精度在SCD同一浓度下,经过5 min、10 min、15 min时间段浸泡消毒后的数据均无统计学意义(P＞0.05),并且其精度在同一时间段不同浓度的SCD浸泡后的数据在统计学上也均无统计学意义(P＞0.05).结论:SCD消毒液对常用口腔石膏模型尺寸精度均无影响.

目的:明确小鼠呼出气体与吸入气体间存在容量差值,观察其对于体积描记箱内压力变化的影响.方法:用双室体积描记法测量8只麻醉小鼠呼吸时头室内压力和温度变化,计算吸入气体容量、呼出气体与吸入气体的容量差值.结果:头室内压力曲线的基线随描记箱内温度上升,约12 min后,尽管此时头室内温度仍保持高位,但压力基线开始缓慢下降.8只小鼠的吸入气体容量为(0.2842±0.0173)ml,呼出气体与吸入气体的容量差值为(0.0012±0.0002)ml.结论:小鼠的吸入气体容量大于呼出气体容量,二者的差值导致压力式描记箱内压力变化曲线基线缓慢下降.由于此差值远小于吸入气体容量,故在计算潮气量时可以对此差值忽略不计.呼吸商的存在,是此差值产生的原因.

microRNA(miRNA)是调节生物体发育的有效分子,表现为对基因的微量调节.现有的证据表明miRNA参与天然免疫和适应性免疫应答的调节,这种调节与免疫系统发挥作用有十分密切的关系.因此,对miRNA的研究有助于对人类免疫系统调节机制更深入地了解,建立基于miRNA的有效疗法.

肝癌是我国最常见的恶性肿瘤之一,而乙型肝炎病毒感染是引起肝癌的最主要原因.作为乙肝病毒X基因的表达产物HBx蛋白具有广泛的反式激活功能,其能通过直接或间接的蛋白质间相互作用参与感染肝细胞的信号转导、细胞凋亡和细胞周期调控.鉴于HBx蛋白在乙型肝炎病毒复制和在感染肝细胞中的重要作用,HBx蛋白在肝癌发生中扮演的角色及其作用机理研究,一直是HBV和肝癌研究的热点内容.