大肠癌发病率日渐增高,而治疗效果不甚理想,总的10年生存率徘徊在50;左右.如何提高大肠癌的治愈率,关键在于大肠癌的早期诊断与早期治疗.随着分子生物学技术的发展,人们对肿瘤病因的认识越来越深入,从病因机制出发干预、阻断肿瘤的发生发展.这也成为我国大肠癌防治研究面临的挑战与机遇.

目的:建立正常人大肠干细胞系.方法:用中性蛋白酶分级分离法从人胚肠中分离正常大肠干细胞,以含端粒酶逆转录酶和SV40大T抗原的重组逆转录病毒感染,对其进行永生化;然后,对建立的正常大肠干细胞系进行生物学特性鉴定.结果:用中性蛋白酶分级消化获得的AKP活性阴性的细胞群生长呈多角形.该细胞群转染含端粒酶逆转录酶和SV40大T抗原的重组逆转录病毒后8～12周出现上皮样细胞克隆,经细胞特性鉴定:PAS染色黏蛋白阳性,上皮细胞角蛋白pan、CK-8、CK-19均阳性;用ELISA-PCR法检测该细胞第12代和第43代端粒酶活性,分别为0.43、0.83;用Western blot法检测发现该细胞系表达端粒酶和SV40大T抗原;用RT-PCR检测示该细胞株表达Musashi-1 mRNA;以1×106细胞数接种裸鼠,观察4个月无肿瘤形成,软琼脂克隆试验培养无转化细胞克隆出现.结论:建立的正常的大肠干细胞系具有干细胞特征,可作为体外研究致癌剂/促癌剂作用机制的较理想实验靶点.

目的:探讨大肠癌相关基因ST13上游5'近端调控区(-595～+74)中增强子碱基序列.方法:设计系列缺失PCR引物,扩增ST13基因5'近端碱基序列片段,pGEMT-EASY克隆、测序,再亚克隆到pGL2系列瞬间报告载体上,等量转染SW620细胞,检测荧光酶活性.结果:系列扩增碱基序列片段669 bp、263 bp、163 bp对pGL2-Basic中的荧光素酶基因均具有较强的启动表达作用,片段101 bp、47 bp则几乎没有启动下游基因表达的作用.而101 bp片段与系列报告载体pGL2重组的分子,在其中含有启动子的报告基因表达载体中具有明显的增强作用(P＜0.01),但作用强度小于阳性对照pGL2-Control(P＜0.05).结论:位于ST13基因上游5'近端调控区的碱基序列101 bp片段(-595～-494),是一个基因转录调控增强子.

目的:探讨散发性人结直肠癌发生发展中可能的信号转导通路.方法:应用8条信号通路基因芯片筛选结直肠癌组织与正常粘膜组织表达差异基因;提取35例结直肠癌患者配对的癌组织及正常粘膜组织(阴性切缘组织,距肿瘤10 cm以上)总RNA,以RT-PCR的方法对有差异的基因进行表达差异比较.结果:结直肠癌组织中hsf1、hsp27及inos的表达明显高于正常组织.经35例结直肠癌患者癌组织与正常大肠粘膜组织对比,癌组织中hsf1、hsp27、inos表达增高,其中hsf1为86;(30/35),inos为63;(22/35).结论:在结直肠癌组织中hsf1、hsp27及inos基因被激活,其中可能存在热刺激应激信号转导通路激活的通道.

目的:了解散发性大肠癌中hMLH1基因启动子区域5'端CpG岛的过度甲基化现象,探讨其与微卫星不稳定性(MSI)在散发性大肠癌发生中的相关性.方法:取散发性大肠癌患者肿瘤组织及其正常对照组织(阴性切缘组织,距肿瘤10 cm以上)标本41对,提取DNA后,以甲基化特异性PCR方法检测标本中hMLH1启动子的甲基化情况,并与相应的临床病理学资料进行统计学分析;将BAT25、BAT26作为检测位点,以自动荧光DNA序列分析法检测MSI,并与甲基化情况进行相关分析.结果:41例散发性大肠癌标本中,75.6;(31/41)存在hMLH1启动子过度甲基化,非甲基化患者年龄(49.2岁)与甲基化患者年龄(63.6岁)相比差异有显著性(P<0.05);43.9;(18/41)的标本表现为MSI阳性;在MSI阳性标本中,94.4;(17/18)有甲基化现象存在,明显高于MSI阴性标本(60.9;,14/23),两者相比差异有显著性(P<0.05).结论:散发性大肠癌中普遍存在年龄相关的hMLH1基因启动子过度甲基化现象,由此引起的MSI可能是老年人大肠癌发病的相关因素之一.

目的:分析中国人遗传性非息肉病性大肠癌(HNPCC)家系的临床特征并检测这些家系中M3胆碱能受体基因(A)8区的突变情况.方法:根据2003年4月杭州会议制定的中国人HNPCC家系标准收集HNPCC家系共15个,分析其临床特征;提取先证者的外周血基因组DNA,PCR扩增M3胆碱能受体基因第8外显子中一段长153 bp,包含有微卫星位点(A)8的基因片段,直接进行DNA测序.结果:15个家系共有恶性肿瘤患者55例,其中大肠癌患者41例,平均每个家系发生大肠癌2.73例,73;的大肠癌患者发病年龄<50岁,51;的病灶位于近端结肠,40;发生在直肠肛门,同时和异时多原发大肠癌总发生率为12;,2/3的家系属于Lynch Ⅱ型,共发生肠外恶性肿瘤14例(18个),其中胃癌最常见.15例先证者外周血中无1例检测到M3胆碱能受体基因(A)8区的突变.结论:M3胆碱能受体基因与中国人群中HPNCC的发病可能无密切关系.中国人HNPCC家系标准应在临床工作中推广应用,并进一步验证其合理性和科学性.

目的:检测结直肠癌患者外周血中细胞角蛋白20(CK20)mRNA的表达水平,并探讨其临床价值.方法:采用实时荧光定量RT-PCR法检测51例经病理学确诊的结直肠癌患者和30例健康对照者外周血CK20 mRNA的表达水平.结果:结直肠癌患者中CK20 mRNA阳性率为27.45;,而健康对照组阳性率为6.67;,两者相比差异有统计学意义(P<0.025).随着临床分期的提高,患者外周血中CK20 mRNA的表达率随之提高,但各分期间阳性率相比无显著统计学意义(P>0.05).Dukes'C期与D期患者中>10拷贝/ml者高于A期与B期患者.结论:检测结直肠癌患者外周血CK20 mRNA的表达水平可发现早期脱落的肿瘤细胞,对肿瘤微转移的诊断有一定的提示意义.

目的:从目前已知的血清肿瘤标志物中筛选出用于大肠癌诊断的最优化肿瘤标志物组合,并联合这组标志物建立基于人工神经网络的大肠癌智能诊断模型.方法:应用酶联免疫吸附法分别测定128例大肠癌患者和113例健康人血清癌胚抗原(CEA)、甲胎蛋白(AFP)、癌抗原199(CA199)、癌抗原724(CA724)、癌抗原242(CA242)、癌抗原211(CA211)、神经元特异性烯醇化酶(NSE)和组织多肽抗原(TPA)共8种肿瘤相关标志物含量,用曲线下面积结合人工神经网络模型的方法评价并筛选最优标志物联合模型,并将此模型应用于大肠癌的诊断.结果:筛选出CEA、CA199、CA242、CA211及CA724 5个最优肿瘤标志物的组合,建立了诊断大肠癌的人工神经网络模型,并用5倍交叉验证,该模型预测大肠癌样本的特异性为95;,敏感性为83;,阳性预测率为95;.结论:本研究筛选出的最优肿瘤标志物组合诊断大肠癌具有较高的敏感性和特异性.

目的:了解饮酒者与非饮酒者人群中肠癌发病情况,验证饮酒与肠癌发病之间的关系.方法:以1989年5月-1990年4月期间,参加浙江省嘉善县肠癌筛检的10个乡镇30岁及以上人口共64 102人为研究队列,其中29 044名饮酒者为暴露组,其余为非暴露组.随访时间为1990年5月1日至2001年12月1日,观察队列的肠癌发病情况,应用Cox回归模型计算两者的相对危险度(RR).结果:全队列64 102人,共观察658 100.24人年.暴露组29 044人,随访298 497.23人年;非暴露组35 328人,随访359 603.01人年.全队列中合计肠癌新发病例242例,其中暴露组新发病例108例,发病密度为36.18/10万,非暴露组新发134例,发病密度为37.26/10万,两者相比无显著性差异(Z＝0.52,P>0.05);饮酒与肠癌发病的粗RR值为0.97(95;CI为0.75～1.25),调整RR值为1.13(95;CI为0.87～1.48)无统计学显著意义.经计算,本研究的检验效能(1-β)为96.99;.结论:在嘉善县人群中,饮酒不是肠癌的危险因素.

目的:建立定量实时RT-PCR,研究非霍奇金淋巴瘤(NHL)患者肿瘤组织端粒结合因子2(TRF2)mRNA表达.方法:用RT-PCR扩增目标基因cDNA,电泳后切胶、纯化作为标准品,建立待测基因标准曲线;用实时RT-PCR测定32例NHL和8例反应性淋巴结炎患者淋巴组织TRF2的表达.结果:实时RT-PCR标准曲线中,模板cDNA含量和扩增时产生的荧光信号相关系数为0.996.实时RT-PCR终点产物凝胶电泳的基因条带灰度值和模板cDNA含量的相关系数为0.779(P＜0.05).在NHL患者中,滤泡型淋巴瘤、套细胞淋巴瘤和弥漫性大B细胞淋巴瘤TRF2 mRNA表达量分别为(22.943±9.424)amol、(23.181±5.983)amol和(18.339±7.910)amol,与良性反应性淋巴结炎组织[(21.796±4.800 )amol]相比无显著性差异(P>0.05).但Burkitt淋巴瘤TRF2 mRNA表达量为(33.170±12.841)amol,显著高于良性反应性淋巴结炎组织和其他类型恶性淋巴瘤(P＜0.05).结论:定量实时RT-PCR能精确测定目标基因mRNA表达.在NHL中,Burkitt淋巴瘤TRF2 mRNA表达量明显高于滤泡型淋巴瘤、套细胞性淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤.

目的:探讨慢性粒细胞性白血病细胞K562与其耐药株K562/ADR细胞中IκB-α和NF-κB的表达,以及三氧化二砷(As2O3)诱导白血病细胞凋亡的关系.方法:应用不同浓度的As2O3诱导K562和K562/ADR细胞凋亡,以Western-blot免疫印迹电泳检测NF-κB、IκB-α的表达,流式细胞术检测细胞凋亡及分析IκB-α的阳性表达率变化.结果:As2O3诱导K562/ADR细胞凋亡率明显低于K562细胞,当As2O3浓度为1 μmol/L时,两种细胞凋亡率分别是(6.33±1.51);、(13.25±1.83);,当As2O3浓度增高到4 μmol/L时,细胞凋亡率则分别为(8.00±1.47);、(50.56±8.62);(P＜0.05).在K562细胞胞浆中,IκB-α阳性表达率则由(88.07±0.99);减少到(49.21±0.95);(P＜0.01),胞核中P65量逐渐增加;而K562/ADR细胞中无明显变化.结论:As2O3可诱导K562细胞凋亡,伴有IκB-α的降解及NF-κB的激活;K562/ADR细胞NF-κB表达增加,对As2O3诱导的反应无明显改变.

目的:观察慢性阻塞性肺疾病(COPD)大鼠模型的TGF-β1的表达变化和早期药物干预对其表达的影响.方法:利用烟薰和气道内多次滴入脂多糖(LPS)建立大鼠COPD模型(B组).早期给予冬虫夏草(C组),红霉素(D组),吸入布地奈德(E组)等分组干预.小动物肺功能仪测定气道阻力(RL)和动态顺应性(Cdyn).采用免疫组织化学法和逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法检测TGF-β1蛋白及mRNA.结果:模型组基本符合人类COPD病理生理变化.外周细支气管平滑肌层和细胞外基质胶原较正常组(A组)大鼠明显增多.C组与B组比RL减少(P＜0.01),D组、E组与B组比RL亦减少,但Cdyn增加(P＜0.01).B组细支气管上皮、肺泡巨噬细胞和小动脉内皮的TGF-β1蛋白及mRNA的表达高于A组(P<0.01),C组与B组无明显差异,而D组、E组与B组相比,TGF-β1蛋白及mRNA的抑制明显,主要表现在细支气管上皮,但两者抑制程度并无明显差异(P>0.05).气道阻力与细支气管黏膜上皮TGF-β1蛋白,支气管肺组织的TGF-β1mRNA均呈正相关(r＝0.510、P＜0.01,r＝0.367、P＜0.05).结论:慢性烟薰和气道内滴入LPS能构建含有气道重塑特征的COPD大鼠模型.早期应用红霉素,吸入布地奈德可明显抑制气道TGF-β1的表达,影响COPD大鼠气道重塑的发生发展,而冬虫夏草未见此作用.

目的:探讨滋养细胞疾病核苷酸还原酶小亚单位(R2)的表达水平及其与疾病预后间的关系.方法:采用免疫组织化学S-P法检测15例正常绒毛、38例葡萄胎、42例侵蚀性葡萄胎和18例绒毛膜癌组织中R2蛋白的表达.结果:葡萄胎、侵蚀性葡萄胎、绒毛膜癌的R2表达水平显著高于正常绒毛(P=0.000);葡萄胎、侵蚀性葡萄胎和绒毛膜癌之间的表达无差异;8例葡萄胎恶变患者R2水平显著高于自然恢复者(P=0.02).术前未化疗与术前化疗的侵蚀性葡萄胎及绒毛膜癌患者R2蛋白表达均无差异.WHO Ⅲ期及Ⅱ期的滋养细胞肿瘤患者R2蛋白表达显著高于Ⅰ期者(分别P＝0.023,P＝0.038),WHO预后评分为中危和高危的滋养细胞肿瘤患者R2表达显著高于低危者(分别P=0.018, P=0.006).结论:R2在滋养细胞疾病中的表达增加,可能与滋养细胞的增生、葡萄胎恶变和滋养细胞肿瘤的高危耐药等生物学行为有关.

目的:探讨糖尿病心肌病的心肌电生理改变以及腺苷(ADO)对其电生理的可能作用.方法:以SD雄性大鼠复制糖尿病模型,选择健康成年SD雄性大鼠作为对照组,6周时记录大鼠体表心电图和右心室乳头肌跨膜电位,观察ADO对跨膜电位的影响.结果:大鼠糖尿病成模后第6周,体表心电图QT间期和右室乳头肌动作电位时程(APD)各水平均明显长于对照组大鼠(P＜0.01);而静息膜电位(RP)、动作电位幅度(APA)和超射值(OS),以及0期去极化最大速率(Vmax)均无明显变化.经10～400 μmol/L ADO灌流,糖尿病组大鼠和对照组大鼠右心室乳头肌跨膜电位各参数均无明显作用,当ADO浓度增加到500 μmol/L时,对照组大鼠右心室乳头肌APD30、APD50、APD70及APD90轻度缩短(P＜0.05),而对糖尿病组大鼠APD无明显影响.结论:糖尿病大鼠右室乳头肌动作电位时程和QT间期明显延长,而ADO(10～500 μmol/L)对糖尿病大鼠过长的ADP无明显缩短作用.

目的:探讨自发性高血压大鼠(SHR)不同组织一氧化氮合酶Ⅲ(NOS Ⅲ)基因表达改变及其在高血压形成中的作用.方法:提取2、4、6、8、10、12不同周龄雄性SHR和正常血压大鼠(WKY)心室肌、血管平滑肌、肝脏和肾脏组织的总RNA,利用高通量RNA阵列技术(RNA array)检测SHR和对照组WKY不同组织NOS Ⅲ mRNA表达的改变.结果:与同周龄WKY相比较,SHR在6、8、10、12周龄血压出现显著性升高[(158.50±7.69 vs 108.67±5.89,174.33±4.46 vs 128.50±4.97,198.00±13.45 vs 142.00±3.58,216.67±8.91 vs 141.17±4.92) mmHg,P均<0.01],10、12周龄心室肌重量/体重比出现显著增加[(4.08±0.17 vs 3.59±0.11,4.05±0.18 vs 3.40±0.19)mg/g,P均<0.01],心肌中NOS Ⅲ基因表达在6、8、10、12周龄出现显著性升高,(1.12±0.18 vs 0.90±0.15,1.46±0.34 vs 1.06±0.18,1.66±0.31 vs 1.21±0.30,1.98±0.40 vs 1.31±0.38,P＜0.05),肾脏组织NOS Ⅲ基因表达在4、6、8、10、12周龄出现显著性升高(1.10±0.21 vs 0.81±0.11,1.28±0.18 vs 0.95±0.13,1.31±0.23 vs 0.99±0.23,1.70±0.30 vs 1.08±0.25,1.83±0.33 vs 1.15±0.20,P＜0.05).肝脏组织中NOS Ⅲ基因表达无显著性差异(P均>0.05),血管平滑肌中未见上述基因的明显表达.结论:NOS Ⅲ mRNA表达的继发性增加是高血压发生和发展过程中重要的分子生物学机制.

目的:纵向了解高危儿的发育情况,探讨高危因素造成神经系统损害和智力缺陷的可能性及远期预后的影响.方法:1994年3月至1995年5月住院治疗的高危新生儿122例,6个月、1周岁参照Gesell发育量表做运动、精神发育评估;6～7岁采用中国-韦氏儿童智力量表(C-WISC)进行测试.结果:多因变量单因素方差分析显示低血糖和早产对6～7岁儿童总智商、语言智商、操作智商均有显著性影响(P＜0.05),其余高危因素的危险性排序依次为低出生体重、严重缺氧、出生时窒息、红细胞增多症、高胆红素血症;有1项高危因素的与有2项及2项以上高危因素的新生儿比较,差异有显著性(P＜0.05);6个月与1周岁、6个月与6～7岁、1周岁与6～7岁智力发育水平呈正相关(r=0.321、0.343、0.463,P均<0.01).结论:出生时的高危因素对儿童智力发育的影响不容忽视,尤其是有多项高危因素的新生儿造成发育障碍的可能性大大增加.6个月和 1周岁的发育对远期预后有预测意义.

目的:评价简易戈那瑞林激发试验在真性性早熟(CPP)诊断中的价值.方法:对乳房提前发育的292例女孩行戈那瑞林激发试验,根据激发试验结果分为CPP组(151例)、单纯乳房早发育(PT,119例)组和周围性性早熟(PPP,22例)组,并对各组激发试验进行比较和分析.结果:3个时相血清黄体生成素(LH)、促卵泡激素(FSH)浓度,PPP组差异无显著性(P＞0.05);PT组差异有显著性(P＜0.01),其中LH以30 min最高,FSH以60 min最高;CPP差异亦有显著性(P＜0.01),LH、FSH均以30 min最高.以基础LH/FSH>0.2作为诊断CPP标准,其敏感性为48.3;,特异性为69.7;;以15 min、30 min、60 min LH/FSH>0.9作为CPP诊断标准,其敏感性分别为80.1;、68.9;、38.4;,特异性分别为90.8;、96.6;、69.7;.结论:戈那瑞林激发试验后15 min LH/FSH>0.9可以作为鉴别CPP与PT的截定值,可以省略注射后60 min测血清LH和FSH.

目的:评价乳腺癌改良根治术后创面处理改进方法,分析Dexon皮内缝合加Redon负压引流的应用效果.方法:以128例乳腺癌改良根治术后,应用Dexon缝合加Redon负压引流而创面处理改进的患者为实验组;以123例乳腺癌改良根治术后传统缝合加负压球引流处理患者为对照组,分析术后并发症和住院日的差异.结果:128例实验组患者术后皮下积液16例(12.5;)、皮肤坏死1例(0.78;)、术后平均住院时间为8.83 d;123例对照组患者皮下积液47(38;)、皮肤坏死16(13;)、术后平均住院时间为14.67 d;实验组结果明显优于对照组.结论:以Dexon皮内缝合加Redon负压引流方法改进乳癌改良根治术后创面的方法后,能使手术创面充分引流,明显降低并发症的发生,缩短住院时间,有利于患者尽早实施其他综合治疗.

目的:按照微创理念对现行腮腺手术方法加以改进,以期减少创伤、提高手术的安全性和质量.方法:对49例腮腺肿瘤患者行解剖保留面神经的腮腺部分切除术,对切口、翻瓣、面神经及耳大神经的分离保留,以及术后处理等方面作了微创化改良.结果:本组患者肿瘤被完整切除,时间1.5～2.5 h,手术切口5.5～7.5 cm,创口均Ⅰ期愈合,术后平均住院天数4 d.无永久性面神经损伤,局部疤痕隐蔽,凹陷畸形不明显.随访6个月～5年,无1例肿瘤复发.结论:微创腮腺手术克服了传统术式的缺陷,提高了手术的整体质量,值得进一步完善、提高.

目的:探讨腹茧症合并不孕腹腔镜所见的特点和临床处理.方法:对1998年1月至2002年12月施行腹腔镜检查术的2 686例不孕患者中所发现的6例腹茧症进行回顾性分析.结果:6例患者均为原发、管性不孕.3例因无法向腹腔内充气而改剖腹探查,3例完成常规闭合式腹腔镜手术.其共同特点为,术中见多重疏松、灰白色的纤维膜状组织包裹于肠管间隙及盆腔脏器,手术分离困难.结论:不孕患者腹腔镜检查气腹针充气不顺利,进而发现腹腔脏器为纤维膜包裹可以诊断为腹茧症,不必进一步手术处理.腹茧症不孕患者最佳治疗方案是体外受精-胚胎移植术.

机体叶酸缺乏和/或代谢障碍是罹患结直肠肿瘤的危险因素.叶酸代谢循环中,亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)是关键酶,该编码基因存在遗传多态性.其中,部分多态的存在将影响酶的活性及稳定性,进而影响叶酸的正常代谢.本文就MTHFR基因的基本特性、国人多态基因频率分布及其与结直肠癌的关系作一综述.