近年来,全球传染病流行十分严重,如何在第一时间对病原体作出诊断与分析已成为各国学者研究的重点,以生物芯片为代表的高通量诊断技术得到了飞速发展.高通量检测技术及其相关的生物信息学,已被广泛应用于各种病原体的快速诊断、型别鉴定和变异分析及耐药检测等多个方面.

目的:建立高通量、快速、可靠、经济的病原微生物诊断技术平台.方法:设计和合成针对56种常见病原微生物的探针和阳性对照,采用悬浮芯片技术,对56种病原微生物的阳性标准品进行检测.结果:56种标准品的检测值显著高于阴性对照,各病原微生物的阳性标准品和各探针之间无交叉反应.结论:建立了高通量、快速、可靠、经济的病原微生物诊断技术平台,为突发传染病的病原体诊断提供技术储备.

目的:以gyrB基因序列为基础,采用系统发育分析方法构建进化树,对种系关系密切的病原菌进行区分鉴别.方法:测序获得本地区19株大肠埃希菌、13株志贺菌、2株豚鼠气单胞菌、2株嗜水气单胞菌、1株维隆气单胞菌的gyrB基因序列,并将其同公共数据库已有序列合并,构建进化树.分析各序列在树中的聚类关系,以此对菌株进行种水平分类鉴别,并同BLAST查询结果相比较.结果:除鲍氏和痢疾志贺菌外,对检测的所有序列,在进化树上与之最邻近的5条序列均为该种菌株.而对一部分菌株,其BLAST查询结果中含有其它菌种的或分类关系不明确的序列.结论:以系统发育方法对种系发生关系密切的病原菌序列进行鉴别,具有较好的分辨力和准确度.

目的:建立鲍曼不动杆菌扩增片段长度多态性分析(AFLP)指纹图谱数据库.方法:采用NCCLS 2004年版抗生素敏感性判断方法研究药物敏感性,采用AFLP技术研究鲍曼不动杆菌基因型,以AFLP结果建指纹图谱立数据库.结果:药敏结果和AFLP指纹图谱数据库进行的聚合分析结果具有一致性.结论:AFLP指纹图谱数据库具有实用价值.

目的:用黄芪多糖和黄芪总甙对LX-2细胞分泌的与纤维化相关的主要细胞因子进行研究,以探讨黄芪抗纤维化的确切分子机制.方法:不同浓度的黄芪多糖和黄芪甙作用于LX-2细胞,以Real Time Cell Electronics Sensing技术实时检测细胞增殖状态;分别再以25 pμg/ml和300 μg/ml的黄芪多糖和黄芪总甙作用LX-2细胞24 h,提取细胞mRNA,以荧光定量PCR测定转化生长因子1(TGF-β1)、肝细胞生长因子(HGF)、基质金属蛋白酶2(MMP2)及基质金属蛋白酶9(MMP9)mRNA的变化.结果:300μg/ml的黄芪多糖可抑制LX-2的增殖(P＜0.05,94.7 h),但不同浓度的黄芪总甙对LX-2细胞均有促进增殖的作用(P＜0.05);25μg/ml的黄芪多糖和黄芪总甙在TGF-β1促进分泌的同时,也上调其它抗纤维化因子,其中黄芪多糖对MMP2的上调(104.9倍)、黄芪总甙对IL-10的上调(550.65倍)最为显著;300μg/ml的黄芪多糖可抑制TGF-β1及HGF、MMP9、IL-10的表达,但仍然上调MMP2的表达,300 μg/ml的黄芪总甙也可抑制TGF-β1的表达,但对抗纤维化因子MMP2、MMP9及IL-10仍有明显的上调作用.结论:低浓度(25μg/ml)和高浓度(300μg/ml)的黄芪多糖和黄芪总甙可通过不同的分子机制调控肝星状细胞因子的分泌而发挥抗纤维化作用;黄芪多糖主要以促进MMP2分泌为主,而黄芪总甙则主要通过上调MMP2、MMP9及IL-10的分泌而发挥作用.高剂量的黄芪多糖和总甙抗纤维化效果优于低剂量组.

目的:研究湖州地区妇女宫颈病变患者人乳头瘤病毒(HPV)感染率及型别分布情况.方法:采用悬浮芯片技术对720例湖州地区妇女宫颈分泌物或脱落细胞进行18种高危型HPV和8种低危型HPV检测.结果:720例患者中HPV感染183例,占25.42;.单一感染135例,占18.75;;双重感染33例,占4.58;;三重以上感染15例,占2.08;.183例阳性标本主要为高危型HPV16、58型,低危型HPV11、6型.结论:湖州地区妇女宫颈病变患者HPV感染率为25.42;,并明确了HPV16、HPV58为该地区宫颈病变组织中HPV主要的流行亚型.

目的:分析HBV感染不同阶段患者外周血T淋巴细胞中PD-1(program death factor-1)分子的基因定量表达情况,探讨PD-1表达水平与血清学指标的相关性.方法:采集并筛选HLA-A2阳性的31例慢性乙型肝炎(CHB)患者、9例急性恢复期乙型肝炎患者(AHB)、15例乙肝相关性肝硬化患者(LC)和10例健康献血者的外周血,实时荧光定量PCR分析总T细胞内PD-1的mRNA水平,同时测定其配体PD-L1、PD-L2在外周血单个核细胞(PBMCs)中的表达量;酶联免疫吸附试验(ELISA)检测HBV血清标记物水平,荧光定量PCR检测血清HBV DNA载量,同时进行肝功能检测.结果:以各基因在正常对照组的定量表达水平为基础值,HBeAg阳性CHB组T细胞内PD-1和PBMCs内PD-L1的mRNA表达水平明显升高,与HBeAg阴性CHB组和AHB组比较均有显著性差异,但与LC组比较无统计学意义(P＞0.05).外周血PBMCs内PD-L2的mRNA水平在各实验组中无明显差异(P均＞0.05).在所有检测的CHB患者中,外周血T细胞内PD-1表达水平在高病毒载量组(HBV DNA≥107拷贝/ml)明显高于低病毒载量组(HBV DNA＜107拷贝/ml)和正常对照组,且与血清HBV病毒载量成正相关(r=0.41,P＜0.01),但与血清ALT水平无明显相关性.结论:外周血T细胞中PD-1基因水平在慢性乙型肝炎患者组,尤其是在HBeAg阳性组和高病毒载量组明显上调,提示T细胞高表达的PD-1可能通过与其配体PD-L1作用而抑制T细胞免疫应答,并导致病毒持续感染.

目的:探讨p53第72密码子Arg/Pro多态、第3内含子16bp副本和第6内含子G/A多态与乳腺癌的关系.方法:采用以自然人群为基础的病例对照设计,对84例乳腺癌患者和以1:2频数匹配原则获得的168例对照进行研究,p53基因3种多态的基因分型采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)方法分析.单体型分布采用EH linkage software 1.2分析软件进行估计和比较.结果:乳腺癌患者组和对照组吸烟状况的分布差异有统计学意义,病例组曾经或现在吸烟的个体比例为7.1;,明显高于对照组的1.2;(χ2=6.455,P=0.018),年龄、饮酒状况及一二级亲属家族恶性肿瘤史等基本特征因素分布差异均无统计学意义(P＞0.05).p53的这3种多态基因型在两组间的分布均无统计学意义上的差异(P＞0.05).经上述因素校正后发现,p53的3种基因多态与乳腺癌发病亦没有统计学意义上的关联(P＞0.05).应用EH linkage software 1.2单体型分析软件显示,上述3种基因多态在对照组内存在连锁不平衡现象,Arg-A-G和Pro-A-G是最常见的2类单体型.单体型组间分布亦不具有显著性差异(P＞0.05).结论:p53基因的上述3种多态与乳腺癌发病风险可能不存在关联,各基因多态存在连锁不平衡现象,Arg-A-G和Pro-A-G是最常见的2类单体型.

目的:研究缺血后处理(postconditioning)对不同时程冷保存大鼠心脏的作用及其机制.方法:利用Langendorff离体鼠心灌注法,观察大鼠心脏在Celsior液(4℃)中保存3 h或5 h后,在其后复灌60 min期间血流动力学的恢复情况,并对复灌期间心律失常严重程度进行定量分析.缺血后处理采用全心停灌30 s,复灌30 s,循环3次.结果:(1)与3 h冷保存对照组相比,大鼠心脏冷保存3 h后给予缺血后处理,在多个复灌时间点上可明显降低左室舒张末期压力,而心率、左室发展压、左室最大收缩/舒张速率、冠脉流出量、心率与发展压的乘积等的恢复率在复灌期明显高于3h对照组.心脏冷保存3 h后心律失常的发生率在复灌第0～10 min时最高,缺血后处理可明显降低心律失常的发生率.(2)在缺血后处理短暂复灌期的K-H灌流液中加入100μm0l/L的5-HD(线粒体ATP依赖性钾离子通道的阻断剂),可取消缺血后处理降低左室舒张末期压力,增高心率、左室发展压、左室最大收缩/舒张速率、冠脉流出量、心率与发展压乘积的作用.心律失常评分亦明显高于3 h缺血后处理组.(3)大鼠心脏冷保存5 h后给予缺血后处理,在复灌期间各项动力学指标以及心律失常评分上与5 h冷保存对照组无明显差异.结论:缺血后处理对于3 h冷保存的大鼠心脏有显著的保护作用,其作用机制可能是部分通过激活线粒体ATP依赖性钾离子通道起作用,而缺血后处理对于5 h冷保存的大鼠心脏并无保护作用.

目的:探讨大剂量抗氧化剂-N-乙酰胱氨酸(N-acetyl-l-cysteine,NAC)对高脂饲养大鼠胰岛β细胞分泌功能的影响及可能机制.方法:将59只8周龄SD大鼠随机分为正常饲料组(NC组)、高脂饲料组(HF组)和高脂+NAC组(NAC组).饲养20周,(1)测血浆及胰腺组织丙二醛(MDA)和还原型谷胱甘肽(GSH)水平;(2)正常血糖高胰岛素钳夹实验,评价外周组织胰岛素抵抗程度;(3)胰岛细胞表面灌注实验,评价离体胰岛β细胞动态分泌功能;(4)实时荧光定量PCR方法比较各组大鼠胰岛素受体底物-1(IRS-1)、胰岛素受体底物-2(IRS-2)和葡萄糖转运子-2(Glut-2)mRNA表达的变化.结果:(1)HF组血浆及胰腺MDA水平明显高于NC组,GSH水平低于NC组,NAC可以改善以上变化;(2)HF组葡萄糖输注率(GIR)比NC组降低(P＜0.01),用NAC后GIR明显改善(P＜0.01);HF组葡萄糖刺激的胰岛素分泌(GSIS)功能下降,用NAC后可逆转上述变化;(3)HF组胰岛细胞IRS-1、IRS-2、Glut-2mRNA表达降低42.3;、28.1;、22.9;(P均＜0.05);NAC组胰岛细胞IRS-1、IRS-2、Glut-2 mRNA表达与HF组相比增加40.2;、30.2;,19.1;(P均＜0.05).结论:大剂量抗氧化干预治疗能改善胰岛细胞胰岛素信号传导,逆转高脂饲养导致的大鼠胰岛细胞分泌功能紊乱,其机制可能与NAC纠正机体氧化及抗氧化失衡有关.

目的:构建针对人乙酰肝素酶(HPSE)基因的小干扰RNA(siRNA)及其表达载体,转染细胞后观察其对HPSE基因的干扰作用.方法:设计HPSE靶向的发夹状siRNA,合成两条互补的寡核苷酸链,退火后连接入pRNATU6.1载体,转化扩增后进行序列测定.用脂质体包裹转染人恶性黑素瘤细胞A375,采用半定量PCR测定HPSE基因RNA水平变化,Western blot检测HPSE蛋白表达的变化.结果:将针对HPSE基因的siRNA的双链寡核苷酸片段克隆到pRNATU6.1载体,经过阳性菌落PCR鉴定与测序,结果正确;转染A375细胞后,半定量PCR和Western blot检测显示,HPSE基因和蛋白的表达水平明显降低(P＜0.05).结论:成功构建了针对HPSE基因的siRNA载体,转染细胞后可抑制HPSE的表达.

目的:利用合成的寡核苷酸片段,在体外拼接人抵抗素(Resistin,Retn)基因的全长,并构建其真核表达载体.方法:根据已知抵抗素基因(GenBank:AF323081),设计并合成10条寡核苷酸片段,采用降落PCR方法进行拼接,获得预期大小的PCR产物后将其克隆入pSecTag2B载体进行测序确认.结果:降落PCR法扩增的特异条带与目的基因的大小一致.克隆载体测序结果与GenBank中已知序列完全符合.结论:降落PCR成功地拼接和扩增了人抵抗素全长基因,并构建了含有该基因的真核表达载体,为进一步研究该基因的功能奠定了实验基础.

目的:肿瘤RNA致敏树突状细胞(DC)治疗颅内荷瘤小鼠,观察DC疫苗对脑胶质瘤的治疗作用,探讨免疫反应的机理,为DC疫苗的临床应用提供实验基础.方法:用G422胶质母细胞瘤RNA冲击致敏DC制成DC疫苗,检测DC疫苗的CTL活性,瘤内和皮下两种途径注射荷瘤小鼠篌以进行免疫治疗,观察小鼠生存期,并与PBS、单纯DC组进行比较,同时检测血清IFN-γ、IL-2、IL-10、IL-4等细胞因子,并行病理检查.结果:DC疫苗的CTL活性明显高于对照组(P＜0.01).两种途径注射DC疫苗,治疗组小鼠生存时间均明显延长(P＜0.01),血清IFN-γ显著升高(P＜0.01),IL-10明显下降(P＜0.05),病理提示肿瘤出现坏死.两种注射途径间以上指标无明显差异.结论:肿瘤RNA冲击致敏DC注射荷瘤小鼠具有明显的免疫治疗作用,能显著延长动物生存期,并能诱导特异性抗肿瘤细胞免疫反应,其机理主要是Th1细胞介导的细胞免疫反应,且免疫反应的程度与注射途径无关.

目的:建立三七提取物中7种有机溶剂残留量的测定方法.方法:采用顶空毛细管气相色谱法,以标准溶液加入法测定三七提取物中有机溶剂残留量.结果:在考察的浓度范围内7种有机溶剂呈现良好的线性关系(乙醇r=0.9994、正己烷r=0.9982、苯r=0.9999、甲苯r=0.9991、二甲苯r=0.9994、苯乙烯r=0.9997、二乙烯苯r=0.9932),回收率81.74;～111.2;,理论板数均大于15 000,相邻峰的分离度均大于2,日内、日间精密度RSD均小于10;.结论:该方法简单、准确、灵敏度高、重现性好,排除了基质的干扰,适用于三七提取物中有机溶剂残留量的测定.

目的:分析和探讨Nagata全耳再造法的临床应用价值.方法:对117例(120耳)先天性小耳畸形患者,采用Nagata全耳再造法,实施全耳再造手术.结果:经6个月～5年随访,平均随访1年,120只再造耳轮廓均得到满意再现;其中,早期5例患者在Ⅰ期耳再造术后位于对耳屏处的皮肤发生坏死,通过局部皮瓣的转移成功覆盖;1例患者在Ⅱ期手术后再造耳的背侧发生移植皮片的部分坏死和软骨外露,经局部皮瓣的转移后成功覆盖.结论:精致的软骨支架雕刻和保留皮下蒂的再造耳区皮瓣分离方法是Nagata法耳再造成功的关键.Nagata法全耳再造具有并发症少,再造耳解剖结构清晰和手术次数少等优点,是一种适合东方人种的全耳再造方法.

目的:探讨5 kg以下低体重婴儿室间隔缺损(VSD)的外科治疗适应证、手术时机、手术技术及围术期处理.方法:回顾性分析2001年1月至2005年12月期间,5kg以下VSD婴儿134例,年龄(3.9±1.9)月.患儿均于体外循环下行室间隔缺损修补术及同期合并畸形矫治术.结果:全组术后早期死亡1例,死亡率0.7;,死亡原因心律失常,心功能衰竭.术后并发肺炎14例,肺高压危象6例,肺不张4例,心律失常4例,低心排4例,胸腔积液1例.133例随访6个月～6年,生长发育良好;VSD残余分流2例,1年后超声心动图证实已自动愈合.结论:低体重婴儿VSD的外科治疗效果良好,正确选择手术适应证和时机、正确合理的体外循环和手术方法、加强围术期处理是提高治疗效果的关键.

在过去较长时间内,由于缺少合适的丙型肝炎病毒研究模型,对丙肝病毒感染机制、生活周期和致病机制的研究进展较为缓慢.对丙肝病毒的认识不足严重阻碍了相关预防性疫苗和治疗药物的研制.近年建立的丙肝病毒全基因体外培养系统是一项重大突破,这将促进人们对丙肝病毒的全面认识和丙型肝炎防治药物的开发.

辅助性T细胞17(T helper 17 cell,Th17)是一种新发现的与白细胞介素23(interleukin 23,IL-23)相关的、能够分泌IL-17的T细胞亚群,它在分化过程和生物学功能等方面与Th1和Th2以及Treg细胞亚群均有不同之处.转化生长因子β1(transforming growth factor β1,TGF-β1)和IL-6以及IL-23在Th17细胞的分化形成过程中起着积极的促进作用,而γ干扰素(interferon γ,IFN-γ)和IL-4以及Socs3(suppressor of cytokine signaling 3)蛋白则能抑制它的分化.Th17细胞能参与前炎症反应,同时也能诱使自身免疫病的发生.