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浙江大学学报（医学版）
浙江大学学报（医学版）  2011, Vol. 40 Issue (2): 156-162    DOI: 10.3785/j.issn.1008-9292.2011.02.007
专题报道     
重组人尼克酰胺磷酸核糖转移酶及其活性位点突变体蛋白的制备及体外酶活性检测
王峰1，黄鹏1,2，刘主2，卢韵碧1，魏尔清1，张纬萍1，唐淳2
1.浙江大学医学院药理学系，浙江 杭州 310058； 2.中科院武汉物理与数学研究所，湖北 武汉 430071
Enzymatic activities of recombinant human NAMPT and NAMPT (H247A) proteins
WANG Feng1,HUANG Peng 1,2,LIU Zhu 2 ,LU Yun-bi1,WEI Er-qing1 ,ZHANG Wei-ping1 ,TANG Chun2
1.Department of Pharmacology, College of Medicine, Zhejiang University, Hangzhou 310058, China; 2.Wuhan Institute of Physics and Mathematics Chinese Academy of Sciences, 430071 Wuhan, China
 全文: PDF(2439 KB)   HTML ( ) 
摘要： 目的：制备和纯化重组人NAMPT和NAMPT(H247A)蛋白，并对其体外酶活性进行检测。
方法：以pcDNA3.1-hnampt为模板，通过PCR扩增获得两端分别为BamHⅠ和NdeⅠ酶切位点的hnampt片断，将该片断与pET-11a(+)表达型载体连接，通过点突变获得pET-11a(+)-hnampt (H247A)，以测序鉴定构建质粒。将野生型和突变型分别转化至BL21star大肠杆菌，以IPTG诱导蛋白表达，以镍柱和分子筛纯化目标蛋白，以SDS凝胶电泳和质谱鉴定目标蛋白，以核磁共振的方法检测两个重组蛋白在体外酶活性。
结果：测序结果表明， pET-11a(+)-hnampt（野生型）及pET-11a(+)-hnampt (H247A)（突变型）表达载体构建成功，突变位点正确。两种蛋白均在BL21star大肠杆菌获得表达，裂解后为可溶性蛋白，通过镍柱、分子筛获得纯化蛋白，SDS凝胶电泳和质谱鉴定证明重组蛋白为分子量约56 kD的NAMPT。核磁共振体外酶活性检测发现野生型NAMPT具有酶活性，而NAMPT(H247A)的酶活性降低了约5～10倍。
结论：成功获得了有体外酶活性的人NAMPT蛋白和酶活性较低的人NAMPT(H247A)蛋白，为NAMPT蛋白作用研究提供了基础。
关键词： 磁共振波谱学;  大肠杆菌;  磷酸转移酶类/遗传学;  点突变;  质粒;  遗传载体;  重组蛋白质类;  NAMPT;  蛋白纯化;  核磁共振    
Abstract: Objective： To prepare and purify recombinant human NAMPT and NAMPT (H247A) proteins and to detect their enzymatic activity.
Methods： Using pcDNA3.1-hnampt as template, full-length hnampt was sub-cloned into pET-11a(+) plasmid. The hnampt (H247A) mutant was obtained by site-directed mutagenesis. The plasmids were introduced in Escherichia coli BL21star for protein expression. The recombined NAMPT and NAMPT (H247A) proteins were purified by flowing through nickel column and size-exclusion column. The target proteins were confirmed by SDS-PAGE and mass spectrometry detection. The enzymatic activities of recombinant proteins were assessed by solution NMR.
Results： The DNA sequences showed that hnampt (wild type) and hnampt (H247A) (mutation) were cloned into pET-11a(+). The recombinant proteins were expressed in Escherichia coli BL21star in soluble form. The purified protein was confirmed to be NAMPT with a molecular weight of 56 KD. The enzyme activity of NAMPT (H247A) was dramatically decreased compared to wild-type NAMPT.
Conclusion： The recombinant hNAMPT and hNAMPT (H247A) proteins have been successful prepared and purified. The H247A mutation dramatically decreases the enzymatic activity of NAMPT.
Key words: Magnetic resonance spectroscopy    Escherichia coli    Phosphotransferases/genet    Point mutation    Plasmids    Genetic vectors    Recombinant proteins    NAMPT    Protein purification    NMR
出版日期: 2011-03-25
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引用本文:

王峰;黄鹏;刘主;卢韵碧;魏尔清;张纬萍;唐淳. 重组人尼克酰胺磷酸核糖转移酶及其活性位点突变体蛋白的制备及体外酶活性检测[J]. 浙江大学学报（医学版）, 2011, 40(2): 156-162.

链接本文:

https://www.zjujournals.com/med/CN/Y2011/V40/I2/156

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