本文链接：https://www.zjujournals.com/gcsjxb/CN/10.3785/j.issn.1006-754X.2024.04.116

急性缺血性脑卒中（acute ischemic stroke, AIS）是全世界第二大死因，也是全球致残的主要原因之一^[1]。研究发现，AIS患者血浆中血小板的功能和结构与正常人的不同^[2]。新型超分辨率显微镜可以准确、快速地分析AIS患者的血小板超微结构^[3]。超分辨率显微镜的图像显示，AIS患者血小板的直径、颗粒平均大小、每场颗粒面积百分比以及每血小板颗粒平均面积均低于健康人群^[4]。通过超分辨技术来分析血小板超微结构的变化，可用于指示AIS发作以及评估抗血小板药物^[5]。这一方法具有快速、经济、高度敏感和特异的特点，因此可进一步将血小板荧光超微结构信息应用于健康监测、疾病诊断以及药物开发等领域^[6]。

基于超分辨成像的血液活检技术依赖免疫荧光染色技术对血小板进行染色。免疫荧光染色技术是一种用于检测生物样本中特定分子的技术，可实现细胞中特定细胞器和抗体的可视化与定位^[7]。然而，目前血小板的免疫荧光染色主要依赖手工操作，在大规模样本筛查和临床应用中，难以应对大量血液样本的检测，任务繁重且效率低下^[8]。此外，手工操作易受主观因素影响，一致性差，难以实现标准化。近年来，国内外已研制了多种免疫荧光染色设备，例如湖北泰康医疗设备有限公司研发的液基细胞分离制片染色一体机、德国徕卡公司研发的Leica ST5020多功能HE染色机及盖片一体机^[9-14]，这些设备均能够自动完成多工位、高精度的细胞染色操作。但是，目前仍缺乏可匹配血小板超微结构检测的免疫荧光自动染色设备。

为解决上述问题，本文针对血小板全自动免疫荧光染色控制系统展开了研究。参考血小板人工免疫荧光染色的基本步骤，利用Keil5、QT和Microsoft Visual Studio等软件开发了免疫荧光染色控制系统的软件程序。此外，使用Altium Designer软件设计了免疫荧光染色控制系统的电路结构，并通过STM32F103ZET6芯片实现了血小板免疫荧光染色设备的自动控制。这项设计旨在解决人工染色操作效率低、难以标准化以及染色结果不稳定等问题，以实现高效率、高度集成的血小板全自动免疫荧光染色。

免疫荧光染色控制系统的主要功能是实现血小板的全自动免疫荧光染色。免疫荧光染色分为8个步骤：打孔、封闭、一抗标记、一抗漂洗、二抗标记、二抗漂洗、PFA（polyformaldehyde fixative，多聚甲醛固定液）固定、漂洗^[15]。从染色的整体操作来看，主要分为3个操作步骤：滴加试剂、清洗工位和盖玻片。血小板免疫荧光染色步骤如表1所示。

在传统人工染色过程中，操作者通过试管将试剂滴加到生物样本上方，使得样本与试剂能够接触以进行反应。而在全自动血小板免疫荧光染色设备中，使用试剂滴加模块替代手动操作。试剂滴加模块可将不同试剂准确地滴加到载玻片位置，以便载玻片上的样本与试剂进行充分反应，因滴液精度提升，试剂使用量大幅减少。此外，在传统人工染色过程中，操作者通常将培养皿密封静置，以使试剂与样本的反应时间达到预设时长。而在全自动血小板免疫荧光染色设备中，使用经黏附处理的载玻片，能够将样本固定在载玻片上。在每一次滴加试剂后，须滴加定量的洗涤液以洗涤上次的残留试剂并进行振荡，使其充分反应，再将洗涤液吸出。在全自动血小板免疫荧光染色设备中，使用蠕动泵和喷嘴将洗涤液滴加到载玻片上，并使用微量注射泵控制需高精度滴加的试剂；染色结束后，使用气泵和气嘴将反应后的试剂排出至载玻片夹具之外。

为实现上述功能，开发免疫荧光染色控制系统，其总体设计方案如图1所示。该控制系统主要包括电源模块、主控模块、传感反馈模块、运动执行模块等硬件部分和软件部分（由上位机和下位机组成）。其中，电源模块通过220 V转24 V变压器为各模块供电。主控模块为基于STM32的开发板，接收来自下位机的运动指令，以控制运动执行模块完成相应的操作步骤；同时接收各传感器的反馈信号，以调节运动执行模块的运动。传感反馈模块主要由温度传感器、气压传感器、激光传感器、光电开关以及配套电路组成。运动执行模块由闭环步进电机、隔膜泵、蠕动泵、气泵以及驱动电路组成。运动执行模块用于执行染色过程的各个操作步骤，并通过传感反馈模块将接收到的每一步运动信息反馈至主控模块。用户通过上位机向下位机发送指令，同时对免疫荧光染色设备状况（反应剩余时间、设备的温度和湿度等）进行实时监测。下位机通过与主控模块交互来控制运动执行模块和传感反馈模块。在免疫荧光染色控制系统中，各部分皆通过有线连接的方式进行数据传输。

本文设计了基于STM32的开发板，作为免疫荧光染色控制系统的主控模块，其原理如图2所示。主控模块电路以STM32F103ZET6芯片为内核^[16-20]，电路中集成了多个多功能输入和输出引脚，这些引脚有助于将软件信号的变化转换为引脚上逻辑电平的变化。通过有线连接，这些变化的电平被分配到运动执行模块和传感反馈模块。此外，主控模块还具有多个定时器，有助于控制电机、气泵和传感器等元件的功率状态和运动曲线。开发板上包含控制信号输出、传感器信号输入、引脚分配口、网线转接口等多个区域。其中，传感器信号输入区域能够接收各传感器的反馈信号并传输至STM32F103ZET6芯片处理；控制信号输出区域接收来自STM32F103ZET6芯片的信号，用于控制执行元件的运动；引脚分配口用于集成分配至不同执行元件的控制引脚；网线转接口用于连接免疫荧光染色设备其他位置元件的信号线。开发板通过多个3.3 V和5.0 V的接口为控制电路供电，并从通过USB（universal serial bus，通用串行总线）接口连接的计算机获得电源，从而实现电源模块为其余模块供电。

运动执行模块通过控制德轩DM420驱动器来控制气泵、微量注射泵、蠕动泵、闭环步进电机和隔膜泵等运动部件。其中：隔膜泵用于抽空管道内的空气，以使吸盘内外形成气压差，从而使吸盘能够吸附盖玻片。蠕动泵用于从大型试剂瓶中吸取用量较大的洗涤液或PBS溶液，并通过排液口将其排放至载玻片上。本文所使用的蠕动泵的型号为KCS-SA-B-B166。微量注射泵用于从小型试剂瓶中吸取用量较小的Trition-X-100、抗体溶液和PFA溶液，通过枪头滴加装置将吸取的溶液滴加到载玻片上。本文使用美国TriContinent公司生产的Air-Z Legacy微量注射泵。闭环步进电机采用深圳中菱精密有限公司生产的zlis07-1步进电机，作为X、Y运动轴的电机，其主要功能是在载玻片平台上实现运动轴的精准运动。在2个步进电机的协同驱动下，X、Y运动轴可以到达载玻片平台上的任意位置。此外，还配备了2个Z轴电机和排液口。Z₁轴电机搭载吸盘，用于控制吸盘的上下运动，通过隔膜泵的运动来实现对载玻片平台上盖玻片的吸取，本文所选用的Z₁轴电机为宁波格特威电机有限公司生产的3401HY25-52D2电机；Z₂轴电机搭载移液器，用于夹持枪头并控制枪头的上下移动，以配合微量注射泵实现微量试剂的滴加，本文所选用的Z₂轴电机为德国Trinamic公司生产的QMot QSH2818电机。

传感反馈模块的执行部件由金属-氧化物-半导体场效应晶体管（metal-oxide-semiconductor field effect transistor，简称MOS管）控制开启与关闭。以LED（light emitting diode，发光二极管）灯的开启与关闭为例，其对应的MOS管控制原理如图3所示。传感反馈模块的执行部件包括气压传感器、光电开关、激光传感器和温度传感器。其中：气压传感器用于监测管道内部的气压，当吸盘未吸取到盖玻片时，管道内为大气压；当吸取到盖玻片时，管道内会产生负压。光电开关布置在步进电机的初始位置处，用于监测电机是否复位，同时设置了电机运动的起始参考点，当与电机连接的遮光片经过光电开关时，光电开关的电压信号会发生变化。激光传感器布置在移液器侧方，用于判断移液器是否取到枪头，当取到枪头时，激光传感器的信号发生变化。温度传感器用于监测免疫荧光染色设备的温度变化。传感反馈模块的电路可收集上述信号变化并反馈给下位机软件，从而实现执行机构运动状态的改变。若未实现预设功能，则下位机软件会通过选定的通信协议向上位机传输信号并发出警报，以终止所有操作。

传感反馈模块采用高速光耦隔离，即利用光学元件和电子元件，先将传感器的输入信号转换为光信号，再将光信号转换回电信号。高速光耦隔离的发送端包含1个LED灯，当输入电压变化时，LED灯发射光信号；接收端包含1个光敏二极管，其可将感测到的光信号转换为对应的电信号，从而将传感器的电压变化信号通过光耦隔离传递至下位机，其原理如图4所示。

下位机软件基于STM32F103ZET6芯片进行设计。STM32F103ZET6芯片采用ARM Cortex-M3，故下位机软件具有高性能和低功耗的特点。ARM Cortex-M3能够处理复杂的任务，且能在低功耗模式下运行，适用于各种应用场景。下位机软件主要由系统初始化程序、数据采集程序、数据接收处理程序、数据传输程序、定时程序、引脚分配程序以及系统中断程序组成。其中：系统初始化程序用于初始化系统的执行元件、定时程序、串口以及引脚；数据采集程序用于采集传感器反馈给控制电路的信号；数据接收处理程序根据所接收的部分信号进行后续的X、Y、Z运动轴运动分配；数据传输程序用于将部分信号传输给上位机，例如系统报错、自检的各个步骤是否通过以及程序当前进行步骤等；系统中断程序用于在系统出现异常时中断一切操作；引脚分配程序根据端口使能和工作模式设置引脚功能。

下位机软件在Keil5开发系统中进行开发，使用C语言进行编写。在Keil5开发系统中完成下位机软件程序的编译后，使用FlyMcu软件将其烧录到STM32F103ZET6芯片中。下位机与上位机通过USART（universal synchronous/asynchronous receiver/transmitter，通用同步/异步串行接收/发送器）串口通信协议进行交互。下位机将先执行初始化程序，并等待上位机发送位置坐标、运动信息等。在接收到上位机发送的指令后，下位机控制运动执行模块进行相应的操作，并根据传感反馈模块的反馈信号实现免疫荧光染色设备的全自动工作。下位机软件运行流程如图5所示。

上位机软件通过结合Visual Studio（VS）和QT框架进行开发，以C++语言为基础。上位机软件界面从上至下依次为标题栏、菜单栏、工具栏、主窗口和状态栏。当用户选择不同数量和位置的工位、不同种类的染色试剂时，主窗口、状态栏处会显示不同的内容，工具栏图标也会根据所选功能在“激活”和“灰显”之间变化，而标题栏、菜单栏始终保持不变。运行设备、暂停设备、设备复位、试剂清空以及工位清洗均可使用工具栏中的快捷键完成。

上位机软件界面分为3个模块：工位数量选择模块、抗体种类选择模块以及系统状态显示模块。在工位数量选择模块中，通过设置血小板荧光染色所需的工位数量，可按照实际所需染色样本的数量进行染色，避免了试剂浪费和空闲工位上试剂溅射等问题。当程序启动时，主窗口会显示工位1~10，系统对每个工位均可实现上述染色过程。以工位1为例，点击主窗口上方的按钮“1”以选择该工位，则第1列变为高亮，再点击按钮“1”以恢复至初始状态；其他工位的操作类似。在抗体种类选择模块中，通过设置本次染色所用的抗体，可按照实际需求实现不同方式的血小板针对性染色，从而得到理想的染色结果。用户提前按照指定位置放置探针，即可在上位机软件界面中选择本次染色所需的抗体类型。程序启动时“一抗”按钮、“二抗”按钮设置为不可选中，当主窗口显示的工位1~10所在列变为高亮后，才能进行抗体选择；当开始选择抗体时，默认选择“一抗1”和“二抗1”，用户可以通过单击相应按钮选中所需的探针，此时该探针对应按钮呈现被选择状态，其他探针对应按钮则呈未被选择状态，点击“开始”快捷键，确认所选抗体，在系统运行过程中所选抗体类型不可改变。系统状态显示模块用于显示系统当前所处状态，以使用户有效掌握系统的运行情况，从而合理安排染色流程。用户在设置完毕后，点击工具栏中的“开始”快捷键，系统随即开始运行，界面状态栏显示“系统运行中”。此时主窗口的工位选择按钮进入不可选取状态，“开始”快捷键也进入不可选取状态，抗体选择框皆由高亮状态变为灰显状态，即进入不可选取状态，用户不能再进行设置。点击工具栏中的“暂停”快捷键，系统停止运行，再次点击“暂停”快捷键，系统即可恢复之前的运行。点击工具栏中的“复位”快捷键，系统先运行暂停功能，即先停止运行，再将用户所设置的工位、所选的抗体类型清空，此时“开始”快捷键变为可选取状态，界面恢复至初始状态。在系统运行过程中，剩余时间显示表格会实时显示每一个染色步骤的剩余时间，剩余时间会根据所选工位数量和工位位置进行变化，界面右上方实时更新总剩余时间。上位机软件界面如图6所示。

为实现血小板全自动免疫荧光染色操作，基于所设计的免疫荧光染色控制系统，搭建相应的染色设备，如图7所示。免疫荧光染色设备台面上方布置了存放滴液枪头的试剂盒、存放盖玻片的盖玻片夹具、存储微量试剂的控温装置以及X、Y、Z运动轴及其搭载的运动平台，其中运动平台上搭载了X、Y运动轴的驱动电机以及隔膜泵、微量注射泵。染色设备台面下方布置了存放大量试剂的试剂瓶以及蠕动泵。染色设备背后装载了电源模块和控制电路（见图8）。该染色设备一次能实现10个血小板样本的自动染色。通过对染色设备进行多次空白测试（即不进行染色操作），发现所设计的免疫荧光染色控制系统可驱动运动轴进行精确定位。经过多次多工位定点测试发现，运动轴的重复定位精度达到±0.1 mm；气泵通过气嘴的3次吹气即可将残留在载玻片上的试剂清洗干净；利用隔膜泵通过吸盘吸取盖玻片，盖、取玻片的失误率小于0.5％；滴加微量试剂的精度达到1 μL，滴加大量试剂的精度达到1 mL；微量试剂的温度可稳定在3~4 ℃，控温误差在±0.01 ℃以内，即能够保证有机试剂的活性。由此说明，所设计的免疫荧光染色控制系统可实现血小板的全自动免疫荧光染色。

使用所搭建的染色设备开展多次血小板免疫荧光染色实验，实验样本以及所有实验试剂均由武汉血液中心提供，实验总时长为700 min。结果表明，所设计的免疫荧光染色控制系统可实现血小板荧光染色过程的全自动控制；在实验过程中，试剂能够完全覆盖含血小板的生物样本，工位清洗后样本上残留的试剂量小于50 μL，盖、取玻片操作均未发生失误，运动轴均未出现任何故障。将染色后的血小板样本置于普通低功率荧光下进行观察，能看见清晰的荧光样本。通过超分辨率显微镜进行观察，发现使用vWF（von Willebrand factor，血管性血友病因子）标记的荧光样本形态清楚，能够看清血小板颗粒状形态；使用Tubulin（微管蛋白）标记的荧光样本形态清楚，能看清完整血小板“圆环样”微管形态，且背景噪声弱，如图9所示。

本研究针对国内全自动血小板免疫荧光染色设备空白的现状，设计了一种全自动免疫荧光染色控制系统。通过对免疫荧光染色控制系统的硬件与软件进行设计，实现了试剂的高精度滴加及试剂与样本的充分反应，大幅减少了试剂使用量，有效地弥补了传统人工染色的不足。基于C++和C语言开展了控制系统软件开发，所设计的上位机软件界面可清楚显示染色过程中的各项参数，便于用户操作和监测染色进程。最后，基于所设计的免疫荧光染色控制系统，搭建相应的染色设备并开展染色实验。结果表明，该控制系统可实现对整个血小板免疫荧光染色过程的全自动控制，最终获得的血小板染色结果稳定、清晰。该染色设备弥补了国内全自动血小板免疫荧光染色设备的空白，其可为 血小板超微结构检测、AIS药物的开发研究提供高效的实验工具。