2. 嘉兴市嘉源给排水有限公司, 浙江 嘉兴 314000;
3. 浙江工业大学 建筑工程学院, 浙江 杭州 310014
2. JiaYuan Water Supply and Sewerage Limited Company, Jiaxing 314000, China;
3. Architectural Engineering Institute, Zhejiang University of Technology, Hangzhou 310014, China
在供水系统中管道内壁与饮用水长期接触的表面存在着微生物群落[1]的生长与繁殖所形成的生物膜, 管道中约有95%的细菌附着生长在管道内壁生物膜中[2].生物膜是由微生物以及其产生胞外聚合物[3](EPS)和水中的无机物、有机物相互粘和形成的聚合体系.管道内壁生物膜的形成会导致许多问题的发生, 例如腐蚀微生物会对管道内壁造成腐蚀[4], 水体中消毒剂如余氯与生物膜中有机物反应生成有毒消毒副产物[5]以及吸附在管道内壁上的重金属[6]释放到水体等不良现象, 从而影响饮用水水质安全[7].
Ren等[8-9]探究不同管材内壁所形成的生物膜中微生物群落结构的差异.Luo等[10]采用454焦磷酸测序, 分析生物膜中微生物群落对水质的影响.城镇供水管道末梢的水体常处于滞流工况, 滞流工况下管道内的水质会逐渐恶化, 如浊度、色度、细菌等指标的上升[11-13]；同时, Douterelo等[14]的研究表明, 水力停留会对生物膜和水体中微生物群落结构和组分产生影响.某些微生物不但可以影响电化学腐蚀速率, 而且可以改变腐蚀产物, 如食酸菌属(Acidovorax)、脱硫弧菌属(Desulfovibrio)等会加速管道腐蚀[15], 而这将影响导致水质的恶化.
尽管前人的研究对不同管材生物膜中微生物群落结构差异以及微生物群落对水质的影响进行了许多研究, 但是以上学者的研究存在以下几个缺陷.1) 大多实验是基于小试研究, 以复杂的实际供水管道为研究对象的报道较少.2) 生物膜中的微生物群落对管壁的腐蚀和对水质影响的研究基本以金属管材为主, 并未展开金属管材与非金属管材的对比研究.3) 由于水质、水力条件等影响导致管道内壁微生物群落在空间分布上存在差异, 而这方面的研究基本没有.
本文在中国东部某城市市政管网末梢, 以管龄为7年、DN100的球墨铸铁管和HDPE管材为研究对象开展滞流实验, 探究在滞流工况下球墨铸铁管和HDPE管内壁生物膜中微生物群落空间结构上分布的差异性, 为控制供水管道生物膜中的微生物群落提供理论参考.
1 实验材料与方法 1.1 实验装置简介如图 1所示, 管网试验中试平台位于中国东部某市, 该中试点于2009年6月投入建成使用, 由4组管道组成, 分别为DN100的HDPE管、球墨铸铁管和DN200的HDPE管、球墨铸铁管.该中试平台与实际市政管网相连接, 并且非循环运行, 以达到模拟实际供水管道内生物膜的生长情况的效果.
|
图 1 管网试验中试平台 Fig. 1 Photos of pilot system researched water supply pipelines |
采用DN100球墨铸铁管(DCIP)和高密度聚乙烯管(HDPE)作为滞流实验对象, 两条管道上均平行设有水样采集口.在开始实验时, 须缓慢关闭管道两端的阀门, 以免因为水力或者水流条件突变导致管道内生物膜脱落而影响实验结果.在关闭阀门后使水体滞流48 h, 滞流前、后分别采集管道内壁上、中、下不同空间位置上的生物膜, 如图 2所示.
|
图 2 实验管道内壁上/中/下不同空间位置结构示意图 Fig. 2 Spatial structure of pipe inner wall |
水质检测指标、仪器如表 1所示.水质检测方法依据国家饮用水检测标准(GB/T5750.6-2006).
|
表 1 检测参数和仪器(方法) Table 1 Water parameters and measurement instrument |
在每条管线上分别拆卸3截平行试验管段, 将试验管段从空间上分成上部、中部和底部三等分并分别用灭菌的试管刷刷洗管道的内壁, 用无菌生理盐水冲洗, 冲洗下来的生物膜使用无菌托盘盛接.反复冲刷直至管道内壁表面的生物膜全部冲刷下来为止, 然后将托盘内的生物膜样全部转移至无菌器皿中, 置于低温冷藏.
1.3 DNA的提取和实时荧光定量RT-PCR取适量生物膜样品用Power Soil DNA Kit(mo bio laboratories, carlsbad, CA)进行基因组DNA抽提, 具体操作按照说明书指示进行.提取的基因组DNA采用1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测, 再将提取的基因组DNA置于-20 ℃的冰箱中冷藏, 以用于后续的检测.
采用实时荧光定量(real-time fluorescence quantification, RT-PCR)计数生物膜样品中的活细菌数量.RTFQ PCR采用SYBR GREEN分析法, 对16SrRNA基因V3区进行定量扩增, 扩增引物采用16SrRNA基因V3区引物338F(5-ACTCCTACGGGAG-GCAGC-3) 和518R(5-ATTACCGCGGCTGCT-GG-3)[17-18].RT-PCR测定选用BIO-RadCFX96TM实时荧光定量PCR仪, 扩增反应条件如下：96 ℃预变性3 min；96 ℃变性30 s, 55 ℃退火30 s, 72 ℃延伸30 s, 40个循环；72 ℃延伸5 min.对阴性对照DNA(无菌ddH2O代替模板DNA)和稀释梯度的已知含量的阳性对照DNA(DNA)标样进行3个平行的RT-PCR测试, 每个样品进行3个平行测试, 取平均值用于统计分析.
1.4 Illumina高通量测序和统计方法提取的样品DNA送往杭州谷禾科技有限公司进行高通量测序, 采用illumina测序仪测序.在获得原始数据后, 首先对原始数据进行质量控制(序列长度为200~1 000个碱基对, 连续相同碱基对N＜6；模糊碱基N＜1, Q＜25) 获得最终用于分析的序列；然后应用QIME软件, 根据序列相似度, 将序列归为多个操作单元格(operational taxonomic unit, OTU)[19], 根据OUT列表中的各个样品物种丰富度情况应用软件mothur[20]进行操作.
采用Origin(version 9.0) 和IBM SPSS(version20.0) 对实验数据进行统计分析, 通过单因素方差分析(ANOVA)检验样本的统计学方差, 显著性差异假定p=0.05.采用Genesis Windows对微生物群落进行聚类分析.
2 结果与讨论 2.1 金属与非金属管道内壁生物膜的形态表征高密度聚乙烯管(HDPE)与球墨铸铁管(DCIP)内生物膜的膜龄为7 a.如图 3所示为现场采样时实际管道内壁图片，如图 4所示为对应生物膜的表征形态.
|
图 3 实验管道内壁表征图 Fig. 3 Photographs of pipe inner surface |
|
图 4 管道内壁生物膜扫描电镜图 Fig. 4 SEM images of biofilm on pipes surface |
从图 3(b)可以看出, 球墨铸铁管管道内壁为凹凸不平、形态各异的黄色腐蚀瘤.这些腐蚀瘤主要成分为氢氧化铁化合物, 腐蚀严重程度从管道空间结构的上、中、下部位依次加重.HDPE管管道内壁有一层较均匀的黄色沉积物, 表面覆盖一层生物膜.Niquette等[21-23]对于管材对生物膜的形成影响开展研究.该实验通过电子扫描电镜观察, 对比球墨铸铁管和HDPE管表面生物膜中的细菌形态.从图 4(a)可以看出, HDPE管道内壁表面存在大量不规则颗粒状的沉积物, 当放大倍数达到7 000时, 生物膜中存在大量的杆状菌, 这些菌种附着在颗粒物上；从图 4(b)可以看出, 球墨铸铁管道内壁生物膜中主要分布着球状细菌, 也存在少许杆状细菌.这表明管材对生物膜中细菌形态的分布有一定影响.
2.2 管道内壁空间位置上的微生物数量变化如图 5所示为实验管道在滞流前、后球墨铸铁管和HDPE管内壁不同空间位置S生物膜中细菌总数q的变化, 生物膜中细菌16S rRNA基因拷贝数为106~107cm-2, 这与Liu等[24]的研究结果一致.BS为滞流前, AS为滞流后, U/M/D表示管道上/中/下部.图中，数据结果显示, 滞流前、后管道上、中、下不同位置细菌总数存在明显差异(p＜0.05).在滞流前, 球墨铸铁管和HDPE管细菌数量在管道上部最小, HDPE管和球墨铸铁管细菌总数q分别为1.33×106和2.73×107copies/cm2, 中部和下部细菌数量最多, 其中球墨铸铁管内壁生物膜中细菌数量级是HDPE的10倍.在滞流48 h之后, 实验管道生物膜中细菌数量都大量增加.HDPE管道内壁生物膜空间上、中、下位置细菌数量总数分别为4×106、9×106、1.03×107copies/cm2, 在球墨铸铁管对应位置上的细菌总数分别为3.46×107、6.43×107、4.53×107copies/cm2.可以看出, 在滞流工况下, 与细菌存活存在较强关联性的余氯(r=0.75, p＜0.05) 浓度从滞流前的0.45 mg/L衰减到滞流后的0 mg/L, 这导致生物膜中的细菌数量大大增加.这两种管材内壁生物膜的上部细菌数量增加量最小, 中部和下部增加量最大.管道中部和下部水体中颗粒物(包括吸附在颗粒物上的微生物)主要是重力条件下沉降到管道底部形成的疏松沉积物, 这一区域生物膜积累量最多[25]且营养物质所占比例高, 导致滞流工况下中部和下部细菌数量增加量最大, 管道上部由于微生物不容易附着, 导致细菌数量低于管道其他区域.
|
图 5 滞流前、后管道不同空间位置生物膜中细菌总数变化 Fig. 5 Number of total bacteria in biofilms in spatial structure of pipe wall under stagnation condition |
12个样品高通量测序共获得596 950条有效序列和49 399个OTU(97%相似度水平), 在该次实验分析中总计有389个细菌种属被检测出来, 高通量测序能够反映出较丰富和完整的生物膜细菌群落组成.样品丰度和多样性的分析结果见表 2.表中, Coverage为覆盖率.结果表明, HDPE管壁仅上部生物膜样品的相对丰度(ACE, p＜0.05; Chao1, p＜0.05) 高于球墨铸铁管, 中部和下部的生物膜样品相对丰度均较低.从多样性数据来看(Shannon, p＜0.05; Simpson, p＜0.05), 球墨铸铁管管道各空间位置均明显高于HDPE管.总体来说, 球墨铸铁管管道生物膜的物种丰度和多样性比HDPE管高, 该结果与Ren等[26]的研究结果吻合.
|
|
表 2 管道不同空间位置上生物膜中的微生物群落的丰度和多样性指数(a=0.03) Table 2 Coverage and diversity indices of bacteria 16S rRNA gene libraries of seven biofilm samples (a=0.03) |
如图 6(a)所示为细菌群落门水平分布情况.无论是球墨铸铁管还是HDPE管, 不同空间位置S生物膜样品中百分比例p较多的菌分别为变形菌门(Proteobacteria)、酸杆菌门(Acidobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、厚壁菌门(Firmicutes)、绿弯菌门(Chloroflexi)和放线菌门(Actinobacteria).其中滞流前, 变形菌门(Proteobacteria)在HDPE管道上、中、下部分布较均匀, 分别占总菌的52.26%、53.04%和42.31%.在球墨铸铁管的上、中、下部位变形菌门平均百分比分别占总菌的29.25%、59.25%和43.16%.在滞流之后, 变形菌门(Proteobacteria)在两种管材上、中、下位置的百分比分布依次增加, 其中HDPE管材的下部变形菌门占总菌的58.39%~60.21%；同样地, 球墨铸铁管下部为66.21%~67.18%, 这说明变形菌门(Proteobacteria)在管道下部具有较大的生存竞争优势.对于酸杆菌门(Acidobacteria)而言, 滞流后HDPE管中不同空间位置上的相对于滞流前比例均有所增加, 在管道上部、中部和下部分布均匀, 分别占总菌的17.91%、19.56%、18.65%.球墨铸铁管中酸杆菌门(Acidobacteria)在滞流后在总菌中所占的比例减少, 上部、中部和下部的平均百分比分别为13.79%、13.01%、8.14%.
|
B-滞流前；A-滞流后；DP-球墨铸铁管；PE-HDPE管；U-管道上部；M-管道中部；D-管道下部 图 6 管道生物膜中微生物种群的相对丰度分布 Fig. 6 Relative abundance of bacteria in biofilm of pipes |
从纲水平上分析如图 6(b)所示, HDPE管道中的α-变形菌纲(Alphaproteobacteria)百分比例最高, 在管道上、中、下位置S上平均百分比分别占总菌的40.95%、38.66%和25.54%, 从上至下依次减少, 对应的球墨铸铁管管道内壁生物膜中比例最高的菌为β-变形菌纲(Betaproteobacteria), 上、中、下位置平均依次为16.84%、25.60%和13.57%.在滞流48 h后, HDPE管中α-变形菌纲(Alphaproteobacteria)为主要菌种且在上、中部位分别减少为25.01%和20.54%, 在下部有所增加.球墨铸铁管中优势菌β-变形菌纲(Betaproteobacteria)在上、中、下部位分别增加3.08%、5.23%和5.89%.对于HDPE管道而言, 其他菌依次为β-变形菌纲(Betaproteobacteria)、δ-变形菌纲(Deltaproteobacteria)和放线菌纲(Actinobacteria), 在滞流前、后, 所占比例变化不大, 而且在上、中、下分布较均匀.球墨铸铁管中的α-变形菌纲(Alphaproteobacteria)、γ-变形菌纲(Gammaproteobacteria)、δ-变形菌纲(Deltaproteobacteria)和放线菌纲(Actinobacteria)在滞流之后均有不同程度的增加, 而且在上、中、下三个位置所占比例分布差异较大.
滞流前、后管道不同空间位置上微生物群落组成属水平上的变化可以借助图 6(c)所示的聚类热图结果进行分析.图 6(c)中的色块表示样品属水平的丰度, 样品横向排列, 属纵向排列.通过样品聚类, 可以了解样品之间的相似性以及属水平上微生物群落的丰度.12组样品丰度最高的35个属分析结果如图 6(c)所示, 其中丰度较高的主要有披毛菌属(Gallionella)、鞘氨醇杆菌属(Sphingomonas)、芽孢杆菌属(Bacillus)、硝化螺菌属(Nitrospira)、脱氯单胞菌属(Dechloromonas)、假单胞菌属(Pseudomonas)、不动杆菌属(Acinetobacter)、黄杆菌属(Flavobacterium)、噬氢菌属(Hydrogenophage)、固氮螺菌属(Azospira)、脱氯单胞菌属(Dechloromonas)、生丝微菌属(Hyphomicrobium)、沉积物杆状菌(Sediminibacterium)、地发菌属(Geothrix)、芽孢杆菌属(Bacillus)和假单胞菌属(Pseudomonas)等.脱氯单胞菌属(Dechloromonas)和披毛菌属(Gallionella)会加速管道腐蚀以及铁释放[27].在滞流前, 脱氯单胞菌属(Dechloromonas)在球墨铸铁管的上、中、下部位分别为(3.155%~3.57%)、(16.18%~18.21%)和(10.03%~11.31%)；滞流之后有所增加, 其中管道中部比例最高增加至36.64%.形成对比的HDPE管在滞流前, 上、中、下含量分别只有(0.01%~0.04%)、(0.04%~0.06%)、(0.33%~0.45%)；在滞流之后, 上、中、下变化基本不大.披毛菌属(Gallionella)在球墨铸铁管道上、中、下部位分别为(4.339%~4.51%)、(23.38%~24.31%)和(7.16%~7.51%)；在滞流之后, 分别为(7.48%~7.68%)、(23.81%~24.35%)和(20.13%~22.31%).可以看出, 中部增加量最大且在总菌中所占百分比例最高.对于HDPE管材, 滞流前、后百分比变化不大, 上、中、下分别为(0.02%~0.119%)、(0.339%~0.348%)和(0.238%~1.679%).这些数据表明, HDPE管材相对于球墨铸铁管而言, 微生物群落变化不大且较稳定, 球墨铸铁管道空间结构上腐蚀菌分布差异较大, 中部含量最高而且在滞流前后变化较大, 说明中部区域菌属生命活动较活跃.
3 结论(1) 球墨铸铁管和HDPE管管道内壁生物膜中, 细菌总数均呈上部最少, 中部和下部最大.滞流后, 细菌总数的变化同样是上部最小, 中部和下部最大.
(2) HDPE管壁仅上部生物膜样品的丰度(ACE, p＜0.05;Chao1, p＜0.05) 高于球墨铸铁管, 中部和下部的生物膜样品丰度均较低.从多样性数据来看(Shannon, p＜0.05;Simpson, p＜0.05), 球墨铸铁管管道各空间位置均明显高于HDPE管.
(3) 在滞流前、后, HDPE管道上、中、下不同空间位置的微生物群落结构变化不大且分布较均匀；球墨铸铁管变化较大, 腐蚀菌属从上至下依次增加, 滞流前、后中部菌落百分比含量变化较大, 要加强关注管道中部腐蚀菌落对管道腐蚀的影响.
| [1] | RAGUSA S R, MCNEVIN D, QASEM S, et al. Indicators of biofilm development and activity in constructed wetlands microcosms[J]. Water Research, 2004, 38(12): 2865–2873. DOI:10.1016/j.watres.2004.03.039 |
| [2] | SIMOES L C, SIMOES M, VIEIRA M J. Influence of the diversity of bacterial isolates from drinking water on resistance of biofilms to disinfection[J]. Applied and Environmental Microbiology, 2010, 76(19): 6673–6679. DOI:10.1128/AEM.00872-10 |
| [3] | DAVⅡES D G W. Extracelluar DNA required for bacteral biofilm formation[J]. Science, 2002, 22(295): 1487–1490. |
| [4] | TENG F, GUAN Y T, ZHU W P. Effect of biofilm on cast iron pipe corrosion in drinking water distribution system: corrosion scales characterization and microbial community structure investigation[J]. Corrosion Science, 2008, 50(10): 2816–2823. DOI:10.1016/j.corsci.2008.07.008 |
| [5] | SEDLAK D L, VON GUNTEN U. The chlorine dilemma[J]. Science, 2011, 331(7): 42–43. |
| [6] | CLARK B N, MASTERS S V, EDWARDS M A. Lead release to drinking water from galvanized steel pipe coatings[J]. Environmental Engineering Science, 2015, 32(8): 713–721. DOI:10.1089/ees.2015.0073 |
| [7] | LEHTOLA M J, MIETTINEN I T, KEINäNEN M M, et al. Microbiology, chemistry and biofilm development in a pilot drinking water distribution system with copper and plastic pipes[J]. Water Research, 2004, 38(17): 3769–3779. DOI:10.1016/j.watres.2004.06.024 |
| [8] | REN Hong-xing, WANG Wei, LIU Yan, et al. Pyrosequencing analysis of bacterial communities in biofilms from different pipe materials in a city drinking water distribution system of East China[J]. Applied Microbiology and Biotechnology, 2015, 99(24): 10713–10724. DOI:10.1007/s00253-015-6885-6 |
| [9] | TEUGHELS W, VAN ASSCHE N, SLIEPEN I, et al. Effect of material characteristics and/or surface topography on biofilm development[J]. Clinical Oral Implants Research, 2006, 17(supple.2): 68–81. |
| [10] | LUO J, LIANG H, YAN L, et al. Microbial community structures in a closed raw water distribution system biofilm as revealed by 454-pyrosequencing analysis and the effect of microbial biofilm communities on raw water quality[J]. Bioresource Technology, 2013, 148(15): 189–195. |
| [11] | VREEBURG I J H G, BOXALL D J B. Discolouration in potable water distribution systems: a review[J]. Water Research, 2007, 41(3): 519–529. DOI:10.1016/j.watres.2006.09.028 |
| [12] | RAMOS H M, LOUREIRO D, LOPES A, et al. Evaluation of chlorine decay in drinking water systems for different flow conditions: from theory to practice[J]. Water Resources Management, 2010, 24(4): 815–834. DOI:10.1007/s11269-009-9472-8 |
| [13] | BOXALL J M S R. Online modeling of water distribution systems a UK case study[J]. Drink Water Engineering and Science, 2010, 3(14): 21–27. |
| [14] | DOUTERELO I, SHARPE R L, BOXALL J B. Influence of hydraulic regimes on bacterial community structure and composition in an experimental drinking water distribution system[J]. Water Research, 2013, 47(2): 503–516. DOI:10.1016/j.watres.2012.09.053 |
| [15] | LIDER K, DVIDS Y J. Characterization of bacteria community structure in a drinking water distribution system during an occurrence of red water[J]. Applied Environmental Microbiology, 2010, 76(21): 7171–7180. DOI:10.1128/AEM.00832-10 |
| [16] | WAN Y, ZHANG D, LIU H, et al. Influence of sulphate-reducing bacteria on environmental parameters and marine corrosion behavior of Q235 steel in aerobic conditions[J]. Electrochimica Acta, 2010, 55(5): 1528–1534. DOI:10.1016/j.electacta.2009.10.009 |
| [17] | WEISBURG W G B S M P. 16S Ribosomal DNA amplification for phylogenetic study[J]. Journal of Bacteriology, 173(2): 697–703. DOI:10.1128/jb.173.2.697-703.1991 |
| [18] | MUYZER G D W E C. Profiling of complex microbial populations by denaturing gradient gel electrophoresis analysis of polymerase chain reaction-amplified genes coding for 16S rRNA[J]. Applied and Environmental Microbiology, 1993, 59(3): 695–700. |
| [19] | CAPORASO J G, KUCZYNSKI J, STOMBAUGH J, et al. QⅡME allows analysis of high-throughput community sequencing data[J]. Nature Methods, 2010, 7(5): 335–336. DOI:10.1038/nmeth.f.303 |
| [20] | LI D, LI Z, YU J, et al. Characterization of bacterial community structure in a drinking water distribution system during an occurrence of red water[J]. Applied and Environmental Microbiology, 2010, 76(21): 7171–7180. DOI:10.1128/AEM.00832-10 |
| [21] | NIQUETTE P, SERVAIS P, SAVOIR R. Impacts of pipe materials on densities of fixed bacterial biomass in a drinking water distribution system[J]. Water Research, 2000, 34(6): 1952–1956. DOI:10.1016/S0043-1354(99)00307-3 |
| [22] | HALLAM N B, WEST J R, FORSTER C F, et al. The potential for biofilm growth in water distribution systems[J]. Water Research, 2001, 35(17): 4063–4071. DOI:10.1016/S0043-1354(01)00248-2 |
| [23] | YU J K D L T. Microbial diversity on biofilms on water distribution pipes of different material[J]. Water Science and Technology, 2010, 1(61): 163–171. |
| [24] | LIU G, LUT M C, VERBERK J Q J C, et al. A comparison of additional treatment processes to limit particle accumulation and microbial growth during drinking water distribution[J]. Water Research, 2013, 47(8): 2719–2728. DOI:10.1016/j.watres.2013.02.035 |
| [25] | LIN W, YU Z, ZHANG H, et al. Diversity and dynamics of microbial communities at each step of treatment plant for potable water generation[J]. Water Research, 2014, 52(14): 218–230. |
| [26] | REN Hong-xing, WANG Wei, LIU Yang, et al. Pyrosequencing analysis of bacteria communities in biofilm from different pipe materials in a city drinking water distribution systems of East China[J]. Environmental Biotechnology, 2015, 99(23): 10713–10724. |
| [27] | EMERSON D, FLEMING E J, MCBETH J M. Iron-oxidizing bacteria: an environmental and genomic perspective [Z]. Annual Review of Microbiology, 2010:64(21): 561-583. |