2. 浙江大学 流体动力与机电系统国家重点 实验室, 浙江 杭州 310027
2. State Key Laboratory of Fluid Power and Mechatronic Systems, Zhejiang University, Hangzhou 310027, China
组织工程是一门结合工程学和自然科学的综合性学科，致力于发展生物材料以修复、替代、提高人体器官及其功能[1].细胞、支架和生长因子是构成组织工程的三大要素.其中支架是组织工程非常重要的一个组成部分，可以为细胞的附着、迁移和增殖提供理想的环境[2].目前，制造组织工程支架的技术有很多，如热致相分离法[3]、粒子沥滤法[4]和冷冻-干燥法[5]等，静电纺丝法能够连续制备纳米或亚微米级超细纤维，因而逐渐成为一种制造组织工程支架最重要的方法[6].近年来，利用静电纺丝技术制备的聚合物纳米纤维已经在软骨[7]、骨[8]、血管[9]、心脏[10]、神经[11]、皮肤[12]和膀胱[13]等组织工程研究领域中取得广泛应用.
细胞电位传感器是一种以具备电兴奋特性的细胞，如心肌细胞和神经元等作为敏感元件的细胞传感器，应用于药物检测和环境监测等领域.基于平面微电极阵列(microelectrode array，MEA)的细胞电位传感器是目前最常用的胞外电位记录手段，它可以实时检测和记录具备电兴奋特性细胞的电生理信号[14].传统构建心肌细胞电位传感器的方法是将心肌细胞培养在MEA芯片表面，用于检测心肌细胞的胞外场电位信号(extracellular field potential，EFP)，从而实现心脏疾病相关药物和毒素的检测分析等[15-16].相比于三维培养，这种平面二维的培养方法直接将细胞暴露在玻璃或硅等硬基底上，不能完全模拟心肌细胞的三维在体环境[17-19].目前的研究已经证明，三维环境下培养的细胞的增殖和形态与二维培养模型相比更具有生理意义[20-21].
本文利用3D打印和静电纺丝技术制造组织工程支架，选取心肌细胞在支架内进行三维培养，结合光学显微镜分析心肌细胞在支架中的贴附和生长情况.将心肌细胞支架与MEA芯片相耦合，构建3D细胞传感器模拟在体环境，检测心肌细胞的胞外电位信号.
1 材料和方法 1.1 试剂和仪器试剂及耗材如下：聚乳酸(PLA)(北京Alkht有限责任公司)；聚己内酯(PCL)(瑞典柏斯托公司)；明胶(gelatin，Sigma)；平衡盐溶液HBSS(Hanks’Balanced Salt Solution，Gibco)；胰蛋白酶(Trypsin，Gibco)；Ⅱ型胶原蛋白酶(Collagenase Type Ⅱ，Gibco)；高糖培养基DMEM(Dulbecco’s Modified Eagle Medium，Hyclone)；胎牛血清FBS(Fetal Bovine Serum，Gibco)；5 mL玻璃瓶；离心管；细胞筛；细胞培养瓶；细胞培养皿；细胞计数板.
仪器如下：静电纺丝机(深圳通力微纳科技有限公司)；FDM三维打印机(杭州普林诺科技有限公司)；注射泵(杭州普琳诺科技有限公司PN-IJ001)；手术镊；眼科剪；眼科弯镊；解剖板.
1.2 组织工程支架的设计和制造熔融沉积成型(fused deposition modeling，FDM)是Crump[22]发明的一种将热熔性材料加热熔化成型的快速成型技术，可以将熔体逐层沉积，实现立体成型.静电纺丝是采用静电力将高分子溶液拉伸成细流后固化成型来制备纳米纤维的方法，可以大规模制备纳米尺寸的纤维；纤维结构的均一性高，成本低廉[23].PLA和PCL是两种具有良好生物相容性和无毒性的生物材料，广泛应用于组织工程的研究[24].其中，PLA强度高，透明性好，但韧性较差，断裂伸长率和冲击强度低[25].PCL具有良好的柔韧性，加工性较好[26].本文结合3D打印和静电纺丝两种技术，利用PLA和PCL两种材料，制造了复合支架.
首先利用FDM打印机，采用PLA丝材，打印出分层网格化的井字形结构；然后利用静电纺丝机，采用PCL溶液，在PLA支架上覆盖一层合适密度的PCL薄膜.如图 1(a)所示为并联型FDM打印机，用于制造PLA支架；打印后的效果如图 1(b)所示；从图 1(c)可以看出，PLA丝宽约为400 μm.如图 1(d)所示为静电纺丝机原理示意图，通过注射泵输出PCL溶液，在高压电场的作用下纺出PCL丝，用于制造PCL支架.图 1(e)、(f)展示了在打印成型的PLA支架上静电纺丝覆盖一层PCL薄膜，从不同显微镜下的效果图可以看出，nm尺度的PCL丝有效黏贴在PLA支架上.
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图 1 组织工程支架制造过程 Fig. 1 Manufacturing process of tissue engineering scaffolds |
该方法选取PLA和PCL两种生物相容性材料，结合不同的制造工艺制作组织工程支架.其中，利用FDM打印工艺制造出支架的整体框架，为整个结构提供强度支撑；利用静电纺丝工艺，制造出支架内的纳米结构，为细胞生长提供有利的三维生长环境.
1.3 微电极阵列(MEA)芯片制作与信号检测系统MEA芯片的基本结构包括绝缘基底、金属层电极阵列和钝化层三部分，采用标准微加工技术制作.采用6×6阵列MEA芯片，如图 2(a)、(b)所示.芯片尺寸为2 cm×2 cm，每块芯片有32个记录电极，4个参考电极分布在芯片四角.加工好的芯片经划片、贴片、点焊金线后，在芯片表面使用硅胶封装培养腔.在封腔完毕后，在电极表面电镀铂黑，增大表面积，以减小电极阻抗，从而提高信噪比.在细胞培养前，先后用去污剂和双蒸水清洗并进行烘干，最后置于超净台紫外灭菌.为了提高MEA芯片表面与细胞的耦合程度，在MEA芯片表面包被0.01%明胶(粉剂购自Sigma公司，用PBS缓冲液配制而成)，并置于4 ℃冰箱中过夜(修饰时间约为16 h).第二天弃去明胶，用无菌水清洗2遍.
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图 2 微电极阵列芯片(MEA)及信号检测系统 Fig. 2 MEA chip and signal detection system |
MEA芯片信号记录采用实验室研制的信号放大采集系统及配套软件，如图 2(c)、(d)所示，主要包括以下3个模块：1) 32通道信号调理电路，对MEA芯片检测到的信号依次进行前置放大、工频陷波、二级放大、带通滤波及输出缓冲处理；2) NI采集卡USB-6218，对信号调理电路的输出信号进行采样，通过USB接口与计算机进行数据传输；3)信号记录软件，用来记录与处理采集到的细胞电位信号数据.该系统的采样率为7 kHz，能够长时程记录细胞电位信号.由于采用的是内置锂电池供电，可以排除50 Hz工频噪声的干扰，噪声水平维持在10 μV左右.
1.4 原代心肌细胞的分离和在支架上的培养选取出生24 h以内的清洁级SD大鼠(Sprague Dawley，购于浙江省医学科学院)，酒精消毒后，放于解剖板上，打开胸腔，取心脏心尖部位，漂洗3次并去除心房和血管等组织.转移心肌组织于平衡盐溶液中，剪成约1 mm3小块，弃上清，加入质量分数为0.07%的胰蛋白酶和质量分数为0.05%的Ⅱ型胶原蛋白酶的消化液，置于培养箱中，隔4 min轻轻晃动玻璃瓶，8 min后弃上清，换一次酶溶液，重复消化12次，直至心肌组织块呈现疏松状态.向残余心肌组织块中加入体积分数为10%的胎牛血清的高糖培养基，轻轻吹打组织3次，收集细胞悬液.以800 r/min的速度离心5 min后，重悬细胞，过70 μm细胞筛，收集细胞悬液于培养瓶中，进行差速贴壁2次，每次45 min.在差速贴壁后，进行活细胞计数，配置成合适的细胞密度，等待接种.
在心肌细胞种植到支架之前，要先对支架进行预处理.将制作好的支架放置于多孔板中，在紫外灯下酒精浸泡1 h，后用PBS缓冲液清洗3次，每次5 min，紫外灯下PBS浸泡1 h，最后用PBS缓冲液清洗3次，每次5 min，加入培养基，放入培养箱中过夜.当种植细胞时，将配好浓度的细胞悬液均匀种植到放置了支架的多孔板中.之后，每隔1 d用体积分数为10%的胎牛血清的高糖培养基全量换液.
1.5 基于细胞支架耦合MEA构建3D心肌细胞电位传感器如图 3所示为细胞支架与MEA芯片耦合构建3D心肌细胞电位传感器的示意图.将从SD乳鼠分离出的原代心肌细胞均匀种植到支架上(见图 3(a))，支架内由静电纺丝形成的PCL纳米丝，纤维直径小，具有较大的比表面积，能够为细胞的黏附提供更多的附着点[27]，因此心肌细胞能够在PLA/PCL支架内贴附并正常生长.培养2 d后，待心肌细胞在支架上贴附稳定且生长状态良好时，将种植了细胞的支架放置于MEA芯片表面(见图 3(b))，与MEA耦合形成生物-电子传感系统.在实验中，为了增强支架与MEA芯片耦合的稳定性，会在支架上施加一个微小的重力(放置小圆盖玻片)以保证支架与芯片位置的相对固定.当支架上的心肌细胞产生动作电位时，会引起细胞膜电位的变化；当MEA传感器附近多个心肌细胞同步放电产生胞外场电位信号(EFP)时，可以用细胞电位检测仪器对支架上心肌细胞的EFP信号进行动态实时的记录(见图 3(c)).
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图 3 基于细胞支架耦合MEA芯片构建3D心肌细胞电位传感器的示意图 Fig. 3 Schematic of three-dimensional cardiomyocytes potential biosensor based on tissue engineering scaffold coupled with MEA |
如图 4(a)所示，培养24 h后，心肌细胞在支架的PCL丝上附着情况良好，部分心肌细胞成团聚集.由于心肌细胞的兴奋-收缩耦联机制[28]，在显微镜下可以观察到，部分成团附着在支架上的心肌细胞开始出现一定频率的自主收缩活动，并且带动所附着的PCL丝一起联合搏动，但此时各自的节律不完全相同.培养48 h后，支架上大部分心肌细胞的搏动趋于稳定一致；72 h后，搏动速率达到(34.25±3.3)次/min.如图 4(b)所示为支架上心肌细胞在不同时刻的搏动速率vb统计图.
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图 4 心肌细胞在支架上的生长和搏动 Fig. 4 Growth and beating of cardiomyocytes in scaffold |
以上实验结果表明，心肌细胞在支架内的贴附和生长情况良好，部分细胞成团聚集，24 h开始产生自主收缩活动，并带动所附着的PCL丝形成联合搏动；48 h后，支架上心肌细胞的搏动趋于稳定；72 h后，能够达到(34.25±3.3)次/min的搏动速率.实验结果表明，以PLA/PCL为材料制造的组织工程支架能够为心肌细胞提供良好的生长环境，具有较好的生物相容性.
2.2 组织工程支架与MEA的耦合将培养了心肌细胞的支架与MEA芯片相耦合，形成3D细胞传感系统是对支架上培养的心肌细胞进行电生理活动检测的关键.从图 5可以看出，心肌细胞支架与MEA芯片贴合紧密，心肌细胞附着在支架的PCL丝上，通过一层薄的电解质溶液与MEA芯片上的电极点相耦合.当电极点附近的心肌细胞产生动作电位时，会导致电极电势的变化，因此可以检测到心肌细胞的EFP信号.由于支架的可移动性，可以适当调整支架在MEA芯片上的位置，使支架上的心肌细胞与尽可能多的电极相接触，提高检测到心肌细胞EFP信号的概率.待信号检测完毕后，将心肌细胞支架取出，重新放回多孔板，在培养箱中继续培养，待下次检测时再次取出放置于MEA芯片上即可.
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图 5 心肌细胞支架与MEA芯片的耦合 Fig. 5 Coupling of cardiomyocytes scaffolds and MEA chip |
选取种植了心肌细胞的支架为实验组，以未种植细胞的支架为对照组，分别与经过预处理过后的MEA芯片相耦合，记录并分析2种情况下MEA传感器的信号响应.如图 6(a)所示，对照组中检测到的信号没有变化；实验组中可以看到明显的响应，且信号发放较规律，峰-峰值达到200 μV，信号的信噪比大于10.对记录到的信号进一步分析，可以发现EFP信号的不同特征.如图 6(b)所示，信号1中的信号幅值较大，信号较平稳；信号2中的信号较弱，幅值较小；信号3中融合了信号1和信号2两种信号特征.EFP信号特征与支架上心肌细胞的起搏点以及细胞状态相关.当支架上的心肌细胞未完全融合形成同步搏动时，可能会有多个起搏点，因此MEA会同时记录到多个起搏点发出的EFP信号.支架上心肌细胞的状态越活跃，EFP信号幅值越大，发放速率越高.
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图 6 支架上心肌细胞EFP信号的检测 Fig. 6 EFP signals detection of cardiomyocytes in scaffold |
以上实验结果表明，以PLA/PCL为材料的支架对MEA芯片的信号检测没有影响；通过将心肌细胞支架与MEA芯片耦合的方法，可以形成3D细胞传感系统，用于检测心肌细胞的胞外场电位，且信号幅值较大，信噪比高，发放稳定.记录到的EFP信号特征与支架上心肌细胞的起搏点和细胞状态相关.
2.4 支架3D培养与平面2D培养的心肌细胞EFP信号的对比为了验证基于组织工程支架耦合MEA芯片构建3D心肌细胞电位传感器的性能，以在芯片表面二维培养心肌细胞的传统方法为对照，分别记录在平面2D培养和支架3D培养两种环境下的心肌细胞EFP信号，提取EFP信号中具有代表性的特征参数信号：脉冲幅值(spike amplitude, SA)和发放速率(firing rate, FR)，分别进行统计分析.
如图 7所示分别为2种培养模式下记录到的心肌细胞EFP信号.可以看出，两组EFP信号在波形上相似，幅值和频率较接近.对EFP信号的幅值U和发放速率v进行统计分析，结果如图 8(a)、(b)所示.2D培养环境下心肌细胞的EFP信号幅值为(228.9±6.9) μV，发放速率为(34.2±4.6)次/min，支架上3D培养心肌细胞的EFP信号幅值为(222.6±41.9) μV，发放速率为(33.9±8.4)次/min.用t检测进行显著性差异分析发现，2种培养环境下所记录到的EFP信号在脉冲幅值(p>0.05，n=29)和发放速率(p>0.05，n=10)上均没有显著差异.
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图 7 不同培养模式下心肌细胞的EFP信号 Fig. 7 EFP signals ofcardiomyocytes in different modes of cultivation |
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图 8 不同培养模式下的EFP信号幅值和发放速率对比 Fig. 8 Comparison of EFP amplitude and firing rate in different modes of cultivation |
以上实验结果表明，通过支架3D培养检测到的心肌细胞EFP信号与传统2D培养环境下所记录到的信号相比，在脉冲幅值和发放速率上较接近.因此将细胞支架耦合在MEA芯片表面来检测心肌细胞电位信号的方法是有效的，与传统平面二维培养的方法一样，均可以用来评价心肌细胞的电生理活动.此外，与平面二维培养相比，在支架上3D培养细胞的方法可以更加真实地模拟生物的在体环境，因此3D细胞传感器的检测结果更具有生理意义.这些特点将在后期与相关在体动物实验的对比中进一步验证.
3 结语本文结合3D打印和静电纺丝工艺制造了组织工程支架，将培养了心肌细胞的支架耦合在微电极阵列(MEA)芯片表面构建3D细胞传感器，用于检测心肌细胞的胞外场电位信号.实验结果表明，心肌细胞可以良好地附着在支架上，生长状态良好，部分细胞成团聚集，产生自主收缩活动，并能够带动PCL丝形成联合搏动，48 h后，支架上心肌细胞的搏动趋于稳定.将心肌细胞支架耦合在MEA芯片表面，可以形成3D细胞传感系统，用于模拟生物的在体环境并检测心肌细胞的胞外场电位，输出稳定、高信噪比的信号.3D心肌细胞传感器记录到的信号与传统平面2D培养心肌细胞所记录到的信号相比，在信号幅值和发放速率上较接近，在支架上3D培养细胞可以更加真实地模拟生物的在体环境，更具有生理意义.
目前，本研究已取得初步的实验结果，但需要进一步的改进和深入研究，如增强支架的导电性能，提高细胞支架与MEA芯片的耦合程度等.本文为3D心肌细胞传感器的构建提供了一种新思路，有望为心脏相关药物的检测与分析提供新的平台，同时有望为心肌组织工程的研究提供一种更有效的体外评价方法和检测手段.
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