2. 浙江省制冷与低温技术重点实验室, 浙江 杭州 310027;
3. 浙江大学 制冷与低温研究所, 浙江 杭州 310027
2. Key Laboratory of Refrigeration and Cryogenic Technology of Zhejiang Province, Hangzhou 310027, China;
3. Institute of Refrigeration and Cryogenics, Zhejiang University, Hangzhou 310027, China
低温保存是指将活的生物样品按照特殊的方法冷却至低温(-196 ℃), 待需要时, 再将生物样品按特殊的方法加热至正常温度, 仍可获得活的生物样品.在低温医学、食品工业、制药和农业生产等领域, 为使生物样品长期保持原有的生理结构和机能, 低温保存已被公认为是最有效的方法[1-2].
为了实现生物样品的低温保存, 均需将一定种类和浓度的低温保护剂载入生物样品, 否则生物样品在经历低温之后很难存活.自1948年发现甘油(GLY)的低温保护作用[3]之后, 多种多样的低温保护剂被陆续发现并广泛使用, 比如二甲亚砜(Me2SO)、乙二醇(EG)、丙二醇(PG)以及各种糖类等[1, 4-6].低温保护剂虽能在低温下对生物样品起保护作用, 但同时也极易在载入以及后期去除过程中因溶液的高渗压应力和毒性对生物样品造成损伤[1, 7-8].这些损伤均与低温保护剂的浓度相关.因此, 无论是在加载还是去除过程中, 对低温保护剂浓度进行监测都显得至关重要.
到目前为止, 研究者已经提出和采用多种不同的低温保护剂测定方法, 其中以核磁共振(NMR)[9-13]和高效液相色谱(HPLC)[14-16]应用最多.理论上, NMR和HPLC适用于测定多数低温保护剂, 但目前多见于对Me2SO的定量, 其他低温保护剂的测定方法仍有待研究.另外, NMR和HPLC方法所需设备昂贵、操作复杂、对分析样品的要求也高[17].近来, 有研究者采用渗透压仪测得低温保护剂溶液的质量渗摩尔浓度(osmolality), 再借助一定的近似假设换算成所要的浓度, 该法已被应用于Me2SO、GLY、EG和PG的定量[18-21].渗透压仪法虽然所需设备便宜、操作简单, 但当待测溶液的浓度较高时, 该法的精度将大大降低[22].笔者所在研究小组曾依据Me2SO含有亚砜基团(-SO-)这一硫基生色团的特性, 采用紫外吸收光谱法测定溶液中Me2SO的含量[23-24].然而, 紫外吸收光谱法对样品的浓度范围同样存在要求, 且要求目标物质具有生色团[17], 是否适用于测定其他低温保护剂有待探索.就目前而言, 上述方法都无法实现对低温保护剂浓度的实时监测.于是, 有研究者提出电导法, 即通过测量低温保护剂溶液的电导率, 建立电导率与低温保护剂浓度的关系[25].他们对GLY/NaCl/H2O和EG/NaCl/H2O 2种典型的三元低温保护剂溶液进行了研究, 但并没有进行实时监测试验, 而且配制溶液时采用的是并不是非常精确的体积法, 同时也没有研究温度对电导率的影响.
本文测量得到了不同温度和低温保护剂浓度下4种典型低温保护剂溶液的电导率, 并建立了电导率与温度和低温保护剂浓度之间的关系式.同时, 实验验证了电导法实时监测低温保护剂浓度的可行性.
1 材料与方法 1.1 样品溶液配制Me2SO、GLY、EG、PG和NaCl均购自上海麦克林生化科技有限公司, 且具有分析纯等级.
采用称重法配制一系列低温保护剂质量分数分别为0、5%、10%、15%、20%、30%、40%和50%的样品溶液, 共32份, 每种样品溶液中NaCl质量分数为定值(即0.9%).比如要配制100 g Me2SO(10)/NaCl(0.9)/H2O溶液(括号中的数字代表质量分数, 单位%, 下同), 可将10 g Me2SO和0.9 g NaCl溶于89.1 g蒸馏水中, 搅拌均匀.药品和试剂的称重采用赛多利斯BSA124S电子天平, 精度为±0.1 mg.
1.2 电导率测量电导率测量装置如图 1所示.电导率仪(型号DDSJ-308F, 量程0~199.9 mS/cm, 精度±0.5% (FS), 含一支铂黑电极)购自上海仪电科学仪器股份有限公司.样品溶液的温度采用控温精度为±0.1 ℃的干式恒温器(南京互川电子有限公司)控制, 保险起见, 采用精度为±0.1 ℃的铂电阻温度传感器对样品溶液温度进行实时监测.
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图 1 电导率测量装置 Fig. 1 Experimental setup for measurement of electrical conductivity |
采用电导率仪的平衡测量模式分别在5、15、25和35 ℃条件下对每种样品溶液测量3次, 取均值.平衡测量模式指的是一旦测量符合设定好的平衡条件(5 s内电导率测量值变化小于1%), 仪器即停止测量并给出结果.将电极插入样品溶液之前, 先对其进行预冷或预热以尽可能减小样品溶液的温度波动.每次测量结束, 均用蒸馏水清洗电极探头并用擦拭纸擦干, 以免污染后续样品.
在正式测量之前, 采用标准KCl溶液对电极进行校正, 并对上述测量方法的准确性进行检验.测量20 ℃时一系列NaCl溶液的电导率值, 并与文献值进行比较, 采用平均相对偏差(MRE)评价测量精度[26].
| $ {\rm{MRE}} = \frac{1}{N}\sum\limits_{i = 1}^N {\left| {\frac{{{\gamma _{\rm{M}}} - {\gamma _{\rm{L}}}}}{{{\gamma _{\rm{L}}}}} \times 100} \right|} . $ | (1) |
式中：γM和γL分别为电导率的测量值和文献值, N为比较的数据点数.结果如表 1所示, 表中，w(NaCl)为NaCl质量分数，温度20 ℃, 测量值与文献值[27]吻合良好(MRE=1.64%).
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表 1 氯化钠水溶液电导率测量值与文献值比较 Table 1 Comparison of the measured values of electrical conductivity with those from the literature for aqueous solutions of NaCl |
测量得到的电导率数据采用如下公式进行拟合:
| $ \gamma = {\gamma _0}exp\left( {\frac{B}{{T - {T_0}}}} \right)\left( {{C_0} + {C_1}w + {C_2}{w^2}} \right). $ | (2) |
式中：γ为电导率(mS/cm), T为热力学温度(K), w为低温保护剂的质量分数, γ0、B、T0、C0、C1和C2为待拟合系数.拟合采用Origin 9.0软件的自定义曲面函数拟合功能, 拟合优度评价指标为决定系数R2.通过求解式(2), 可得到计算溶液中低温保护剂质量分数的表达式.
1.4 电导率实时监测采用如图 2所示的装置对电导法实时监测溶液中低温保护剂浓度的可行性进行检验.采用一蠕动泵(型号BT101F, 保定雷弗流体科技有限公司)将高浓度的低温保护剂溶液以一定的速率泵至装有一定量NaCl(0.9)/H2O溶液的烧杯中, 并通过电磁搅拌使得溶液迅速混合均匀, 从而实现低温保护剂浓度的实时变化.混合后溶液的电导率采用前述电导率仪的连续测量模式进行实时监测, 溶液实时的电导率值和温度值通过计算机记录并保存.搅拌对电导率测量的影响通过测量同一种施加或不施加搅拌, 以及施加不同搅拌速率的溶液的电导率进行检验, 结果显示, 测量值之间无明显差异.
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图 2 电导法实时监测低温保护剂浓度实验装置示意图 Fig. 2 Schematic sketch of experimental setup for on-site monitoring of electrical conductivity |
烧杯中溶液实时的低温保护剂质量分数为
| $ {w_{\rm{t}}} = \frac{{ut{\rho _{\rm{h}}}{w_{\rm{h}}}}}{{{m_0} + ut{\rho _{\rm{h}}}}}. $ | (3) |
式中：m0为一开始烧杯中装有的NaCl(0.9)/H2O溶液的质量(g), u为蠕动泵输送高浓度低温保护剂溶液的流速(mL/min), t为时间(min), ρh为高浓度低温保护剂溶液的密度(g/mL), wh为高浓度低温保护剂溶液的质量分数.同时, 烧杯中溶液实时的低温保护剂质量分数也可通过将监测到的电导率和温度值待入式(2) 求解得到.
2 结果不同温度θ和低温保护剂质量分数下, 测量得到的4种低温保护剂溶液的电导率如图 3所示.采用式(2) 分别对每种低温保护剂溶液的电导率进行拟合, 拟合曲线如图 3所示, 拟合所得系数如表 2所示, 较高的R2>0.994值表明拟合效果优异.从图 3中可以看出, 4种低温保护剂溶液的电导率均随低温保护剂浓度的升高而减小, 随温度的升高而增大.而式(2) 对实验所得电导率数据优异的拟合效果表明, 电导率随低温保护剂浓度的变化符合二次多项式关系, 随温度的变化符合Vogel-Fulcher-Tammann(VFT)关系式.
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图 3 不同温度及质量分数下低温保护剂溶液电导率测量值及拟合曲线 Fig. 3 Measured electrical conductivity values (symbols) and equation fits (solid lines) for solutions of Me2SO/NaCl/H2O respectively, at various temperatures and mass fractions |
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表 2 拟合得到的公式系数值 Table 2 Fitted coefficients of equation (2) |
根据表 2所列系数, 求解式(2) 得到计算溶液中低温保护剂质量分数的表达式为
| $ w = \frac{{ - {C_1} - \sqrt {C_1^2 - 4{C_2}\left\{ {{C_0} - \gamma /\left[ {{\gamma _0}exp\left( { - \frac{B}{{T - {T_0}}}} \right)} \right]} \right\}} }}{{2{C_2}}} \times 100\% $ | (4) |
图 4给出了电导法实时监测溶液中EG质量分数w(EG)的实验结果, 实验条件为：m0=75 g、u=6 mL/min、wh=60%.从图中可以看出, 将监测到的电导率和温度值代入公式(4) 计算出的EG质量分数w(EG)与由式(3) 计算得到的EG质量分数吻合良好.计算过程中, EG(60)/NaCl(0.9)/H2O溶液的密度ρh近似用当时试验温度下EG(60)/H2O溶液的密度代替, 其值由EES软件(F-Chart Software)计算得到.同时也可以看到, 烧杯中溶液的温度并非一定值, 这是因溶液混合释放出混合热以及溶液与周围环境之间存在热交换导致的综合结果.溶液混合热的存在表明, 在监测电导率时, 温度也是一个需要同时关注的重要参数.
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图 4 电导法实时监测溶液中EG质量分数的实验结果 Fig. 4 Experimental results of on-site measurement of EG mass fraction in solution |
电导率是描述物质传输电流能力强弱的参数, 对于电解质溶液, 其电导率值相当于1 cm3的溶液在距离为1 cm的两电极间所具有的电导.通过溶液的电流是由不同离子的独立运动所完成的, 因此, 溶液的电导率γ是其中所有离子贡献的总和, 可表示如下[28]：
| $ \gamma = \sum\limits_i {{\gamma _i}} , $ | (5) |
| $ {\gamma _i} = F\left| {{z_i}} \right|{u_i}{c_i}, $ | (6) |
| $ {u_i} = \frac{{\left| {{z_i}} \right|e}}{{6\pi \eta {r_i}}}. $ | (7) |
式中：γi、ci、|zi|、ri和ui分别为离子i的电导率、浓度、所带电荷数、半径和淌度(mobility), e为电子的电量, η为溶液的黏度, F为法拉第常数.从式(5~7) 可以看出, 溶液的电导率与离子的浓度与性质有关：1) 离子的浓度越大, 电导率越大；2) 离子的价数越高, 电导率越大；3) 离子的迁移速度越快, 电导率越大.对于本文所研究的溶液体系, 离子主要为Na+和Cl-, 两者浓度相等, 且等于ρ/M, 其中ρ为溶液的密度, M为氯化钠的摩尔质量.因此, 式(5~7) 可简化为
| $ \gamma = \mathit{\Phi} \left( {\frac{\rho }{\eta }} \right). $ | (8) |
式中：Φ为所有常数项的集合.图 5给出了温度为25 ℃时Me2SO/H2O溶液的ρ、η和(ρ/η)随Me2SO质量分数w的变化关系, 以及Me2SO质量分数约为0.53时Me2SO/H2O溶液的ρ、η和ln(ρ/η)随温度的变化关系, 密度和黏度数据取自文献[29, 30].从图中可以看出, Me2SO/H2O溶液的密度随质量分数和温度的变化均呈线性关系, 黏度随质量分数和温度的变化分别符合二次多项式和VFT公式.因黏度的变化程度要远大于密度, 故(ρ/η)和ln(ρ/η)随质量分数和温度的变化由黏度主导.忽略质量分数为0.9%的NaCl对溶液密度和黏度的影响, 那么这也从理论上证明了采用公式(2) 拟合电导率测量数据的合理性.但要指出的是, Me2SO/H2O溶液和Me2SO/NaCl(0.85)/H2O溶液在全浓度范围内, 黏度均先增大后减小, 约在质量分数为65%~70%时出现峰值[31], 电导率是否也遵循这样的变化规律尚不确定.
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图 5 Me2SO/H2O溶液的物性分别随w和T的变化 Fig. 5 Roperties of solution Me2SO/H2O as function of w and T, respectively |
低温保护剂的加载和去除是低温保存生物样品的重要步骤, 相应的自动化设备已有研究报道[32-34].在此类设备中, 低温保护剂的浓度是一个需要实时监测与控制的重要参数, 电导法为实现这一目的提供了可能.
4 结论(1) 在温度为5~35 ℃和低温保护剂质量分数为0~50%的范围内，且NaCl质量分数为定值0.9%时，Me2SO/NaCl/H2O、GLY/NaCl/H2O、EG/NaCl/H2O和PG/NaCl/H2O溶液的电导率随低温保护剂质量分数的升高而减小，且符合二次多项式关系；随温度的升高而增大，且符合VFT关系式.
(2) 电导法实时监测NaCl质量分数为定值的三元低温保护剂溶液中低温保护剂的质量分数具备可行性.
本文采用的电导法与已有的诸如NMR、HPLC等低温保护剂定量分析方法形成了有效互补.电导法测量准确度高、所需设备便宜、操作简单快速，可实时监测的特性在一定程度上弥补了现有方法的不足，将为低温保护剂加载和去除过程的精准控制从而减小生物样品可能遭受的各种损伤带来便利.为了丰富和完善电导法在低温保存中的应用，还有一些问题值得深入研究，比如在更宽的温度范围内，特别是在低温下，低温保护剂溶液的电导率呈现出什么特性，电导法可否对成分复杂的低温保护剂溶液进行定量分析等.
| [1] | 华泽钊, 任禾盛. 低温生物医学技术[M]. 北京: 科学出版社, 1994: 1-14. |
| [2] | KAISER J. New prospects for putting organs on ice[J]. Science, 2002, 295(5557): 1015–1015. DOI:10.1126/science.295.5557.1015 |
| [3] | POLGE C, SMITH A U, PARKES A S. Revival of spermatozoa after vitrification and dehydration at low temperatures[J]. Nature, 1949, 164(4172): 666–666. DOI:10.1038/164666a0 |
| [4] | LOVELOCK J E, BISHOP M W H. Prevention of freezing damage to living cells by dimethyl sulphoxide[J]. Nature, 1959, 183(4672): 1394–1395. DOI:10.1038/1831394a0 |
| [5] | RALL W F, FAHY G M. Ice-free cryopreservation of mouse embryos at-196℃ by vitrification[J]. Nature, 1985, 313(6003): 573–575. DOI:10.1038/313573a0 |
| [6] | EROGLU A, RUSSO M J, BIEGANSKI R, et al. Intracellular trehalose improves the survival of cryopreserved mammalian cells[J]. Nature Biotechnology, 2000, 18(2): 163–167. DOI:10.1038/72608 |
| [7] | MAZUR P. Freezing of living cells: mechanisms and implications[J]. American Journal of Physiology, 1984, 247(3): C125–C142. |
| [8] | PEGG D E. The history and principles of cryopreservation[J]. Seminars in Reproductive Medicine, 2002, 20(1): 5–13. DOI:10.1055/s-2002-23515 |
| [9] | FULLER B J, BUSZA A L, PROCTOR E. Studies on cryoprotectant equilibration in the intact rat liver using nuclear magnetic resonance spectroscopy: a noninvasive method to assess distribution of dimethyl sulfoxide in tissues[J]. Cryobiology, 1989, 26(2): 112–118. DOI:10.1016/0011-2240(89)90040-0 |
| [10] | BATESON E A J, BUSZA A L, PEGG D E, et al. Permeation of rabbit common carotid arteries with dimethyl sulfoxide[J]. Cryobiology, 1994, 31(4): 393–397. DOI:10.1006/cryo.1994.1047 |
| [11] | MULDREW K, SYKES B, SCHACHAR N, et al. Permeation kinetics of dimethyl sulfoxide in articular cartilage[J]. CryoLetters, 1996, 17(6): 331–340. |
| [12] | PEGG D E. Cryobiology of cells in situ: experiments with ovine articular cartilage[J]. Cryobiology, 1998, 37(4): 381–381. |
| [13] | MUKHERJEE I N, LI Y, SONG Y C, et al. Cryoprotectant transport through articular cartilage for long-term storage: experimental and modeling studies[J]. Osteoarthritis and Cartilage, 2008, 16(11): 1379–1386. DOI:10.1016/j.joca.2008.03.027 |
| [14] | CARPENTER J F, DAWSON P E. Quantitation of dimethyl sulfoxide in solutions and tissues by high-performance liquid chromatography[J]. Cryobiology, 1991, 28(3): 210–215. DOI:10.1016/0011-2240(91)90025-J |
| [15] | HU J F, WOLFINBARGER L. Dimethyl solfoxide concentration in fresh and cryopreserved porcine valved conduit tissues[J]. Cryobiology, 1994, 31(5): 461–467. DOI:10.1006/cryo.1994.1056 |
| [16] | PEGG D E, WANG L H, VAUGHAN D, et al. Cryopreservation of articular cartilage. Part 2: mechanisms of cryoinjury[J]. Cryobiology, 2006, 52(3): 347–359. DOI:10.1016/j.cryobiol.2006.01.007 |
| [17] | 冯玉红. 现代仪器分析实用教程[M]. 北京: 北京大学出版社, 2008: 18-169. |
| [18] | SHARMA R, LAW G K, REHIEH K, et al. A novel method to measure cryoprotectant permeation into intact articular cartilage[J]. Cryobiology, 2007, 54(2): 196–203. DOI:10.1016/j.cryobiol.2007.01.006 |
| [19] | JOMHA N M, LAW G K, ABAZARI A, et al. Permeation of several cryoprotectant agents into porcine articular cartilage[J]. Cryobiology, 2009, 58(1): 110–114. DOI:10.1016/j.cryobiol.2008.11.004 |
| [20] | YU H, AI-ABBASI K K, ELLIOTT J A W, et al. Clinical efflux of cryoprotective agents from vitrified human articular cartilage[J]. Cryobiology, 2013, 66(2): 121–125. DOI:10.1016/j.cryobiol.2012.12.005 |
| [21] |
虞效益, 张绍志, 徐梦洁, 等. 二甲亚砜对关节软骨渗透性研究[J].
工程热物理学报, 2010, 31(8): 1363–1366.
YU Xiao-yi, ZHANG Shao-zhi, XU Meng-jie, et al. Study on the permeation of dimethyl sulfoxide into articular cartilage[J]. Journal of engineering thermophysics, 2010, 31(8): 1363–1366. |
| [22] | SWEENEY T E, BEUCHAT C A. Limitations of methods of osmometry: measuring the osmolality of biological-fluids[J]. American Journal of Physiology, 1993, 264(3): R469–R480. |
| [23] | ZHANG S Z, YU X Y, CHEN G M. Permeation of dimethyl sulfoxide into articular cartilage at subzero temperatures[J]. Journal of Zhejiang University-SCIENCE B, 2012, 13(3): 213–220. DOI:10.1631/jzus.B11a0041 |
| [24] |
虞效益. 低温保护剂处理关节软骨的若干问题研究[D]. 杭州: 浙江大学, 2013.
YU Xiao-yi. Study on several key issues related to cryoprotectant treatment of articular cartilage [D]. Hangzhou: Zhejiang Uniersity, 2013. http://cdmd.cnki.com.cn/Article/CDMD-10335-1013186855.htm |
| [25] | CHEN H H, ZHOU X M , SHU Z Q, et al. Electrical conductivity measurements for the ternary systems of glycerol/sodium chloride/water and ethylene glycol/sodium chloride/water and their applications in cryopreservation[J]. Biopreservation and biobanking, 2009, 7(1): 13–17. DOI:10.1089/bio.2009.0001 |
| [26] |
崔文顺, 李建玲. 就平均相对误差的算法与李庆振等商榷[J].
河北林学院学报, 1989, 4(4): 74–75.
CUI Weng-shun, LI Jian-ling. Discussions with LI Qing-zhen et al on the calculating method for mean relative error[J]. Journal of Hebei Forestry College, 1989, 4(4): 74–75. |
| [27] | QUIST A S, MARSHALL W L. Electrical conductance of aqueous sodium chloride solutions from 0 to 800° and at pressures to 4 000 bars[J]. The Journal of Physical Chemistry, 1968, 72(2): 684–703. DOI:10.1021/j100848a050 |
| [28] | BARD A J, FAULKNER L R. Electrochemical Methods: Fundamentals and Applications[M]. New York: John Wiley & Sons, Inc, 2000: 65-67. |
| [29] | SCHICHMA S A, AMEY R L. Viscosity and local liquid structure in dimethyl sulfoxide-water mixtures[J]. The Journal of Physical Chemistry, 1971, 75(1): 98–102. DOI:10.1021/j100671a017 |
| [30] | MRANDE M C, JULIA J A, GARCIA M, et al. On the density and viscosity of (water + dimethylsulphoxide) binary mixtures[J]. The Journal of Chemical Thermodynamics, 2007, 39: 1049–1056. DOI:10.1016/j.jct.2006.12.012 |
| [31] | ZHANG S Z, YU X Y, CHEN Z J, et al. Viscosities of the ternary solution dimethyl sulfoxide/water/sodium chloride at subzero temperatures and their application in cryopreservation[J]. Cryobiology, 2013, 66: 186–191. DOI:10.1016/j.cryobiol.2013.01.005 |
| [32] |
杨戈, 张绍志, 陈光明, 等. 新型低温保存装置性能的实验研究[J].
制冷学报, 2010, 31(2): 43–47.
YANG Ge, ZHANG Shao-zhi, CHEN Guang-ming, et al. Experimental study on characteristics of a new cryopreservation apparatus[J]. Journal of Refrigeration, 2010, 31(2): 43–47. |
| [33] | ZHOU X M, LIU Z, SHU Z Q, et al. A dilution-filtration system for removing cryoprotective agents[J]. Journal of Biomechanical Engineering, 2011, 133(2): 021007. DOI:10.1115/1.4003317 |
| [34] | KAY A G, HOYLAND J A H, ROONEY P, et al. A liquidus tracking approach to the cryopreservation of human cartilage allografts[J]. Cryobiology, 2015, 71(1): 77–84. DOI:10.1016/j.cryobiol.2015.05.005 |